“電針調(diào)節(jié)Noggin表達(dá)對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中海馬神經(jīng)發(fā)生的

1、“電針調(diào)節(jié)Noggin表達(dá)對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中海馬神經(jīng)發(fā)生的影響”申請(qǐng)書(shū)正文1、項(xiàng)目研究意義隨著人類(lèi)社會(huì)進(jìn)入21世紀(jì)，人口老齡化更加明顯，老年期癡呆成為一個(gè)嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題，而受到世界各國(guó)的關(guān)注。在我國(guó)，血管性癡呆是老年期癡呆的主要類(lèi)型之一，且其發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由腦血管因素導(dǎo)致腦組織損害引起的智能及認(rèn)知功能障礙的臨床綜合征。研究顯示1，約25的腦卒中患者伴有程度不等的智能障礙，嚴(yán)重者不僅影響患者的生存質(zhì)量，而且增加了社會(huì)和家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。海馬是目前公認(rèn)與學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)神經(jīng)功能活動(dòng)具有密切關(guān)系的重要腦區(qū)，而海馬最受缺血低氧

2、的損害造成神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的異常改變，成為癡呆等疾病的主要病理基礎(chǔ)。新近研究表明，新生及成年哺乳動(dòng)物與人的海馬區(qū)域存在著神經(jīng)發(fā)生（神經(jīng)干細(xì)胞，neural stem cell，NSC），為人們深入研究海馬功能及防治缺血性神經(jīng)疾病提供了新的研究途徑。血管性癡呆是迄今為止唯一可以預(yù)防的癡呆類(lèi)型，早期積極預(yù)防治療具有可逆性。采用針灸促進(jìn)海馬內(nèi)神經(jīng)發(fā)生向神經(jīng)元方向分化并在腦組織內(nèi)整合，對(duì)海馬神經(jīng)可塑性進(jìn)行調(diào)節(jié)，改善學(xué)習(xí)記憶功能，無(wú)疑對(duì)VD的基礎(chǔ)與臨床研究具有重大意義。干細(xì)胞是當(dāng)前生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，Science將干細(xì)胞研究評(píng)為21世紀(jì)最重要的十項(xiàng)研究領(lǐng)域之首，為世人矚目。正是因?yàn)楦杉?xì)胞的特殊科學(xué)意義及

3、其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用前景，世界各國(guó)對(duì)此都投入大量的人力、財(cái)力進(jìn)行有關(guān)基礎(chǔ)和應(yīng)用的研究。隨著我省經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平的提高，老年人口不斷增加，而老年期癡呆、腦血管病等重大疾病也因之而增多。從新的思路研究這些疾病的發(fā)病機(jī)理和探索有效治療方法，勢(shì)必為提高我省人口健康水平有積極的促進(jìn)作用。本項(xiàng)目的研究也正是基于理念而申請(qǐng)的立項(xiàng)的。2、項(xiàng)目研究目標(biāo)及與申請(qǐng)者研究工作長(zhǎng)期目標(biāo)的關(guān)系2.1 研究目標(biāo)開(kāi)展對(duì)實(shí)驗(yàn)性VD大鼠的發(fā)病機(jī)理研究，證實(shí)海馬的神經(jīng)發(fā)生障礙是血管性癡呆的病理基礎(chǔ)。進(jìn)行電針對(duì)擬VD大鼠的治療觀察，在肯定療效的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究理論與技術(shù)，深入探討針灸治療血管性癡呆的海馬神經(jīng)發(fā)生作用機(jī)制

4、。2.2 與申請(qǐng)者研究工作長(zhǎng)期目標(biāo)的關(guān)系申請(qǐng)者長(zhǎng)期從事針灸治療缺血性腦血管疾病的臨床與作用機(jī)制研究，特別是對(duì)針刺治療缺血性腦血管病的臨床與實(shí)驗(yàn)有較深入的研究。申請(qǐng)者設(shè)計(jì)并實(shí)施完成2003年度廣東省自然科學(xué)基金“電針對(duì)局灶性腦缺血大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞影響的研究”（No.31458，排名第二）；參與完成國(guó)家自然科學(xué)基金“針刺對(duì)局灶性腦缺血后突觸可塑性促進(jìn)作用的研究”（No.30271644，排名第五）和國(guó)家中醫(yī)藥管理局科研基金“針刺調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)缺血后腦可塑性促進(jìn)作用的研究”（No.02-03JP36，排名第五）等項(xiàng)目。這為開(kāi)展本項(xiàng)目的研究在相關(guān)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)等方面提供了有力的支持。在上述研究

5、基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目擬通過(guò)電針調(diào)節(jié)神經(jīng)誘導(dǎo)因子Noggin基因的表達(dá)以調(diào)控VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生機(jī)制，探討針灸治療VD的作用機(jī)理，為探索新的臨床治療方法、提高療效，提供具有指導(dǎo)價(jià)值的科學(xué)依據(jù)。3、項(xiàng)目研究?jī)?nèi)容，研究方案和進(jìn)度安排3.1 研究?jī)?nèi)容本項(xiàng)目從中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)的角度，研究針刺治療VD的海馬神經(jīng)發(fā)生機(jī)制，從調(diào)節(jié)腦與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)的神經(jīng)誘導(dǎo)因子Noggin基因的表達(dá)為切入點(diǎn)，觀察VD及電針治療時(shí)海馬神經(jīng)發(fā)生的變化規(guī)律，新生神經(jīng)細(xì)胞的增殖、遷移與分化，結(jié)合相應(yīng)神經(jīng)行為學(xué)的改變應(yīng)用透射電鏡從體視學(xué)角度證實(shí)其功能性突觸的重建，探討Noggin等在治療VD時(shí)對(duì)神經(jīng)發(fā)生的影響作用。旨在闡明針灸治療VD的神經(jīng)

