口腔粘膜肥大細(xì)胞介質(zhì)對(duì)成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

1、    口腔粘膜肥大細(xì)胞介質(zhì)對(duì)成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響        摘要目的：研究口腔粘膜下纖維性變(OSF)組織中膠原纖維增生的原因。 方法：采用分離純化人胚口腔粘膜肥大細(xì)胞的介質(zhì)溶液(OMMCC)與體外培養(yǎng)的人胚口腔粘膜成 纖維細(xì)胞(OMFb)共同培養(yǎng)，對(duì)OMFb進(jìn)行形態(tài)計(jì)量分析。結(jié)果：OMFb 內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)(RER)和線粒體(Mi)體密度、面密質(zhì)和Mi的數(shù)密度增大，RER和Mi的比表面減小。結(jié)論：OM MCC可促進(jìn)OMFb分泌膠原蛋白的功能，肥大細(xì)胞可能參與了OSF

2、膠原增生的病理過(guò)程。關(guān)鍵詞肥大細(xì)胞；成纖維細(xì)胞；形態(tài)學(xué)；口腔粘膜下纖維化中分類號(hào)：R781.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1001-3733(2000)03-0208-03The effects of mast cells on the ultrastructureof fibroblasts derived from oral mucosaSu Kui,Liu Shufan,Shen Zihua,et al.（The People's Hospital of Zhongshan City, Gua ngdong Province,Zhongshan 528403）AbstractObje

3、ctive:To study the effects of mast cells on the ultra structure o f fibroblasts derived from oral mucosa.Method:Mast cells w ere isolated and purif ied from human embryo oral mucosa (OMMCC) and were co-cultured with the fibrobl asts from human embryo oral mucosa (OMFb).The rough endoplasmic reticula

4、 (RER) a nd mitchondria (Mi) of OMFb were observed and analyzed.Results:The volume densit y and surface density of RER and Mi,the numerical density of Mi in co-cultured OMFb increased significantly (P<0.01),the specific surface of RER and Mi de crea sed significantly.(P<0.01).Conclusion:The OM

5、MCC can p romote proliferation of OM Fb, and the function of proliferative OMFb is active,the mast cells might be rel ated to the oral submucous fibrosis.Key wordsMast cells;Fibroblasts;Morphology;Oral submucous fibr osis口腔粘膜下纖維性變(oral submucous fibrosis, OSF)主要表現(xiàn)在粘膜固有層和粘膜下 層膠原纖維增生，其病因尚不清楚。本課題組在OSF早

6、期病變組織中觀察到肥大細(xì)胞(mast c ell, MC)數(shù)量增多，并觀察到MC與成纖維細(xì)胞(fibro blast,Fb)緊密相嵌，F(xiàn)b吞噬MC 顆粒的 現(xiàn)象，同時(shí)發(fā)現(xiàn)吞噬了MC顆粒的Fb分泌膠原蛋白功能活躍1。為進(jìn)一步了解MC對(duì)F b的作用和MC在OSF中所起的作用，本研究采用分離純化的MC介質(zhì)溶液與體外培養(yǎng)的Fb共同培 養(yǎng)，觀察MC能否促進(jìn)Fb分泌膠原蛋白，以探討OSF膠原增生的機(jī)制。1材料與方法1.1人胚口腔粘膜成纖維細(xì)胞(oral mucous fibroblast,OMFb)培養(yǎng)取胎齡34月胎兒的口腔頰粘膜，按鄂征2組織消化原代細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行 OMFb原代培養(yǎng)，經(jīng)56次傳代，OM

7、Fb自然純化。1.2人胚口腔粘膜肥大細(xì)胞內(nèi)容物(oral mucous mast cell contents,OMMCC)提取按Larence 3的肥大細(xì)胞提取法，取胎齡34月胎兒的口腔粘膜，在Han k液中反復(fù)漂洗，剪成0.51.0 mm的碎片，加入I型膠原酶1 g/L，透明質(zhì)酸酶1 g/L(二者 均為Sigma公司產(chǎn)品)，37 消化30 min，尼龍網(wǎng)(150 m)過(guò)濾，殘?jiān)傧淮?，濾液離 心(1 000 r/min)10 min去上清，加入RPMI-1 640細(xì)胞培養(yǎng)基(Sigma公司產(chǎn)品)，含 體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清(杭州 四季清生物制品廠)、青霉素10 U、鏈霉素100 g/L

