液_液雙水相萃取分離_淀粉酶研究

1、第29卷第4期2000年8月貴州工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版JOURNAL OF GU IZHOU UN IV ERSIT Y OF TECHNOLO GY(Natural Science EditionVol.29No.4August.2000文章編號(hào):100920193(20000420083205液液雙水相萃取分離淀粉酶研究邱樹毅(貴州工業(yè)大學(xué)輕工系,貴州貴陽550003摘要:研究了PEG/磷酸鹽雙水相系統(tǒng)分離純化-淀粉酶的工藝,對(duì)PEG分子量、p H、相濃度、NaCl濃度、酶濃度等影響因素進(jìn)行了研究。關(guān)鍵詞:液-液雙水相;分離;萃取;-淀粉酶;PEG;磷酸鹽中圖分類號(hào):TQ92511;TQ

2、02814文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A0前言雙水相萃取技術(shù)是分離純化蛋白質(zhì)混合物等生物大分子的有效方法。雙水相系統(tǒng)通常是由水溶性的兩種聚合物組成或一種水溶性聚合物與一種鹽組成,與一般分離純化技術(shù)相比,雙水相技術(shù)具有處理容量大、能耗低、易連續(xù)化操作和工程放大等優(yōu)點(diǎn),在蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離純化等方面受到廣泛重視,是一種有發(fā)展?jié)摿Φ囊子诠I(yè)化應(yīng)用的生物分離技術(shù)1。生物大分子在雙水相上相和下相的濃度比被定義為分配系數(shù)(K=Ct/Cb。在雙水相系統(tǒng)中有許多因素影響分配系數(shù),包括系統(tǒng)本身的因素如系統(tǒng)組成、聚合物分子量、聚合物濃度、鹽和離子強(qiáng)度、p H等,以及目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)如疏水作用、電荷、分子量等,盡管目

3、前對(duì)聚合物溶液熱力學(xué)引起的生物大分子在兩相間不規(guī)則擴(kuò)散的機(jī)理還不清楚,還沒有相應(yīng)的理論指導(dǎo)設(shè)計(jì)特定蛋白質(zhì)和生物大分子的分配系統(tǒng),但是利用雙水相技術(shù),通過大量實(shí)驗(yàn)研究,是可以獲得特定蛋白質(zhì)和生物大分子的最適宜分離的相系統(tǒng)和最優(yōu)分配的2。-淀粉酶是廣泛應(yīng)用的生物酶類,B.S ubtilis細(xì)菌-淀粉酶是研究和應(yīng)用較多的-淀粉酶,其分子量為48000道爾頓,PI約為5,最適p H5.3- 6.4,在p H4.8-8.5之間穩(wěn)定3。實(shí)驗(yàn)研究了-淀粉酶在聚乙二醇(PEG/磷酸鹽雙水相系統(tǒng)中的分配,對(duì)PEG分子量、PEG濃度、p H、添加NaCl和酶濃度等因素對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響進(jìn)行了研究。1材料和方

4、法1.1材料PEG:分子量為400,1000,4000和6000,進(jìn)口分裝。-淀粉酶:貴州啤酒廠提供。收稿日期:2000203220基金項(xiàng)目:貴州省自然科學(xué)基金(黔基合計(jì)字198號(hào)其他試劑均為市售分析純。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1PEG /磷酸鹽雙水相系統(tǒng)相圖將不同分子量的PEG 和無機(jī)鹽制成一定濃度原液,準(zhǔn)確稱量一定量PEG 原液,加入試管中,然后加入無機(jī)鹽原液,混合,直至試管開始出現(xiàn)混濁為止,稱量加入無機(jī)鹽量,算出PEG 和無機(jī)鹽在系統(tǒng)中的重量百分濃度,再加入適量水,使體系變澄清,計(jì)量加入的水,并繼續(xù)加入無機(jī)鹽,使系統(tǒng)再次變混濁,如此反復(fù)操作,計(jì)算達(dá)到混濁時(shí)PEG 和無機(jī)鹽在系統(tǒng)中的重量百分

