舟山眼鏡蛇毒L舶被酸氧化酶的分離純化、理化及酶學(xué)性質(zhì)

1、舟山眼鏡蛇毒L?舶被?酸氧化酶的分離純化、理化及酶學(xué)性質(zhì)               作者：林麗珊, 張志強(qiáng), 陳洲, 許云祿    【摘要】  目的從舟山眼鏡蛇蛇毒中分離L?舶被?酸氧化酶(LAO),測(cè)定其理化和酶學(xué)性質(zhì)。方法應(yīng)用Sephadex G?100凝膠色譜和POROS CM20離子交換色譜分離純化LAO;Wellner和Lichtenberg法測(cè)定LAO活力;SDS?PAGE法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量。結(jié)果舟山眼

2、鏡蛇蛇毒經(jīng)Sephadex G?100凝膠色譜和兩次POROS 20 離子交換色譜后,獲得LAO純品(暫定名NA?LAO)。NA?LAO在非還原和還原條件下相對(duì)分子質(zhì)量均為58 kD左右;其反應(yīng)最適pH為8.0,最適溫度為60 ,對(duì)L?脖獎(jiǎng)?氨酸的米氏常數(shù)(Km)為3.08 mmoL/L。結(jié)論應(yīng)用凝膠過(guò)濾色譜和離子交換色譜可從舟山眼鏡蛇毒中分離純化LAO。 【關(guān)鍵詞】  眼鏡蛇毒液類(lèi); 氨基酸氧化還原酶    蛇毒成分復(fù)雜,主要為酶和毒素,L?舶被?酸氧化酶(EC.1.4.3.2)在蛇毒中分布非常廣泛,在蝰科、響尾蛇科、眼鏡蛇科以及蝮蛇科中都有分布1?4

3、。L?舶被?酸氧化酶(L?amino acid oxidase,LAO)是蛇毒中一種重要的活性組分,能夠催化L?舶被?酸的氧化脫氨反應(yīng),生成相應(yīng)的?餐?酸、氨以及過(guò)氧化氫5,具有多種生物活性,如誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制或誘導(dǎo)血小板聚集、細(xì)胞毒性和抗菌活性等6?10。已從幾種蛇毒中分離得到LAO,筆者應(yīng)用凝膠色譜和離子交換色譜從舟山眼鏡蛇蛇毒分離LAO,并對(duì)其部分理化和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。    1材料和方法    1.1材料    1.1.1蛇毒舟山眼鏡蛇(Naja atra)蛇毒凍干粉,福建醫(yī)科大學(xué)

4、蛇毒研究所提供。    1.1.2試劑與儀器L?脖獎(jiǎng)?氨酸(批號(hào)040924,上海翔軍生物科技有限公司);砷酸鈉（Lot#:0892B82,美國(guó)Amresco公司）;過(guò)氧化氫酶（AA104?1,美國(guó)Sigma公司）。Sephadex?G100凝膠柱(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);CM20陽(yáng)離子交換填料預(yù)裝柱(POROS 20,美國(guó)Applied Biosystems公司);BioCAD純化工作站(美國(guó)Applied Biosystems公司);自動(dòng)部分收集器(BSZ?100)和恒流泵(HL?1,上海滬西分析儀器廠);恒溫?fù)u床(美國(guó)

5、Forma公司);紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Bio?rad公司);試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。    1.2方法    1.2.1眼鏡蛇蛇毒的凝膠色譜Sephadex G?100凝膠柱(2.6 cm×100 cm)用HAc?NaAc緩沖液(pH 5.8,0.05 mol/L+NaCl 0.05 mol/L)預(yù)先平衡過(guò)夜。稱(chēng)取眼鏡蛇粗毒0.5 g溶于10 mL雙蒸水,4 靜置過(guò)夜,4 10 000 r/min離心10 min。取上清液凝膠柱,用HAc?NaAc緩沖液洗脫,流速16 mL/h。收集洗脫液,4 mL/管,根據(jù)D(280 n

6、m)值繪出洗脫曲線。    1.2.2凝膠色譜組分LAO活力按文獻(xiàn)5介紹的流程和反應(yīng)體系進(jìn)行分離組分酶活力測(cè)定。凝膠色譜洗脫組分0.1 mL與L?脖獎(jiǎng)?氨酸反應(yīng),以終產(chǎn)物的光密度值D(300 nm)為指標(biāo)，以反應(yīng)體系中加HAc?NaAc緩沖液0.1 mL取代蛇毒組分為未加酶對(duì)照。一個(gè)活力單位定義為在上述條件下得到0.03D300 nm所需的酶量。    1.2.3LAO純化合并經(jīng)凝膠色譜收集的具有LAO活性的組分。以POROS 20進(jìn)行純化。線性梯度洗脫(A液:0.05 mol/L,pH 5.8的HAc?NaAc緩沖液;B液:含有0.