6、生物學(xué)作用機(jī)制，為針灸治療缺血性腦血管疾病提供科學(xué)依據(jù)。具體如下：1）觀察VD大鼠造模后Noggin基因的表達(dá)情況，海馬神經(jīng)細(xì)胞丟失及病理形態(tài)學(xué)變化情況及齒狀回（DG）神經(jīng)發(fā)生的規(guī)律，電針治療后三者的變化情況：a造模后不同時(shí)相Noggin的表達(dá)情況及電針干預(yù)后的變化；b造模后不同時(shí)相海馬神經(jīng)細(xì)胞丟失的情況與VD大鼠神經(jīng)行為學(xué)及齒狀回LTP之間的關(guān)系；c造模后不同時(shí)相海馬齒狀回（DG）新生神經(jīng)細(xì)胞的變化規(guī)律及電針干預(yù)對(duì)其影響；d造模及電針干預(yù)不同時(shí)相上VD大鼠神經(jīng)行為的變化及LTP的誘導(dǎo)情況。2）在上述研究工作的基礎(chǔ)上，分析電針治療VD的可能的作用機(jī)制：a研究腦與神經(jīng)發(fā)育的神經(jīng)誘導(dǎo)因子Noggi

7、n與海馬神經(jīng)發(fā)生（增殖、遷移、分化及功能性突觸的形成）的關(guān)系；b研究大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生情況與VD神經(jīng)行為學(xué)及CA3神經(jīng)突觸重建情況的內(nèi)在關(guān)系；c證實(shí)電針治療VD大鼠的機(jī)制是否通過(guò)影響海馬神經(jīng)發(fā)生而發(fā)揮作用。3.2 研究方案動(dòng)物模型健康雄性老齡SD大鼠（1215個(gè)月），體重350500g。經(jīng)Y-迷宮訓(xùn)練篩選后選擇學(xué)習(xí)記憶成績(jī)合格大鼠，按照Ohta等方法（Ohta H, et al. Brain Res, 1994; 653(1):231-234）永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈制作2-VO慢性腦灌注不足的擬VD模型。根據(jù)研究要求進(jìn)行動(dòng)物隨機(jī)分組。部分動(dòng)物進(jìn)行假手術(shù)，用于對(duì)照研究。治療與干預(yù)方法電針干預(yù)：采用

8、督脈腧穴百會(huì)、大椎，采用毫針（1寸，30）針刺接通電針治療儀（G6805型）給予疏密波刺激（刺激參數(shù)：電流強(qiáng)度1mA，頻率：515Hz/s，時(shí)間：20min）。部分實(shí)驗(yàn)中采用軀干背部肌肉豐厚處非穴點(diǎn)進(jìn)行對(duì)照，以觀察穴位的相對(duì)特異性；在動(dòng)物造模后，每日電針治療1次，分別連續(xù)給予治療3d、1w、2w、3w、4w及8w。陽(yáng)性藥物對(duì)照（對(duì)部分VD模型進(jìn)行對(duì)照）：改善腦循環(huán)藥物：尼莫地平（12mg/kg，灌胃）。在動(dòng)物造模后每日給藥1次，分別連續(xù)給藥3d、1w、2w、3w、4w及8w。Noggin反義mRNA側(cè)腦室注射：以烏拉坦腹腔麻醉大鼠固定于腦立體定位儀上，根據(jù)Pellegrino圖譜，于側(cè)腦室（A

9、P:1.0, L: 1.5, H: 3.0）埋置不銹鋼導(dǎo)管（外徑0.7 mm，內(nèi)徑0.4 mm），以牙托粉固定于顱骨上，術(shù)后3 d 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行側(cè)腦室內(nèi)注射時(shí)，將清醒大鼠固定于敞式裝置上，在埋植的導(dǎo)管內(nèi)插入注射內(nèi)管，其下端超出套管0.5mm，另一端經(jīng)塑料管與微量進(jìn)樣器連接，取反義寡核苷酸20µg/d（上海生工合成），按組別不同時(shí)間每日一次連續(xù)注射，每次注射時(shí)間不少于2 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，注入2 %滂胺天藍(lán)（ Pontamine sky blue），核對(duì)給藥部位。指標(biāo)檢測(cè)與關(guān)鍵技術(shù)說(shuō)明神經(jīng)行為學(xué)觀察：aY型電迷宮檢查：用MG-2Y型電迷宮（刺激電壓：50V，延遲2s）篩選成績(jī)合格動(dòng)

