視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)活化淋巴細(xì)胞的凋亡

1、    視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞誘導(dǎo)活化 淋巴細(xì)胞的凋亡        【摘要】目的觀察視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞對(duì)體外抗原特異性活化淋巴細(xì)胞的影響，探索RPE細(xì)胞在眼免疫赦免中的作用。方法建立RPE與抗原特異性T淋巴細(xì)胞系和靜止淋巴細(xì)胞之間的共培養(yǎng)系統(tǒng)。使用基因組DNA電泳、DNA末端標(biāo)記和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)凋亡的誘導(dǎo)情況。結(jié)果與RPE共培養(yǎng)的抗原特異性活化淋巴細(xì)胞出現(xiàn)凋亡征象。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加

2、。定量分析表明：共育24小時(shí)的凋亡細(xì)胞占595；48小時(shí)占938%；72小時(shí)占1795%。與此相反，RPE對(duì)于靜止的T細(xì)胞則不具有顯著誘導(dǎo)凋亡的作用。結(jié)論RPE細(xì)胞具有誘導(dǎo)入侵淋巴細(xì)胞凋亡的能力。這種現(xiàn)象作為免疫反應(yīng)的限制機(jī)制，在眼后節(jié)免疫赦免的維持和保護(hù)眼免受免疫性炎癥反應(yīng)中可能具有重要的意義。【關(guān)鍵詞】色素上皮，眼/免疫學(xué)淋巴細(xì)胞脫噬作用流式細(xì)胞術(shù)中國(guó)書資料分類法分類號(hào)R7741R39211R446Apoptosis of activated lymphocytes induced by retinal pigment epithelial cells in vitroPENG Guang

3、hua,LI Zhijie,LI ChenResearch Section of Ophthalmology ,Institute of Tissue Transplantation Immunology,Jinan University,Guangzhou 510632,China【Abstract】ObjectiveTo examine the influence of retinal pigment epithelium(RPE) cells on antigen-specific activated lymphocytes in vitro,and to explore the rol

4、e of RPE cells in the immune privilege of the eyeMethodsCo-culture systems of RPE cells with antigen-specific T lymphocyte lines and resting T lymphocytes were established in vitroInduction of apoptosis was detected by genomic DNA electrophoresis,DNA in situend-labelling and flow cytometryResultsRPE

5、 cells induced apoptosis in antigen-specific activated T lymphocytes24 hours after culture,the signs of apoptosis appeared in lymphocytes co-incubated with RPE cellsAs time of co-culture went on,the number of apoptosic cells increasedQuantitative analysis of apoptosic cells showed that apoptosic cel

6、ls accounted for 595% after 24 hours,938% after 48 hours,and 1795% after 72 hoursIn contrast,RPE cells induced few apoptosis in resting T lymphocytesConclusionsThese results suggest that RPE cells possess the ability to induce the apoptosis of invading lymphocytes This phenomenon serves as a restrai

7、n mechanism of immune response and may be of vital importance in the maintenance of immune privilege in posterior segment of eye and in the protection of eye from the damage of immunogenic inflammation【Key words】Pigment epithelium of eye/immunologyLymphocytesApoptosisFlow cytometry最近的研究表明：眼組織特異性細(xì)胞在局

8、部免疫調(diào)節(jié)中起著重要的作用1。將病毒抗原接種于眼前房，眼前節(jié)組織可以誘導(dǎo)入侵炎性細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而限制了炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步擴(kuò)散2。但這種機(jī)制是否也存在于眼后節(jié)組織還不清楚。本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)條件下，建立RPE細(xì)胞和抗原特性活化淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)，觀察RPE細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞的影響，以探討RPE細(xì)胞在眼后節(jié)免疫赦免中的作用。1材料與方法11主要試劑 Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(Iscove's modified Dulbecco's medium,IMDM)、瓊脂糖、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和完全弗氏劑(complets Freund

9、9;s adjuvant,CFA)均為GIBCO產(chǎn)品；碘化丙錠(propidium iodide,PI)、溴化乙錠(ethidium bromide,EB)、RNA酶(RNAase)A、胰蛋白酶、分離酶(dispase)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)均為SIGMA公司產(chǎn)品；蛋白酶K為SERVA公司產(chǎn)品；細(xì)胞原位凋亡標(biāo)記試劑盒，由北京鼎國(guó)生物工程公司提供。12RPE的原代培養(yǎng)按Chang等3的方法略加改進(jìn)。摘除C57小鼠(級(jí))眼球，2U/ml分離酶浸泡，在體視顯微鏡下沿鋸齒緣去除眼前節(jié)和玻璃體。從脈絡(luò)膜和