7、5 mol/L NaCl的平衡液),收集洗脫蛋白峰,濃縮和脫鹽。測(cè)定POROS 20離子交換層析各組分的LAO活性,收集具有活性的組分,用POROS 20離子交換層析,以0.02 mol/L,pH 6.2的HAc?NaAc緩沖液平衡,線性梯度洗脫(A液:0.02 mol/L,pH 6.2的HAc?NaAc緩沖液;B液:含有0.5 mol/L NaCl的平衡液),進(jìn)一步純化,收集活力峰,濃縮、透析脫鹽。    1.2.4LAO純度鑒定及相對(duì)分子質(zhì)量按堿性不連續(xù)系統(tǒng)進(jìn)行。樣品按是否含有2%?槽匣?乙醇分為還原性和非還原性?xún)煞N。在Hoefer電泳儀上電泳2 h,穩(wěn)流12

8、 mA/10 cm×10 cm。常規(guī)染色脫色。在Image Master VDS凝膠成像系統(tǒng)上依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)定曲線,計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量。    1.2.5蛋白質(zhì)濃度采用文獻(xiàn)11方法,將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液適當(dāng)稀釋,在波長(zhǎng)260 nm和280 nm處分別測(cè)出D值,然后利用280 nm和260 nm波長(zhǎng)下的吸收差求出蛋白質(zhì)的濃度。    蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=1.45D(280 nm)-0.74D(260 nm)    1.2.6LAO對(duì)溫度和pH適應(yīng)性最適pH測(cè)定:在pH 6.010.0緩沖液中,

9、其他條件不變,測(cè)定酶活力。最適溫度測(cè)定:酶液在0.4 moL/L,pH 7.8的Tris?HCl緩沖液中,測(cè)定20,30,40,50,60和70 下的酶活力。以酶活力最高者為100%,其余折算為最高活力的百分?jǐn)?shù),并以pH或溫度為橫坐標(biāo),最高活力百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo),繪制酶活力適應(yīng)曲線。    1.2.7LAO米氏常數(shù)(Km)酶液與不同濃度L?脖獎(jiǎng)?氨酸反應(yīng),利用反應(yīng)終止法測(cè)定酶反應(yīng)初速度(V),根據(jù)Lineweaver?Burk作圖法求出該酶對(duì)L?脖獎(jiǎng)?氨酸的Km值12。    2結(jié)果    2.1眼鏡蛇蛇毒凝

10、膠色譜眼鏡蛇毒粗毒經(jīng)Sephadex G?100凝膠層析后獲得5個(gè)蛋白峰,分別標(biāo)記為。其中第峰具有LAO活力。從粗毒500 mg中可獲得組分38.6 mg,蛋白回收率約7.8%(圖1,表1)。    樣品:眼鏡蛇蛇毒(500 mg);凝膠柱:Sephadex G?100 2.6 cm×100 cm;洗脫液:HAc?NaAc緩沖液(0.05 mol/L,pH 5.8,含0.05 mol/L NaCl);流速:16 mL/h,4管/h;陰影部分為L(zhǎng)?舶被?酸氧化酶活性組分.    圖1眼鏡蛇蛇毒的Sephadex G?100凝膠

11、色譜    Fig 1Gel filtration of Naja atra venom on Sephadex G?100    2.2LAO純化凝膠色譜第峰經(jīng)CM20預(yù)裝柱POROS 20 進(jìn)行分離,分離后可得到7個(gè)洗脫峰,其中第4峰具有LAO活力(圖2)。合并收集該組分，再次用POROS 20 純化,得到A、B兩個(gè)蛋白峰,經(jīng)活性測(cè)定,其中第B峰具有LAO活性。該組分經(jīng)SDS?PAGE鑒定為電泳純暫定名為NA?LAO。從粗毒到獲得NA?LAO各層析步驟的目的組分得率及酶活性變化(表1),NA?LAO在眼鏡蛇毒粗毒中的含量約為0.3

12、。 表1L?舶被?酸氧化酶的酶活力變化及得率樣品:第組分;上樣體積:5 mL;色譜柱:CM20 (POROS 201.6 mm×100 mm);緩沖液體系:A液:HAc?NaAc(pH 5.6,0.05 mol/L);B液:A液+0.5 moL/L NaCl;梯度:30%100%,25CV;流速1 mL/min;出現(xiàn)“”組分具有L?舶被?酸氧化酶活性.     圖2POROS 20 離子交換色譜圖    Fig 2Ion?exchange chromatography of LAO on CM20 (POROS 20)