10、物。bMorris水迷宮檢查：實(shí)驗(yàn)包括：定位航行實(shí)驗(yàn)：觀察記錄逃避潛伏期和游泳路徑（搜索策略）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：觀察規(guī)定時(shí)間內(nèi)大鼠在池中的游泳路徑（搜索策略）。腦組織取材：根據(jù)檢測(cè)內(nèi)容的不同，分別采用斷頭處死取腦和經(jīng)心灌注固定取腦，HE及Nissl染色采用石蠟包埋切片，組化染色及原位雜交采用冰凍切片。原位雜交觀測(cè)Noggin 在大鼠腦內(nèi)的表達(dá)與分布：參照文獻(xiàn)（蔡文琴，等實(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)與核酸分子雜交技術(shù)四川科學(xué)技術(shù)出版社，1994354-432）采用漂浮法進(jìn)行Noggin mRNA 原位雜交組織化學(xué)染色（Noggin 基因的cRNA 核酸探針，購(gòu)自華美生物制劑公司；地高辛標(biāo)記試劑盒抗地高辛抗體、

11、堿性磷酸酶顯色劑NBT/ BCIP均購(gòu)自Rhoe 公司）。步驟簡(jiǎn)述：胃蛋白酶K37孵育、地高辛標(biāo)記的探針42反應(yīng)，堿性磷酸酶標(biāo)記抗地高辛抗體孵育，用NBT/BCIP顯色，脫水、裱片、DPX封片。RT-PCR半定量檢測(cè)Noggin的表達(dá)：分別取各組大鼠5只。海馬總RNA提取按文獻(xiàn)方法（Sambrook J, et al. Molecular cloning, a laboratory manualM. NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press USA,1989.343-362）進(jìn)行。PCR上、下游引物，通過(guò)網(wǎng)站（www.genome.wi. mit

12、.edu）提供的引物設(shè)計(jì)程序（Primer 3.0）設(shè)計(jì)。反應(yīng)液經(jīng)96.63min 預(yù)變性后，9460s、5560s、7260s循環(huán)30 次，反應(yīng)產(chǎn)物置2瓊脂糖凝膠電泳，攝片，掃描半定量分析。免疫組化等方法觀察海馬神經(jīng)發(fā)生情況：aBrdU標(biāo)記方法：在大鼠處死的前3天開(kāi)始，進(jìn)行BrdU腹腔注射50mg/kg，每12h一次，連續(xù)注射4次，在最后一次注射后24h處死，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。bBrdU組化染色前切片中DNA解鏈和變性的預(yù)處理：50formamide（甲酰胺）/2×SSC中，置于64孵育箱，30min，入2N HCl中，37孵育30min，其余漂洗過(guò)程略。cBrdU免疫組化染色方法

13、觀察海馬細(xì)胞增殖情況：參照Okano等的方法（Okano HJ, et al. Dev Neurosci, 1996, 18: 199- 209）及BrdU（2351，Sigma公司）染色說(shuō)明書(shū)方法加以改進(jìn)，采用ABC法進(jìn)行BrdU免疫組化漂浮染色。d免疫熒光雙重標(biāo)記及熒光顯微鏡觀察海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖遷移、分化及與Noggin受體共表達(dá)情況：用雞尾酒法染色，首先切片與小鼠抗BrdU單克隆抗體孵育，繼之用Cy3標(biāo)記的羊抗鼠抗體處理；入兔抗GFAP（Sigma公司）或兔抗TuJl（Sigma公司）、兔抗Noggin受體抗體（Lab Vision公司）孵育，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔抗體孵育，甘油封片，

14、熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)、拍照成像。HE染色及Nissl染色觀測(cè)海馬病理形態(tài)及神經(jīng)元丟失情況。透射電鏡（突觸體視學(xué)）觀察海馬CA3區(qū)神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)變化及電針對(duì)其影響：按照Freddari方法（Freddari B, et al. Brain Res, 1993;628:193），計(jì)算突觸的數(shù)量和突觸連接帶與測(cè)試線的交點(diǎn)數(shù)，定量分析突觸的突觸數(shù)密度；再以XY-生物圖像分析儀對(duì)突觸界面曲率、突觸后致密物質(zhì)等進(jìn)行定量分析。機(jī)制探討觀察電針對(duì)VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響a在模型建立后及電針干預(yù)的不同時(shí)相分別給予BrdU在體標(biāo)記增殖細(xì)胞，采用免疫組化染色法觀測(cè)電針對(duì)海馬神經(jīng)發(fā)生的全過(guò)程影響。b用BrdU + P

15、SA-NCAM（多聚唾液酸化神經(jīng)細(xì)胞黏附因子）對(duì)增殖細(xì)胞進(jìn)行免疫雙重?zé)晒鈽?biāo)記，采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察電針對(duì)增殖細(xì)胞的遷移和突觸形成的影響。c用BrdU + GFAP（GFAP，膠質(zhì)纖維酸性蛋白，膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物），BrdU + TuJ1（-tubulin，早期未成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物）或NeuN（神經(jīng)細(xì)胞核抗原，成熟神經(jīng)元標(biāo)記物）對(duì)增殖細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光雙重標(biāo)記，采用熒光顯微鏡觀察電針對(duì)增殖細(xì)胞分化的影響。通過(guò)側(cè)腦室注射外源性Noggin mRNA反義寡核苷酸或Noggin因子受體抗體，觀察神經(jīng)發(fā)育誘導(dǎo)因子在電針治療VD中對(duì)海馬神經(jīng)發(fā)生的影響。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對(duì)造模后和電針治療不同時(shí)相上海馬