10、RPE層之間仔細(xì)分離得到帶完整RPE層的視網(wǎng)膜，在IMDM培養(yǎng)液中，37放置15分鐘，即可將RPE層從視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層保持完整的分離下來，得到單純的RPE。漂洗后025胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，含15%FBS的IMDM培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)板中，待RPE細(xì)胞匯合。使用偶聯(lián)羅丹明的毒傘素(Molecular Probes,USA)標(biāo)記肌動(dòng)蛋白觀察其分布模式來鑒別細(xì)胞3。13抗原特異性淋巴細(xì)胞系的建立按照標(biāo)準(zhǔn)程序建立BSA抗原特異性T淋巴細(xì)胞系4。使用CFA和BSA混懸乳劑皮下注射預(yù)致敏C57小鼠。1周后無菌取脾臟，200目篩網(wǎng)研磨制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×

11、;106/ml。再加入10g/ml BSA培養(yǎng)5天。加入10U/ml重組人IL-2再培養(yǎng)7天。通過加入抗原和IL-2進(jìn)行再培養(yǎng)。3次循環(huán)刺激后，通過限制性稀釋技術(shù)克隆建立T細(xì)胞系。14脾T淋巴細(xì)胞懸液的制備取未致敏C57小鼠脾臟，過200目網(wǎng)制備單細(xì)胞懸液，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，此細(xì)胞作為靜止淋巴細(xì)胞。15淋巴細(xì)胞、RPE細(xì)胞的共培養(yǎng)共培養(yǎng)設(shè)置4組：RPE細(xì)胞與抗原特異性活化淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)組：待原代RPE細(xì)胞匯合后，吸除培養(yǎng)液，D-Hanks液洗滌后，每孔加入BSA抗原特異性淋巴細(xì)胞懸液2 ml(細(xì)胞數(shù)為1×106/ml)和05%BSA50 l進(jìn)行孵育；RPE細(xì)胞培養(yǎng)上清與抗原特異

12、性活化淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)組：原代RPE細(xì)胞匯合后，棄培養(yǎng)液，用IMDM完全培養(yǎng)液再培養(yǎng)24小時(shí)，取其上清液，加入BSA特異性淋巴細(xì)胞懸液2 ml和05BSA50 l進(jìn)行孵育；RPE細(xì)胞與靜止淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)組：待原代RPE細(xì)胞匯合后，吸除培養(yǎng)液，D-Hanks液洗滌后，每孔加入靜止淋巴細(xì)胞懸液2ml;單純抗原特異性淋巴細(xì)胞培養(yǎng)組：分別加入BSA特異性淋巴細(xì)胞懸液2 ml、05BSA50 l和完全培養(yǎng)液進(jìn)行孵育。分別于24，48，72小時(shí)取出上述各組淋巴細(xì)胞進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。16DNA裂解片段的提取及瓊脂糖凝膠電泳5將收集的上述各組淋巴細(xì)胞，苯酚 -氯仿抽提DNA，2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外線下觀

13、察和拍照。17細(xì)胞原位凋亡標(biāo)記分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的淋巴細(xì)胞。嚴(yán)格按照試劑盒提供的程序進(jìn)行：4%多聚甲醛固定30分鐘，2000rmin離心5分鐘，胎牛血清調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106/ml涂片，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)，37 濕盒孵育60分鐘(陰性對(duì)照片不加TdT酶，只加反應(yīng)緩沖液)。加封閉液37 濕盒作用30分鐘后，然后加入反應(yīng)液37 濕盒作用30分鐘，再加入顯色反應(yīng)液37暗盒作用20分鐘，05%甲綠復(fù)染20秒，顯微鏡下觀察細(xì)胞核內(nèi)有藍(lán)紫色顆粒者為凋亡陽性細(xì)胞。18流式細(xì)胞儀檢

14、測(cè)6分別收集與RPE細(xì)胞、RPE細(xì)胞培養(yǎng)上清共培養(yǎng)24，48，72小時(shí)的淋巴細(xì)胞，200目篩網(wǎng)過濾。70%冷酒精4固定15小時(shí)，2 000rmin離心5分鐘，加RNA酶A(10 g/ml)37 水浴30分鐘，再加PI(100 g/ml)染色，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml,4 避光過夜，流式細(xì)胞儀(FACScaliburBD，USA)檢測(cè)。2結(jié)果21培養(yǎng)RPE的一般特征與文獻(xiàn)報(bào)告結(jié)果相一致3，匯合單層的RPE細(xì)胞呈多邊形。偶聯(lián)羅丹明的毒傘素標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白主要位于細(xì)胞周邊、細(xì)胞間連接復(fù)合體處(1a,b)。a生長(zhǎng)兩周的RPE細(xì)胞單層的形態(tài)×125；b羅丹明毒傘素標(biāo)記技術(shù)顯示鄰近

