抗高血壓肽IYPR的原核表達(dá)、純化與活性分析

1、抗高血壓肽IYPR的原核表達(dá)、純化與活性分析抗高血壓肽是一種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(AngiotensinI-ConvertingEnzyme,ACE抑制劑，通過抑制ACE的活性,調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)來(lái)起到降血壓的作用。它具有安全性高、效果專一無(wú)副作用、易被人體消化吸收、穩(wěn)定性好等特點(diǎn),廣泛受到患者的青睞。目前為止,抗高血壓肽的生產(chǎn)基本都是通過酶解法生產(chǎn)制備得到,但是酶解法分離純化工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低。為了找到簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的制備抗高血壓肽(簡(jiǎn)稱降血壓肽)的方法,給新型降血壓產(chǎn)品的生產(chǎn)研究提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù),本課題的研究目的是構(gòu)建表達(dá)降血壓肽IYPR(Ile-Tyr-Pro-Ar

2、g)的基因工程菌,并對(duì)該菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化表達(dá)產(chǎn)物、分析產(chǎn)物的生物活性和穩(wěn)定性等,并研究超聲法對(duì)工程菌的生長(zhǎng)和重組蛋白表達(dá)的影響,主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.根據(jù)IYPR的氨基酸序列和大腸埃希桿菌(Escherichiacoli,E.coli,又稱大腸桿菌)BL21(DE3)偏愛的密碼子，人工設(shè)計(jì)并合成了目的基因序列，該基因序列與載體通過酶切、目的序列回收和連接等步驟,構(gòu)建了表達(dá)載體pET-30a(+)-IR,然后將該載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中,從轉(zhuǎn)化的平板中篩選出陽(yáng)性重組子,該重組子經(jīng)過菌落PC蝶定和基因測(cè)序，結(jié)果顯示構(gòu)建的基因工程菌中的目的基因符合設(shè)計(jì)要求,無(wú)移碼和錯(cuò)碼。2 .將構(gòu)建的基因

3、工程菌利用異內(nèi)基-B-D-硫代半乳糖甘(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并研究不同IPTG濃度、不同誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)基組成和外源添加物對(duì)表達(dá)效果的影響,利用Tricine-SDS-PAGE電泳對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果顯示,與未進(jìn)行誘導(dǎo)的菌株相比，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的工程菌在分子量大小約8.0kDa左右有明顯的蛋白表達(dá),且這一蛋白分子量大小與設(shè)計(jì)的分子量大小吻合。在選用的五種培養(yǎng)細(xì)菌的常用培養(yǎng)基LB、TB SOC SOBR 2XYT中，通過誘發(fā)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),LB液體培養(yǎng)基是最好的,在LB中添加5mmol/LEDTA1%8萄糖、5mmol/LCa2+和5mmol/LMg2+等對(duì)重組蛋白的表達(dá)沒有起到任何促進(jìn)作

4、用。最佳的IPTG濃度為0.6mmol/L,37C誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為9h,此時(shí)重組蛋白的表達(dá)量占總蛋白量的29%。3 .研究了降血壓肽IYPR的分離純化過程,發(fā)酵得到的培養(yǎng)液經(jīng)過離心、超聲破碎和洗滌后得到包涵體蛋白,該蛋白經(jīng)過鎳柱親和層析、腸激酶酶切、透析法去標(biāo)簽、胰蛋白酶酶切和SephadexG-15凝膠過濾純化后，得到的產(chǎn)物經(jīng)電噴霧電離質(zhì)譜分析證實(shí)了分離得到的產(chǎn)物分子量為548.23Da,氨基酸序列為Ile-Tyr-Pro-Arg。4.生產(chǎn)加工過程中的溫度、pH變化及體內(nèi)外消化酶酶解環(huán)境是否影響重組降血壓肽IYPR的活性,對(duì)于了解其應(yīng)用性十分重要。采用FAPG血管緊張素I模擬物的分光光度法測(cè)定