16、內(nèi)Noggin的表達(dá)進(jìn)行半定量分析，觀察電針干預(yù)對(duì)Noggin表達(dá)的影響。采用免疫組化和原位雜交技術(shù)，觀察神經(jīng)發(fā)育誘導(dǎo)因子與新生神經(jīng)細(xì)胞的分布與共存情況。采用透射電鏡技術(shù)，觀察VD模型與電針干預(yù)在不同時(shí)相上海馬CA3區(qū)結(jié)合神經(jīng)行為學(xué)觀察情況證實(shí)突觸的形成。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，用SPSS12. 0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差分析，兩樣本均數(shù)間比較用t 檢驗(yàn)，P < 0. 05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。技術(shù)路線示意附：技術(shù)路線示意實(shí)驗(yàn)一：電針對(duì)擬VD大鼠的治療效應(yīng)及對(duì)VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生、Noggin的影響模型4w組Y迷宮篩選老齢大鼠180只電針3d組模型3d組電針7d組模型7d組電

17、針2w組模型2w組電針3w組模型3w組電針8w組電針4w組模型8w組在缺血后不同時(shí)相進(jìn)行BrdU在體標(biāo)記在不同時(shí)相行神經(jīng)行為學(xué)觀察后，按要求處死動(dòng)物取材治療效應(yīng)等觀察：神經(jīng)行為學(xué)觀察；HE及Nissl染色觀察病理改變及神經(jīng)元丟失情況；透射電鏡觀察海馬CA3突觸可塑性等。海馬神經(jīng)發(fā)生等觀察：免疫組化單標(biāo)及雙標(biāo)染色觀察NSC的增殖、遷移與分化，以及Noggin受體與新生細(xì)胞共表達(dá)情況；Noggin mRNA的RT-PCR檢測(cè)；原位雜交觀察Noggin分布等。造模，隨機(jī)分組，每組15只綜合分析得出結(jié)論實(shí)驗(yàn)二：Noggin對(duì)擬VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生和電針干預(yù)過(guò)程中治療效應(yīng)的影響模型4w組Y迷宮篩選老齢大

18、鼠180只電針3d組模型3d組電針7d組模型7d組電針2w組模型2w組電針3w組模型3w組電針8w組電針4w組模型8w組在缺血后給予側(cè)腦室注射反義Noggin mRNA，缺血后不同時(shí)相進(jìn)行BrdU在體標(biāo)記在不同時(shí)相行神經(jīng)行為學(xué)觀察后，按要求處死動(dòng)物取材治療效應(yīng)等觀察：神經(jīng)行為學(xué)觀察；HE及Nissl染色觀察病理改變及神經(jīng)元丟失情況；透射電鏡觀察海馬CA3突觸可塑性等。海馬神經(jīng)發(fā)生等觀察：免疫組化單標(biāo)及雙標(biāo)染色觀察NSC的增殖、遷移與分化，以及Noggin受體與新生細(xì)胞共表達(dá)情況；Noggin mRNA的RT-PCR檢測(cè)；原位雜交觀察Noggin分布等。造模，隨機(jī)分組，每組15只綜合分析得出結(jié)論

19、3.3 進(jìn)度安排第一年度（2006.1-2006.12）觀察造模后及電針干預(yù)下VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的變化規(guī)律，以及針灸治療效應(yīng)：具體包括：建立擬VD模型，觀察VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的改變情況（增殖、遷移、分化）及電針干預(yù)對(duì)其影響；觀察電針治療效應(yīng)（神經(jīng)行為學(xué)及海馬病理改變，突觸可塑性（透射電鏡）的變化等）。第二年度（2007.1-2007-12）闡明腦與神經(jīng)發(fā)育誘導(dǎo)因子Noggin基因的表達(dá)對(duì)VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響作用：通過(guò)側(cè)腦室注射給予外源性Noggin 反義mRNA，觀察Noggin對(duì)大鼠VD 模型及電針干預(yù)后海馬神經(jīng)發(fā)生的影響；在造模和電針治療不同時(shí)相上觀察海馬內(nèi)Noggin的表達(dá)分布

20、情況并進(jìn)行半定量分析，觀察電針干預(yù)對(duì)Noggin表達(dá)的影響；采用免疫組化染色或原位雜交技術(shù)，觀察神經(jīng)發(fā)育誘導(dǎo)因子Noggin與新生神經(jīng)細(xì)胞的分布與共存情況。第三年度（2008.1-2008.12）觀察新生神經(jīng)細(xì)胞的分化情況及功能性突觸的建立，結(jié)合前述的研究結(jié)果揭示電針治療VD的作用機(jī)制：對(duì)增殖細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光雙重標(biāo)記，采用熒光顯微鏡觀察電針對(duì)增殖細(xì)胞分化的影響。在觀察細(xì)胞分化情況的基礎(chǔ)上，結(jié)合神經(jīng)行為學(xué)及電鏡的突觸體視學(xué)研究情況，以證實(shí)新生神經(jīng)元功能性突觸的建立與形成。綜合所有研究結(jié)果，對(duì)電針在治療VD大鼠中對(duì)海馬神經(jīng)發(fā)生機(jī)制的影響作用進(jìn)行分析，得出研究結(jié)論。根據(jù)研究工作的進(jìn)展情況，可適當(dāng)調(diào)整