8、，配成有核細(xì)胞懸液。用比重為1 0 7 7 g/L的淋巴細(xì)胞分離液和比重為1 140 g/L的Ficoll液(均為上海試劑二廠產(chǎn)品)配成比重1 09 3 g/L和1 083 g/L 的兩種MC分離液，在離心管中先加入2 ml比重1 093 g/L的分離液，再加 入 2 ml比重1 083 g/L的分離液，然后加入1 ml有核細(xì)胞懸液，離心(2 500 r/min，10 min)， 吸 取兩種比重分離液間的界面液體，再同法反復(fù)離心提純界面液8次，獲取MC懸液。取少許細(xì) 胞懸液于體積分?jǐn)?shù)為10%中性福爾馬林固定，經(jīng)甲苯胺藍(lán)、阿爾新藍(lán)、沙紅染色和電鏡證實(shí) 為MC(1)并計(jì)數(shù)MC純度達(dá)90%以上，調(diào)整

9、細(xì)胞密度為2×108個(gè)/L，用CPS-1A型超聲波粉 碎機(jī) 擊碎MC，獲取OMMCC溶液，即含有肥大細(xì)胞介質(zhì)的溶液，其溶劑為RPMI-1 640細(xì)胞培養(yǎng)液。 1.3OMMCC與OMFb共同培養(yǎng)消化收集第7代的OMFb，調(diào)整細(xì)胞密度為2×108個(gè)/L，以每瓶1 ml的量接種于培養(yǎng)瓶中， 再加入4 ml培養(yǎng)基，37 、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組加入1 ml OMMCC，對(duì)照 組加入1 ml RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。1.4OMFb透射電鏡制樣共同培養(yǎng)120 h后，實(shí)驗(yàn)及對(duì)照各取3瓶細(xì)胞，收集細(xì)胞，體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛預(yù)固定2 h，10 g/L鋨酸

10、后固定1 h，然后按常規(guī)超薄切片制樣，每標(biāo)本制兩個(gè)銅網(wǎng)，透射電鏡觀察。 1.5OMFb的形態(tài)計(jì)量每個(gè)銅網(wǎng)隨機(jī)拍攝5個(gè)OMFb，放大10 000倍，每組共拍攝30個(gè)細(xì)胞，用PC Vision PLus(85型 ) 像分析系統(tǒng)(美國(guó))分別測(cè)算OMFb胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rough endoplasmic reticula,RER)、線 粒體(mitchondra,Mi)的體密度(Vv)、面密度(Sv)，比表面()以及Mi的數(shù)密度(Nv)。2結(jié)果電鏡下實(shí)驗(yàn)組OMFb多呈梭形，細(xì)胞核較大，常染色質(zhì)豐富，異染色質(zhì)較少，胞漿內(nèi)RER增生 擴(kuò)張(2)，線粒體增生(3)，計(jì)量結(jié)果如表1。對(duì)照組OMFb胞漿內(nèi)RE

11、R、Mi均較實(shí)驗(yàn)組少 ，RER亦有擴(kuò)張但不如實(shí)驗(yàn)組明顯。1分離的肥大細(xì)胞，胞漿內(nèi)可見顆粒(×10 000)2成纖維細(xì)胞內(nèi)增生，擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(×10 000)3成纖維細(xì)胞內(nèi)增生的線粒體(×10 000)表1OMFb的RER、Mi形態(tài)計(jì)量(±s)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)組(n=30)對(duì)照組(n=30)RERVv%19.37±6.9610.20±7.38 Sv%(mm-1)10.39±2.727.35±2.60(mm-1)0.54±0.250.72±0.11MiVv%4.81±0.692.67±