13、60;   2.3NA?LAO純度鑒定及相對(duì)分子質(zhì)量NA?LAO經(jīng)12.5%SDS?PAGE電泳為一條清晰的蛋白帶(圖3),NA?LAO不論是還原還是非還原SDS?PAGE電泳均為一條帶,說(shuō)明NA?LAO為單鏈蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量約58 kD。    2.4NA?LAO對(duì)溫度和pH的適應(yīng)性在LAO酶活力測(cè)定的體系中,改變反應(yīng)溫度,其余條件不變,NA?LAO在2070 區(qū)間,60 時(shí)活力最高。以60 時(shí)LAO活力為100%,繪制NA?LAO在不同溫度下的酶活力(圖4)。    在pH 6.010.0的緩沖體系,NA?L

14、AO活性在pH 8.0時(shí)為最高,在pH 9.010活性較pH 8.0為低,但仍保持較高活性。以pH 8.0時(shí)酶活力為100%,繪制NA?LAO在不同pH下的酶活力(圖5)。    2.5LAO米氏常數(shù)(Km)以苯丙氨酸為底物,在pH 7.8,37 下,根據(jù)Lineweaver?Burk雙倒數(shù)作圖法作圖,得出的方程為:1/V=0.0276+0.0851*1/S,計(jì)算眼鏡蛇LAO對(duì)L?脖獎(jiǎng)?氨酸的Km值為3.08 mmoL/L(圖6)。    3討論    3.1眼鏡蛇毒LAO的分離純化蛇毒是多種酶或非酶蛋白

15、質(zhì)或多肽的混合物,含有多種相對(duì)分子質(zhì)量大小不等、等電點(diǎn)各異的蛋白質(zhì)或多肽分子。分離蛇毒中活性成分有凝膠過(guò)濾層析法、離子交換層析法、疏水層析法和反相層析法等。筆者根據(jù)眼鏡蛇毒中各種組分相對(duì)分子質(zhì)量的差異應(yīng)用Sephadex G?100凝膠過(guò)濾法進(jìn)行分離,具有LAO活性的組分為相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)較大的成分,約占粗毒7.8,這一過(guò)程去除了大量相對(duì)分子質(zhì)量低的組分(約90%),為進(jìn)一步用離子交換層析降低了層析柱負(fù)荷。由于凝膠色譜分級(jí)所得到的活性組分間還含有不少其他非LAO的蛋白質(zhì),因此,根據(jù)蛋白質(zhì)的荷電性質(zhì)差異,應(yīng)用ROROS 20弱陽(yáng)離子交換色譜進(jìn)一步分離,發(fā)現(xiàn)70為非LAO蛋白質(zhì)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和前期

16、預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,筆者采用在不同pH條件下的ROROS 弱陽(yáng)離子交換色譜,將相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)接近的蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)第一次ROROS 色譜所得具有LAO活性的蛋白峰再次經(jīng)ROROS 色譜柱(洗脫液pH由5.6改為6.2,洗脫梯度由30%100改為050)獲得兩個(gè)色譜峰,含有LAO的為第B峰。    3.2蛇毒LAO的理化性質(zhì)及活性根據(jù)以往的研究報(bào)道,從不同蛇毒中分離純化出來(lái)的LAO有不同的結(jié)構(gòu),以同二聚體或異二聚體形式存在的相對(duì)分子質(zhì)量分布在100142 kD,以單體蛋白質(zhì)形式存在的相對(duì)分子質(zhì)量5560 kD3。本文分離得到的眼鏡蛇毒LAO即NA?LAO

17、在還原與非還原條件下,SDS?PAGE電泳均顯示一條帶,說(shuō)明它為單鏈蛋白質(zhì),相對(duì)分子質(zhì)量為58 kD,與文獻(xiàn)報(bào)道的江浙蝮蛇毒LAO相似。Tan等報(bào)道的同屬眼鏡蛇科的孟加拉眼鏡蛇(Naja kaouthia)毒LAO及Ahn等報(bào)道的眼鏡王蛇毒LAO均為同二聚體蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量分別為112和135 kD1,4,說(shuō)明不同蛇毒的LAO的理化性質(zhì)差異很大,但是LAO單體或二聚體存在與蛇種關(guān)系不大?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Ahn M Y,Lee B M,Kim Y S. Characterization and cytotoxicity of L?amino acid oxidase from th

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