21、上述實(shí)驗(yàn)或穿插結(jié)合。4、項(xiàng)目創(chuàng)新之處4.1項(xiàng)目創(chuàng)新之處創(chuàng)見(jiàn)性地提出“海馬的神經(jīng)發(fā)生障礙是血管性癡呆的病理基礎(chǔ)，針灸治療VD的可能是促進(jìn)了海馬神經(jīng)發(fā)生機(jī)制而發(fā)揮作用”的研究假說(shuō)，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。采用國(guó)際通用的VD大鼠模型，從神經(jīng)發(fā)生的角度，系統(tǒng)觀察血管性癡呆的發(fā)病及電針治療后海馬神經(jīng)發(fā)生的變化規(guī)律，為深入揭示這一復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制做出積極的貢獻(xiàn)。本研究通過(guò)電針調(diào)節(jié)神經(jīng)誘導(dǎo)因子Noggin基因的表達(dá)以調(diào)控VD大鼠海馬神經(jīng)發(fā)生機(jī)制，探討針灸治療VD的作用機(jī)理，為探索新的臨床治療方法、提高療效，提供具有指導(dǎo)價(jià)值的科學(xué)依據(jù)。4.2項(xiàng)目立題依據(jù)4.2.1 血管性癡呆（VD）的病理基礎(chǔ)在分析卒中后癡

22、呆發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素中發(fā)現(xiàn)：缺血低氧性病變是卒中后癡呆發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。海馬是目前公認(rèn)與學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)神經(jīng)功能活動(dòng)具有密切關(guān)系的重要腦區(qū)，而海馬最易受缺血低氧的損害造成神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的異常改變，成為癡呆等疾病的主要病理基礎(chǔ)。影像學(xué)定量MRI研究認(rèn)為，VD患者中存在海馬或海馬杏仁體復(fù)合體萎縮，推測(cè)是由缺血性損害所致2。Fein等3認(rèn)為，皮質(zhì)下缺血性血管性癡呆與海馬及皮質(zhì)萎縮有關(guān)，與腔隙性梗死的數(shù)目、部位、體積無(wú)關(guān)；且海馬萎縮是病變嚴(yán)重程度最好的預(yù)測(cè)指標(biāo)。4.2.2 海馬神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象及其與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系隨著神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system

23、，CNS）仍能不斷地產(chǎn)生新的神經(jīng)元，即在成年CNS仍有神經(jīng)發(fā)生（neurogenesis）。大量證據(jù)表明，大腦終生具有神經(jīng)再生的能力，而新生神經(jīng)元可能具有拓展和修復(fù)學(xué)習(xí)記憶的重要功能4-6。目前，在成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)，人們了解比較多的神經(jīng)發(fā)生區(qū)域有兩個(gè)，即海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）的顆粒下層（subgranular zone，SGZ）和側(cè)腦室的腦室下層（subventricular zone，SVZ）。成年海馬DG存有神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)元前體細(xì)胞，具有長(zhǎng)期自我更新能力，是海馬新生神經(jīng)元的主要來(lái)源7,8。成年海馬神經(jīng)發(fā)生已在不同種屬間得到了廣泛證明，表明成年海馬神經(jīng)發(fā)生在種屬間高

24、度保守，是生物界的普遍現(xiàn)象。學(xué)習(xí)記憶是大腦的高級(jí)功能。長(zhǎng)期以來(lái)，已從眾多角度對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了探討，但有關(guān)學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制研究仍未取得突破性進(jìn)展。研究表明，成年動(dòng)物海馬新生細(xì)胞絕大多數(shù)具有成熟神經(jīng)元的形態(tài)，且能夠產(chǎn)生動(dòng)作電位并形成功能性突觸聯(lián)系9。這些NSC經(jīng)過(guò)遷移到達(dá)顆粒細(xì)胞層，發(fā)出的樹(shù)突進(jìn)入海馬的分子層，它們的軸突則成為苔蘚纖維通路的一部分，并與CA3區(qū)的靶神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系。CA3區(qū)是海馬產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）的主要部位，因而位于SGZ的神經(jīng)發(fā)生對(duì)空間學(xué)習(xí)與記憶可能有重要作用。成年海馬的神經(jīng)發(fā)生與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。海馬新生的神經(jīng)元可能參與記憶的形