15、細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白絲在細(xì)胞與細(xì)胞連接處形成單線外觀×2501培養(yǎng)RPE細(xì)胞的相差顯微像和免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記后肌動(dòng)蛋白絲的分布模式aMorphology of RPE cell monolayer grown for 2 weeks×125;b Rhodamine-phalloidin labeling shows actin microfilaments of adjacent cells forming a single line at the site of the cell-to-cell junctions×250Fig1Phase-contrast photo

16、micrograph of cultured RPE cells and the distribution pattern of actin microfilaments by immunocytochemistry22基因組DNA電泳與RPE細(xì)胞共培養(yǎng)的抗原特異性活化淋巴細(xì)胞，在共培養(yǎng)24小時(shí)后，開始出現(xiàn)凋亡征象，48小時(shí)可見典型的階梯狀改變，與標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA參照物比較為180200堿基對(duì)(base pair，bp)不同倍數(shù)的DNA片斷(2)。而與RPE細(xì)胞培養(yǎng)上清共培養(yǎng)的抗原特異性活化淋巴細(xì)胞、單純培養(yǎng)的抗原特異性淋巴細(xì)胞和與RPE共培養(yǎng)的靜止淋巴細(xì)胞均未見顯著的DNA斷裂現(xiàn)象。泳道a分

17、子量標(biāo)準(zhǔn)；b與RPE培養(yǎng)上清接觸72小時(shí)的活化淋巴細(xì)胞的DNA；c,e,g分別與RPE共育24，48，72小時(shí)的活化淋巴細(xì)胞的DNA；d與完全培養(yǎng)基接觸72小時(shí)的活化淋巴細(xì)胞的DNA；f與RPE共育72小時(shí)的靜止期淋巴細(xì)胞的DNA2與RPE共育的活化淋巴細(xì)胞的基因組DNA凝膠電泳淋巴細(xì)胞的核小體間DNA斷裂Lane aMolecular size marker;Lane c,e,gDNA was isolated from activated lymphocytes cocultured with RPE cells for 24,48,72 hours respectivelyLane bD

18、NA was isolated from activated lymphocytes exposed to PRE cell cultural supernatant for 72 hours;Lane dDNA was istolaed from activated lymphocytes exposed to complete media for 72 hours;Lane fDNA was isolated from resting lymphocytes cocultured with RPE cells for 72 hoursFig2Internucleosomal DNA fra

19、gmentation of activated lymphocytes cocultured with RPE cells23細(xì)胞原位凋亡標(biāo)記與RPE細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)的抗原特異性淋巴細(xì)胞，其少量的細(xì)胞核被TdT酶標(biāo)記，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色(3)，隨共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，被標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量有增多趨勢(shì)。共育24，48，72小時(shí)的凋亡細(xì)胞的數(shù)量分別為（67±57）%、（98±88）%和（184±185）。而單純活化淋巴細(xì)胞在培養(yǎng)24，48，72小時(shí)的標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量分別為（03±03）%、（13±06）和（38±25）；靜止淋巴細(xì)胞的標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量分別為（0

20、2±02）、（03±05）和（05±06）%，與共育組細(xì)胞相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P值均小于001)。3與RPE共育72小時(shí)的活化淋巴細(xì)胞的顯微鏡像。細(xì)胞核內(nèi)有藍(lán)紫色顆粒者為凋亡陽性細(xì)胞（箭）TUNEL染色×250Fig3TUNEL stain of activated lymphocytes cocultured with RPE cells for 72 hours（arrows）TUNELstain×25024流式細(xì)胞儀檢測(cè)與RPE細(xì)胞共培養(yǎng)的抗原特異性淋巴細(xì)胞：共培養(yǎng)24小時(shí)的淋巴細(xì)胞，在DNA直方上，在G1峰左側(cè)出現(xiàn)亞二倍體細(xì)胞群

21、的峰形，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，該細(xì)胞群的峰形逐漸變寬。凋亡細(xì)胞定量結(jié)果顯示：共培養(yǎng)24小時(shí)，凋亡細(xì)胞占595；共培養(yǎng)48小時(shí)，凋亡細(xì)胞占938；共培養(yǎng)72小時(shí)，凋亡細(xì)胞占1795%(4a,b)。其它各組抗原特異性淋巴細(xì)胞和靜止的淋巴細(xì)胞均未見顯著的凋亡細(xì)胞峰，凋亡細(xì)胞定量結(jié)果顯示：共培養(yǎng)2472小時(shí)，凋亡細(xì)胞僅占037%386%。S-Phase Assessment:Tissue Type:LymphocytesModel type:DiploidDiploid S:HighCalculated p-value:p<0.01S-phase BoundariesS-Phase Assess