5、含量,得出PEG 和磷酸鹽的雙節(jié)線相圖(圖1。圖1PEG -K 3PO 4雙水相相圖1.2.2雙水相萃取分配平衡實(shí)驗(yàn)相系統(tǒng)用原液冰箱放置,使用時(shí)所有原液先在20平衡后,計(jì)算相應(yīng)量后加入,磷酸鹽原液含有K 2HPO 4和NaH 2PO 4混合液,以調(diào)節(jié)到最適p H 。在系統(tǒng)組成混合好后,用低速離心機(jī)加速相分離,相體積比R (R =V t/V b 用離心刻度試管測定,上、下相樣品中分別分析酶活力,實(shí)驗(yàn)在20條件下進(jìn)行。1.2.3-淀粉酶活性的測定參照文獻(xiàn)4的方法進(jìn)行。2結(jié)果與討論2.1PEG 分子量對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響表1給出了-淀粉酶在PEG /磷酸鹽系統(tǒng)的分配系數(shù)。分配系數(shù)受PEG 分子量

6、影響較大,-淀粉酶的分配系數(shù)隨PEG 分子量的增加而降低,在低PEG 時(shí),-淀粉酶的分配系數(shù)高,-淀粉酶主要集中在上相;而隨著PEG 分子量的增加,分配系數(shù)K 值降低,甚至-淀粉酶分配到下相。其主要原因可能是隨著PEG 分子量的增加,其端基數(shù)目減少,疏水性增加,而-淀粉酶是疏水蛋白分子,故主要向下相集中。在PEG /葡聚糖系統(tǒng)中其他蛋白的分離純化亦有類似現(xiàn)象5。由于小分子量的PEG 選擇性差,雜蛋白質(zhì)分離能力低6,不適合作進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)選用PEG 4000作為研究對(duì)象。表1-淀粉酶在PEG /磷酸鹽系統(tǒng)的分配系數(shù)系統(tǒng)K PEG 400(13.2%w /w 磷酸鹽(16.8%w /w 20.4

7、2PEG 1000(11.5%w /w 磷酸鹽(13.4%w /w 17.62PEG 4000(10%w /w 磷酸鹽(11.5%w /w 1.75PEG 6000(7.5%w /w 磷酸鹽(10%w /w 0.352.2相濃度對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響相圖中的系線長度是由相組成的總濃度決定的,在臨界點(diǎn)附近,系線長度趨向于零,上相和下相的組成相同,因此,分配系數(shù)應(yīng)為1。隨著PEG 和成相鹽濃度增大,系線長度增加,上相和下相相對(duì)組成的差別就增加,酶在兩相中的分配系數(shù)會(huì)受到極大的影響。實(shí)驗(yàn)研究了48貴州工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版2000年P(guān)EG 濃度變化對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響,所得結(jié)果見圖2。圖2P

8、EG 濃度對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響在磷酸鹽濃度固定不變條件下,改變PEG 濃度,對(duì)-淀粉酶的分配系數(shù)影響較大。PEG 濃度增加,有利于酶在上相的分配,在20%(w /w PEG濃度時(shí),分配系數(shù)達(dá)到最大,繼續(xù)增加PEG 濃度,-淀粉酶的分配系數(shù)略有下降。實(shí)驗(yàn)對(duì)磷酸鹽濃度對(duì)-淀粉酶的分配系數(shù)亦進(jìn)行了研究,增加磷酸鹽濃度,-淀粉酶的分配系數(shù)增加,這主要是由于磷酸鹽的鹽析作用影響所致;當(dāng)鹽濃度過高時(shí),酶蛋白因鹽析作用過強(qiáng)而沉淀,因此一般取鹽濃度在12%(w /w 左右為宜。2.3pH 對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響表2給出了p H 變化對(duì)PEG /磷酸鹽雙水相中-淀粉酶的分配系數(shù)的影響。表2pH 對(duì)-淀粉酶

9、在PEG /磷酸鹽雙水相中分配系數(shù)的影響3p H 33K 7.11.757.8 3.653:體系為PEG 4000(10%w /w /磷酸鹽(11.5%w /w 33:p H 變化通過調(diào)節(jié)H 2PO 4-和HPO 42-緩沖液實(shí)現(xiàn)隨著p H 值增加,-淀粉酶的分配系數(shù)增加,分配系數(shù)隨p H 增加而增加的現(xiàn)象在雙水相萃取技術(shù)分離其他蛋白質(zhì)中亦有觀察到7。分配系數(shù)的改變是因?yàn)槟繕?biāo)蛋白質(zhì)電荷的變化引起,其原因是帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)更優(yōu)先選擇上相,而帶正電荷的蛋白質(zhì)通常分配到下相8,-淀粉酶的等電點(diǎn)PI 約為5,在較高p H 時(shí),蛋白質(zhì)電荷呈負(fù)電性,-淀粉酶和PEG 分