12、;2.07Sv%(mm-1)2.98±0.422.00±1.52(mm-1)0.62±0.110.75±0.07Nv%0(mm-3)0.54±0.170.23±0.17t檢驗(yàn)P<0.001 3討論MC含有40多種生物活性物質(zhì)，目前的研究發(fā)現(xiàn)下列活性物質(zhì)與纖維化有一定關(guān)系：組胺是 一種促有絲分裂劑，可刺激Fb生長(zhǎng)及合成膠原增加4；IL-1可直接增加I、 、型膠原的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)纖維化的形成5；IL-4能刺激Fb合成I、型膠原和 纖 維連結(jié)蛋白，促進(jìn)纖維化的形成6；肝素蛋白多糖可選擇性與來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞 、巨噬細(xì)胞及Fb本身所分泌的與肝素

13、結(jié)合的生長(zhǎng)因子結(jié)合，增強(qiáng)生長(zhǎng)因子的作用，刺激Fb增 生7；胃促胰酶能降解型膠原和纖維連接蛋白，解除Fb間的接觸抑制，使Fb 增生8。本課題組另一OMMCC與OMFb共同培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)9也發(fā)現(xiàn)：共同培養(yǎng)5 d后，OMFb數(shù)由2×108個(gè)/L增至5.9×108個(gè)/L，而對(duì)照組僅為4.1×108個(gè)/L，兩者 有顯著性差異，說(shuō)明OMMCC有促進(jìn)OMFb生長(zhǎng)的作用。本研究采用OMMCC與OMFb共同培養(yǎng)，試研究MC對(duì)Fb功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OMFb內(nèi)RER的Vv、 Sv增大，減小，說(shuō)明RER擴(kuò)張。RER擴(kuò)張被認(rèn)為是分泌膠原蛋白功能活躍的標(biāo)志10 。OMFb內(nèi)RER定量分析結(jié)果表明

14、MC有促進(jìn)Fb分泌膠原蛋白的功能。Mi的形態(tài)計(jì)量表明，實(shí)驗(yàn)組Mi較對(duì)照組明顯增生擴(kuò)張，Mi是進(jìn)行有氧呼吸和提供能量的場(chǎng)所，Mi增多為Fb的分裂增生和合成膠原提供能量。作者單位：蘇葵（廣東省中山市人民醫(yī)院口腔科528403）劉蜀凡（湖南醫(yī)科大學(xué)口腔系）沈子華（湖南醫(yī)科大學(xué)口腔系）彭隆祥（電鏡室)參考文獻(xiàn)1蘇葵，劉蜀凡，沈子華，等.肥大細(xì)胞與口腔粘膜下纖維性變關(guān)系的初步研究.中 華口腔醫(yī)學(xué)雜志，1997，32(4)：2532鄂征主編.組織培養(yǎng)技術(shù).北京：人民衛(wèi)生出版社，1985.1141783Larence IRAD,Warner JA,Cohan VL,et al.Purification an

15、d characterization of hum an skin mast cells.Evidence for human mast cell heterogeneity.J Immunol,1987,139 (9):30624Hatamochi A,Fujinara K,Veki H.Effects of histamine on collagen synthesis by cu ltured fibroblasts derived from guinea pig skin.Arch Dermatol Res,1985,277(1):60 5Canalis E.IL-1 has inde

16、pend effects on deoxyibonucleic acid and collagen synt hesis in cultures of rat calvarine.Endocrinology,1986,118(1):746Postlethuaite AE,Holness MA,Katai,et al.Human fibroblasts synthesize eleva ted levels of extracellular matrix proteins in response to IL-4.J Clin Invest,1992, 90(4):14797Yamashita Y,Nakagomi K,Takeda T,et al.Effect of heparin on pulmonary fibro blasts and vascullar cells.Thorax,1992,47(8):6348Vartio T,Seppa H,Vaheri A.Susceptibility of solube a