22、ment:Tissue Type:LymphocytesModel type:DiploidDiploid S:HighCalculated p-value:p<0.01S-phase Boundariesa與RPE細(xì)胞共育24小時(shí)的淋巴細(xì)胞，凋亡細(xì)胞占595；b與RPE細(xì)胞共育72小時(shí)的淋巴細(xì)胞，凋亡細(xì)胞占1794RPE誘導(dǎo)活化淋巴細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀分析aThe histogram show lymphocytes cocultured with RPE cells for 24 hours,the apoptosis cells account for 595；b The hist

23、ogram show lymphocytes cocultured with RPE cells for 72 hours,the apoptosis cells account for 179%Fig4Flow cytometry analysis of RPE cell-induced apoptosis of activated lymphocytes3討論對(duì)于眼免疫赦免現(xiàn)象的了解可以追溯到120年前。初始認(rèn)為，眼的免疫赦免是血眼屏障所形成的物理屏障。該屏障具有雙重作用，一方面將眼內(nèi)抗原與免疫系統(tǒng)進(jìn)行隔離避免發(fā)生免疫識(shí)別，另一方面阻止免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子進(jìn)入眼內(nèi)。然而，最近的研究結(jié)果表明：

24、眼的免疫赦免機(jī)制非常復(fù)雜，取決于許多因素。這些因素包括：眼內(nèi)組織產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子和神經(jīng)多肽、局部功能特殊的抗原提呈細(xì)胞和眼內(nèi)接種抗原后誘導(dǎo)免疫偏離7。最近的研究發(fā)現(xiàn)凋亡也是眼免疫赦免的主要構(gòu)成因素2，8。將單純皰疹病毒-1型接種于小鼠眼前房，發(fā)現(xiàn)入侵的炎性細(xì)胞很快發(fā)生凋亡。這種凋亡具有雙重的臨床意義，一是限制了前房炎癥反應(yīng)的擴(kuò)散；二是誘導(dǎo)了病毒特異性偏離式的免疫耐受，從而進(jìn)一步阻止免疫反應(yīng)的加劇8。但是，上述機(jī)制是否也存在于眼后節(jié)還不清楚。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RPE細(xì)胞可以誘導(dǎo)抗原特異性活化淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡。這提示，眼后節(jié)的RPE細(xì)胞具有通過誘導(dǎo)入侵淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡的主動(dòng)免疫調(diào)控機(jī)制。但其誘導(dǎo)

25、凋亡的具體環(huán)節(jié)還不清楚。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，RPE培養(yǎng)的上清液不具有誘導(dǎo)凋亡的生物活性。這表明，RPE細(xì)胞誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的前提是細(xì)胞發(fā)生通訊。但是，非致敏的靜止淋巴細(xì)胞則可逃逸RPE細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡。這提示T細(xì)胞在活化期間細(xì)胞表面分子表達(dá)的上調(diào)參與了凋亡過程。因此，進(jìn)一步的工作是尋找參與誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的表面分子并闡明其分子機(jī)制。總之，RPE細(xì)胞誘導(dǎo)活化淋巴細(xì)胞凋亡對(duì)于眼后節(jié)免疫赦免狀態(tài)的維持可能起著一定的作用。這可能是一種保護(hù)視網(wǎng)膜完整性的限制性免疫赦免機(jī)制。通過該機(jī)制可使眼內(nèi)組織免除免疫性炎癥的破壞。該機(jī)制的破壞或削弱可能會(huì)打破眼內(nèi)免疫狀態(tài)的平衡，導(dǎo)致臨床上威脅視力疾病的發(fā)生。因此，尚需進(jìn)一步探索眼的免疫微環(huán)境與眼部疾病之間的關(guān)系，并發(fā)展加強(qiáng)或激發(fā)赦免保護(hù)機(jī)制的措施，以防治眼部疾病的發(fā)生。本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金資助，基金號(hào)39500158，39970250，教育部霍英東教育基金會(huì)資助，基金號(hào) 0501031作者單位：510632 廣州，暨南大學(xué)組織移植與免疫實(shí)驗(yàn)中心，眼科學(xué)實(shí)驗(yàn)室參考文獻(xiàn)1Caspi RR,Roberge FG,Nussenblatt RBOrgan-resident,no