5、了IYPR的體外ACEW制活性,并對(duì)其熱穩(wěn)定性、耐酸堿性、抗腸道酶解能力和抑制動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了研究。結(jié)果得到，重組IYPR的IC50值為61mg/L,具有較好的熱穩(wěn)定性，當(dāng)90c處理1h時(shí),其抑制活性為原來(lái)的98%,且在酸性、中性和弱堿性（pH2至10）條件下都很穩(wěn)定，經(jīng)過胃蛋白酶消化后，IYPR的ACEM制活性升高了13.0%,而經(jīng)過胰蛋白酶消化后,其活性基本沒有變化。Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法得到IYPR的抑制動(dòng)力學(xué)模式為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。5.采用不同劑量的重組降血壓肽對(duì)原發(fā)性高血壓大鼠（SHR）進(jìn)行一次性灌胃和連續(xù)35天灌胃試驗(yàn),測(cè)定大鼠尾部的收縮壓（SBP）,并分析灌胃結(jié)束后

6、血清中膽固醇、甘油三酯和葡萄糖的含量及全血的相關(guān)血液學(xué)指標(biāo)。結(jié)果顯示，利用400叱g/kg和1000叱g/kg的重組降血壓肽對(duì)SHFfi行一次性灌胃后,大鼠的尾部收縮壓明顯降低(P<0.05),且降壓活性維持時(shí)間大于8h,當(dāng)灌胃劑量為400g/kg時(shí)，灌胃后4h血壓降幅最大為50mmHg(P<0.01)。用400g/kg的重組降血壓肽分別對(duì)SH歡鼠和正常SD大鼠進(jìn)行連續(xù)35天灌胃,SHR大鼠的血壓一直較對(duì)照組低(P<0.05),而正常大鼠的血壓沒有明顯變化。在灌胃后的第3周，重組降血壓肽使SHRfc鼠血壓降低了44mmHg,效果優(yōu)于高于該劑量500倍劑

7、量為200mg/kg條斑紫菜降血壓肽、與高于該劑量75倍劑量為30mg/kg的卡托普利效果比較接近,但重組降血壓肽降血壓效果的穩(wěn)定性顯著優(yōu)于卡托普利。灌胃結(jié)束后重組降血壓肽組的SH戲鼠和SD大鼠血清中膽固醇、甘油三酯和葡萄糖的含量及全血的相關(guān)血液學(xué)指標(biāo),較對(duì)照組均沒有顯著性變化(P>0.05)。將心、肝、腎組織進(jìn)行石蠟切片、蘇木精-伊紅(HE)染色后顯微鏡觀察,結(jié)果顯示,對(duì)照組和試驗(yàn)組的大鼠的相關(guān)組織結(jié)構(gòu)沒有明顯差異。6.不同生長(zhǎng)階段的工程菌被低強(qiáng)度超聲波處理一定時(shí)間后,采用分光光度法測(cè)定其生長(zhǎng)速度、Tricine-SDS-PAGE法檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,掃頻超聲對(duì)工程菌生長(zhǎng)的促進(jìn)效果優(yōu)于定頻,利用掃頻頻率為28±2kHz的超聲波在時(shí)期1對(duì)工程菌處理30min后能明顯促進(jìn)其生長(zhǎng),而此時(shí)超聲處理5、30和60min對(duì)重組蛋白的表達(dá)均沒有明顯影響。在生長(zhǎng)密度達(dá)到OD600=1.0(時(shí)期2)時(shí)超聲對(duì)菌株生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)都具有抑制作用，而在工程菌受到IPTG的誘導(dǎo)2h后(時(shí)期3)超聲處理不同時(shí)間，工程菌的生長(zhǎng)和蛋白的表達(dá)量沒有明顯變化。利用Fura-2/AM熒光法測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞的鈣離子濃度,結(jié)果顯示