25、成與保存，一些促進(jìn)成年海馬神經(jīng)發(fā)生的因素往往能夠改善學(xué)習(xí)記憶功能，而抑制海馬神經(jīng)發(fā)生的因素可出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶等功能障礙10。Shors等5證明新生神經(jīng)元對(duì)大鼠海馬依賴(lài)型記憶（hippocampal-dependent memory）的形成不可或缺。研究用藥物殺死增殖的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)新生神經(jīng)元數(shù)目減少時(shí)導(dǎo)致海馬依賴(lài)型記憶嚴(yán)重受損；停藥后細(xì)胞增殖恢復(fù)，海馬依賴(lài)型記憶明顯改善。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，海馬非依賴(lài)型記憶未受任何影響，成熟的海馬神經(jīng)元沒(méi)有死亡，海馬CA1區(qū)也未發(fā)生永久的神經(jīng)生理學(xué)性質(zhì)的改變。這些研究表明，海馬新生神經(jīng)元是相關(guān)學(xué)習(xí)記憶所必需。4.2.3 缺血性腦損傷與海馬神經(jīng)發(fā)生的關(guān)系海馬是腦組織對(duì)缺血高

26、度敏感的腦區(qū)。缺血性腦損傷極易造成神經(jīng)元丟失而導(dǎo)致腦功能缺陷11。Yagita等12發(fā)現(xiàn)，短暫性前腦缺血后，SGZ內(nèi)增殖細(xì)胞的數(shù)量增加5.78倍，4周后大約70%表達(dá)神經(jīng)元的表型，表明缺血可誘導(dǎo)海馬內(nèi)的神經(jīng)發(fā)生。Iwai等13對(duì)短暫性全腦缺血后DG神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞增殖、遷移和分化的關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血后齒狀回NSC的增殖開(kāi)始于SGZ，然后遷移到顆粒細(xì)胞層并在此分化成神經(jīng)元，另一部分新生細(xì)胞移行至DG門(mén)區(qū)分化為膠質(zhì)細(xì)胞，而這三步主要在全腦短暫性缺血后2個(gè)月內(nèi)完成。Nakatomi等6也觀察到，在缺血性損傷腦組織，給予適當(dāng)刺激和生長(zhǎng)因子，則能誘導(dǎo)海馬的NSC增殖分化成新的神經(jīng)元，從而改

27、善學(xué)習(xí)記憶能力。4.2.4 神經(jīng)誘導(dǎo)因子Noggin與海馬神經(jīng)發(fā)生的關(guān)系近幾十年來(lái)研究者致力于神經(jīng)誘導(dǎo)因子（Neural inducing facror，NIF）的尋找，目前已發(fā)現(xiàn)的NIF有Noggin、follistatin和chordin。其神經(jīng)誘導(dǎo)作用可能是通過(guò)阻斷骨形成蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）而發(fā)生14。實(shí)驗(yàn)表明，抑制BMPs信號(hào)就足以導(dǎo)致神經(jīng)的發(fā)生15。所以目前研究認(rèn)為：神經(jīng)發(fā)生不是一個(gè)主動(dòng)誘導(dǎo)的過(guò)程，而是阻斷向表皮誘導(dǎo)信號(hào)BMPs而產(chǎn)生的內(nèi)定過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)Noggin對(duì)神經(jīng)發(fā)生有重要影響作用，腦缺血后的神經(jīng)再生也可能與Noggin的參

28、與有關(guān)。Noggin是由室管膜細(xì)胞產(chǎn)生一種能與BMPs結(jié)合并抑制BMPs受體激活的多肽，它能通過(guò)抑制內(nèi)源性BMPs信號(hào)通路而促進(jìn)海馬神經(jīng)再生，同時(shí)抑制NSC向膠質(zhì)細(xì)胞分化16。研究發(fā)現(xiàn)，從胚胎至成年的整個(gè)發(fā)育期，腦室下區(qū)均有Noggin與BMPs表達(dá)，且Noggin與BMPs之間的平衡對(duì)室下區(qū)NSC的增殖、分化、存活及新生神經(jīng)元可塑性均有重要調(diào)控作用17。室下區(qū)細(xì)胞主要表達(dá)BMPs及其相應(yīng)受體，而相鄰的室管膜細(xì)胞則主要表達(dá)Noggin。BMPs通過(guò)促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞的分化而抑制神經(jīng)發(fā)生，而外源性Noggin蛋白則促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生18。近年研究表明，Noggin基因作為重要的NIF表達(dá)在成年大鼠海馬與前皮

29、質(zhì)，并與空間學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。由海馬參與的Morris水迷宮訓(xùn)練能使海馬DG的顆粒細(xì)胞層、CA3區(qū)及前皮質(zhì)內(nèi)Noggin mRNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著升高，側(cè)腦室注射N(xiāo)oggin反義寡核苷酸可明顯抑制該效應(yīng)，并可引起大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙，表現(xiàn)為空間記憶的獲得困難和形成記憶的保留障礙19。4.2.5 研究假說(shuō)與思路的確立目前，VD尚沒(méi)有肯定的藥物或手術(shù)治療方法。預(yù)防中風(fēng)被認(rèn)為是減少VD發(fā)病率和死亡率最直接和實(shí)質(zhì)性的方法。常用的治療藥物有血液流變學(xué)藥物（己酮可可堿）、抑制細(xì)胞鈣內(nèi)流血管活性藥物（尼莫地平）、阿司匹林、丙戊茶堿、納洛酮及核苷嘧啶等。最近更多提到的乙酰膽堿酯酶抑制劑被推薦為治療VD的首選藥物