10、子之間的作用增強(qiáng),故-淀粉酶的分配系數(shù)增加。2.4N aCl 濃度對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響在雙水相體系中離子強(qiáng)度對(duì)目標(biāo)蛋白的分配系數(shù)有較大影響。實(shí)驗(yàn)研究了在相組成為PEG 4000(15%w /w 磷酸鹽(10%w /w 時(shí),改變NaCl 濃度,對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響,所得結(jié)果見圖3。實(shí)驗(yàn)表明,在較低NaCl 濃度時(shí),-淀粉酶的分配系數(shù)隨NaCl 濃度增加而減小,在1%w /w NaCl 時(shí)達(dá)到最低,繼續(xù)增加NaCl 濃度,-淀粉酶的分配系數(shù)隨NaCl 濃度增加而增加,在7.8%w /w 時(shí)達(dá)到最大。繼續(xù)增加NaCl 濃度,-淀粉酶的分配系數(shù)又趨下降。這是由于Na +和Cl -在兩相分配情況

11、不同,從而引起兩相電位差的變化所致9。2.5酶濃度對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響酶濃度在雙水相分配中是一個(gè)重要的影響因素。一般來說,只有在蛋白質(zhì)濃度較低時(shí),才可能出現(xiàn)純粹的分配行為,隨著蛋白質(zhì)濃度增加,蛋白質(zhì)的溶解度限制和出現(xiàn)飽和,純粹的分58第4期邱樹毅:液-液雙水相萃取分離-淀粉酶研究圖3Nacl 濃度對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響配行為就出現(xiàn)偏差。因此在研究目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化時(shí),不能只考慮分配系數(shù),還要考慮回收率。回收率定義為酶提純的質(zhì)量與總酶質(zhì)量之比Y (Y =M 酶/M 總。表3酶濃度對(duì)-淀粉酶分配系數(shù)的影響酶濃度ku/mlK 回收率(%1.07.2599.95.512.5

12、89.611.217.872.4表3給出了PEG /磷酸鹽系統(tǒng)中添加3%w /w NaCl 時(shí)的-淀粉酶的分離純化。在較低酶濃度下,-淀粉酶的分配系數(shù)近似于常數(shù),但回收率較高,隨著-淀粉酶酶濃度的增加,分配系數(shù)K 值提高,但酶的回收率下降。因此,選擇合適的酶濃度在雙水相分離純化生物大分子時(shí)是重要的,這樣既可得到較高的分配系數(shù),又可獲得高的回收率。3結(jié)論對(duì)B.S ubtilis 細(xì)菌-淀粉酶在PEG /磷酸鹽雙水相中的分離純化進(jìn)行了研究,認(rèn)為:-淀粉酶的分配系數(shù)在PEG /磷酸鹽雙水相中受PEG 分子量和PEG 濃度的影響,分子量低,分配系數(shù)高,但低分子量則對(duì)目標(biāo)蛋白的選擇性差。PEG 濃度增加

13、有利于酶富集到上相。p H 對(duì)-淀粉酶的分配有重要影響,隨p H 增加,-淀粉酶的分配系數(shù)增加。添加NaCl 可大大影響-淀粉酶在PEG /磷酸鹽中的分配系數(shù)。-淀粉酶的分配系數(shù)在低濃度時(shí)接近常數(shù),隨酶濃度增加,分配系數(shù)增加。但酶的回收率下降。參考文獻(xiàn):1P A Albertsson.Partition of cells and Macromolecules 3rd M .New Y ork :John Wiley and S ons ,1986.2J N Baskir ,T A Hatton and U W Suter.Protein Partitioning in Two -Phase A

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18、ase systemswas investigated.The effects of the weights and concentrations of polyethyleneglycol ,p H ,the concentrations of NaCl and enzyme concetration on the partitioncoefficient K was studied.K ey w ords :aqueous two -phase ;partition ;extrace ;-amylase ;PEG;phosphate(本文責(zé)編:周曉南(上接51頁4S Limyingcharoen.Fuzzy logic based unified power slow controllers for transient stability improvement J .IEEProce