30、。但上述藥物均存在著一定的毒副作用。采用針灸尤其是電針治療VD有著良好的療效，最近，彭唯娜等20對(duì)國(guó)內(nèi)外關(guān)于電針治療VD的文獻(xiàn)中符合隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的臨床研究，篩選出符合納入標(biāo)準(zhǔn)的5個(gè)研究采用循證醫(yī)學(xué)的方法進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，電針治療組有效率在7091之間，療效均優(yōu)于西藥對(duì)照組。其評(píng)價(jià)結(jié)果顯示：電針治療VD安全、無(wú)不良反應(yīng)，對(duì)改善整體功能和認(rèn)知功能均較對(duì)照組有效，其中電針對(duì)整體功能改善的有效性較好。VD屬于中醫(yī)學(xué)“呆病”、“郁癥”等范疇。病位在腦，病機(jī)主要為氣血虧虛，肝腎不足，腦竅失于榮養(yǎng)，進(jìn)而髓海失聰所致。靈樞·海論提出：腦為髓之海，其輸上在于華蓋（百會(huì)），下在風(fēng)府。難經(jīng)·二十八

31、難云：“督脈者上至風(fēng)府，入屬于腦?！卑贂?huì)與大椎均為督脈穴位，督脈與腦密切相關(guān)，百會(huì)為“三陽(yáng)五會(huì)”，大椎為“諸陽(yáng)之會(huì)”，針刺此兩穴可以激發(fā)經(jīng)氣、疏通經(jīng)絡(luò)，使腦髓得氣血之榮養(yǎng)而復(fù)聰。我們以往的研究以大椎、百會(huì)為主從臨床和實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面均證實(shí)電針可有效改善VD患者的癥狀、提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的能力。海馬在許多記憶過(guò)程中起重要作用，包括空間學(xué)習(xí)、對(duì)環(huán)境中物體的方位進(jìn)行定位及將不連續(xù)的信息連接起來(lái)，這些功能的發(fā)揮可能與海馬中大量新生神經(jīng)元的出現(xiàn)及新突觸的形成有關(guān)21。我們以往證實(shí)22,23：電針可促進(jìn)腦缺血后內(nèi)源性NSC的增殖和分化，電針治療缺血性腦損傷的主要作用機(jī)制之一可能是通過(guò)激發(fā)NSC參與腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)

32、和功能的重塑自身修復(fù)而實(shí)現(xiàn)的。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明Noggin拮抗BMPs促進(jìn)成年海馬與SVZ的神經(jīng)發(fā)生。Noggin作為一種重要的神經(jīng)誘導(dǎo)劑，在神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究成年海馬神經(jīng)發(fā)生在電針治療VD的作用機(jī)制，通過(guò)Noggin調(diào)控海馬的神經(jīng)發(fā)生參與學(xué)習(xí)記憶，將是針刺治療VD機(jī)理研究的一個(gè)嶄新領(lǐng)域。綜上所述，本項(xiàng)目擬從中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)的角度，研究電針督脈腧穴百會(huì)、大椎治療VD的海馬神經(jīng)發(fā)生機(jī)制，從調(diào)節(jié)腦與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)的神經(jīng)誘導(dǎo)因子Noggin基因的表達(dá)入手，觀察VD及電針治療時(shí)海馬神經(jīng)發(fā)生的變化規(guī)律，新生神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化，結(jié)合學(xué)習(xí)記憶的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)神經(jīng)突觸的重建，以及相應(yīng)神經(jīng)行

33、為學(xué)的改變，探討Noggin等在治療VD時(shí)對(duì)神經(jīng)發(fā)生的促進(jìn)作用。旨在闡明針灸治療VD的神經(jīng)生物學(xué)作用機(jī)制，為治療缺血性腦血管疾病提供科學(xué)依據(jù)。5、工作基礎(chǔ)與工作條件5.1 工作基礎(chǔ)本課題組主要成員長(zhǎng)期從事針灸治療缺血性腦血管病、VD、帕金森病的臨床和實(shí)驗(yàn)研究，特別是對(duì)針刺治療缺血性腦血管病的臨床與實(shí)驗(yàn)有較深入的研究。曾參與完成國(guó)家自然科學(xué)基金“針刺對(duì)局灶性腦缺血后突觸可塑性促進(jìn)作用的研究”和國(guó)家中醫(yī)藥管理局科研基金“針刺調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)缺血后腦可塑性促進(jìn)作用的研究”等項(xiàng)目。本課題申請(qǐng)者，在攻讀博士學(xué)位期間以廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“電針對(duì)局灶性腦缺血大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞影響的研究”（No.31

34、458，排名第二）；作為學(xué)位研究課題，研究證實(shí)：電針可促進(jìn)腦缺血后內(nèi)源性NSC的增殖和分化，內(nèi)源性NSC參與了缺血新性損傷的腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能重塑自身修復(fù)。這為開(kāi)展本項(xiàng)目的研究在相關(guān)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)等方面提供了有力的支持。課題組主要成員，自1990年代起以大椎、百會(huì)等穴位為主從臨床和實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面均證實(shí)電針可有效改善VD患者的癥狀、提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的能力；并證實(shí)其作用可能機(jī)制是多途徑的。在上述研究基礎(chǔ)上取得了多項(xiàng)相關(guān)研究成果：“電針對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸受體的調(diào)節(jié)作用”，2004年獲浙江省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)；“腦靶向督脈導(dǎo)入Hup-A傳遞系統(tǒng)及改善癡呆動(dòng)物記憶障礙研究”， 2003年獲浙

35、江省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)；“電針治療血管性癡呆的實(shí)驗(yàn)研究”獲2003年浙江省教育廳科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。且有在研相關(guān)課題浙江省自然基金項(xiàng)目“電針改善大腦學(xué)習(xí)記憶與NMDA受體NR2B亞單位的關(guān)系”（No.M303725）。上述研究與所取得的成果，為本課題的研究開(kāi)展打下良好的工作基礎(chǔ)。5.2 工作條件本校有設(shè)施完備的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（提供清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)大鼠和全封閉清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)環(huán)境）、我系針灸研究所擁有分子生物實(shí)驗(yàn)室、免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)室及電生理實(shí)驗(yàn)室，且已經(jīng)具有以下主要儀器設(shè)備：PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)P-E公司），電泳儀、酶標(biāo)儀，GIS-2009凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能公司），WDT2腦立體定位儀（中國(guó)西北光電公司），C

36、M-1850恒溫冰凍切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），Leica-2025石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），E-MALL-200圖像采集和分析采用病理圖像分析系統(tǒng)（北京航空航天大學(xué)圖像分析系統(tǒng)，3.0版），-80超低溫冰箱（美國(guó)克林納特公司），MPF-66型熒光分光光度儀（美國(guó)P-E公司），VV-260紫外吸光光度儀（日本島津公司），多功能顯微照相系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司），等。所欠缺的主要是購(gòu)置生化、形態(tài)、免疫組化和分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)所需的各種大量試劑及實(shí)驗(yàn)材料。另外，需要大型儀器如透射電鏡（附屬省中醫(yī)院）的有償使用及個(gè)別儀器的更新等經(jīng)費(fèi)。6、預(yù)期研究結(jié)果及其利用研究結(jié)果的計(jì)劃和今后發(fā)展的思路6.1

37、 預(yù)期研究結(jié)果：研究結(jié)果的形式以公開(kāi)發(fā)表的論文和研究報(bào)告形式體現(xiàn)，通過(guò)研究預(yù)期得到以下結(jié)果：明確海馬神經(jīng)發(fā)生在及針灸治療VD中的作用； 證實(shí)電針促進(jìn)VD海馬神經(jīng)發(fā)生及新生神經(jīng)元的功能建立的作用；揭示海馬神經(jīng)發(fā)生在VD及針刺治療VD過(guò)程中與神經(jīng)發(fā)育誘導(dǎo)因子Noggin基因表達(dá)的相互關(guān)系，最終揭示針灸治療VD的作用機(jī)理，豐富和完善針灸治療的科學(xué)理論基礎(chǔ)。完成以上工作預(yù)計(jì)在核心期刊發(fā)表論文5篇左右，其中力爭(zhēng)12篇在國(guó)際SCI雜志上發(fā)表。通過(guò)研究項(xiàng)目的開(kāi)展，培養(yǎng)研究生23人。6.2 利用研究結(jié)果的計(jì)劃和今后發(fā)展的思路在國(guó)內(nèi)核心期刊發(fā)表相關(guān)研究成果的論文，并努力將研究成果發(fā)表在SCI雜志上進(jìn)行發(fā)表，擴(kuò)大

38、其在國(guó)內(nèi)外的影響；爭(zhēng)取獲得省級(jí)以上科研成果獎(jiǎng)。通過(guò)研究，探索VD的病理機(jī)制，為針灸和其他方法治療VD及相關(guān)缺血性腦血管疾病探索有效的治療思路和作用機(jī)理。國(guó)內(nèi)外對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的研究多集中在體外培養(yǎng)后進(jìn)行腦內(nèi)移植上，我們的研究是期望發(fā)現(xiàn)針刺調(diào)節(jié)體內(nèi)神經(jīng)誘導(dǎo)因子、營(yíng)養(yǎng)因子和其它能幫助NSC存活生長(zhǎng)的分子信號(hào)的最佳方法，進(jìn)一步激活患者自身的NSC增殖、分化和內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制。這也為本成果的利用和發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)，可以與NSC移植治療相結(jié)合，促進(jìn)移植后的NSC存活、增殖和分化而起到有效的治療作用。在本研究的工作基礎(chǔ)上，積極爭(zhēng)取獲得國(guó)家自然科學(xué)基金和國(guó)家重大研究計(jì)劃的項(xiàng)目資助；同時(shí)也進(jìn)行廣泛聯(lián)系，與神經(jīng)內(nèi)

39、外科的干細(xì)胞移植研究項(xiàng)目相結(jié)合，進(jìn)行跨學(xué)科交叉領(lǐng)域的研究攻關(guān)。7、參考文獻(xiàn)1. Desmond DW, Moroney JT, Paik MC, et al. Frequency and clinical determinants of dementia after ischemic strokeJ. Neurology, 2000; 54(10f):1124-11312. Olsson Y, Brun A, Englund E. Fundamental pathological lesions in Vascular dementia. Acta Neurol Scand Suppl, 19

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