神經細胞培養(yǎng)及其形態(tài)特征

1、神經細胞培養(yǎng)體外神經細胞的培養(yǎng)已成為神經生物學研究中十分有用的技術手段。神經細胞培養(yǎng)的主 要優(yōu)點是 :(1) 分散培養(yǎng)的神經細胞在體外生長成熟后, 能保持結構和功能上的某些特點 , 而且長期培養(yǎng)能形成髓鞘和建立突觸聯(lián)系 , 這就提供了體內生長過程在體外重現(xiàn)的機會。 (2) 能 在較長時間內直接觀察活細胞的生長、 分化、形態(tài)和功能變化 , 便于使用各種不同的技術方法 如相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、同位素標記、原位雜交、免 疫組化和電生理等手段進行研究。 (3) 易于施行物理(如缺血、缺氧) 、化學和生物因子(如 神經營養(yǎng)因子) 等實驗條件 , 觀察條件變更對神經細胞的直

2、接或間接作用。 (4) 便于從細胞和 分子水平探討某些神經疾病的發(fā)病機制， 藥物或各種因素對胚胎或新生動物神經細胞在生長、 發(fā)育和分化等各方面的影響。 我們實驗室從 80 年代始開展了神經細胞的體外培養(yǎng)工作，取 得了一些經驗，現(xiàn)將培養(yǎng)細胞分類及方法簡要介紹如下 :一 . 雞胚背根神經節(jié)組織塊培養(yǎng)主要用于神經生長因子(NGF等神經營養(yǎng)因子的生物活性測定。在差倒置顯微鏡下觀察以神經突起的生長長度和密度為指標半定量評估NGF的活性。1 材料和方法(1)選正常受精的雞蛋，置于 37C生化培養(yǎng)箱內孵化，每日翻動雞蛋一次。( 2)取孵化 8-12 d 的雞蛋, 用 70% 酒精消毒蛋殼，從氣室端敲開蛋殼，

3、用消毒鑷剝除氣 室部蛋殼。(3)用彎鑷鉤住雞胚頸部，無菌條件下取出雞胚置小平皿內，除去頭部后，腹側向上置 滅菌毛玻璃片上 , 用眼科彎鑷子打開胸腹腔，除去內臟器官。( 4)在解剖顯微鏡下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其兩側，在椎間孔旁可見到沿脊柱兩側 排列的背根節(jié)(圖 1)，用一對 5 號微解剖鑷小心取出。(5)置背根節(jié)于解剖溶液內，用微解剖鑷去除附帶組織，接種于涂有鼠尾膠的玻璃或塑料培養(yǎng)瓶中，在 DMEM無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)。2 結果雞胚背根神經節(jié)在含神經生長因子 (NGF, 2.5S ， 20ng/ml) 的無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng) 24 h, 神經節(jié)長出密集的神經突起。而未加NGF的神經節(jié)培養(yǎng)24

4、h,未見神經突起生長。二新生大鼠、新生小鼠及雞胚背根神經節(jié)分散細胞培養(yǎng)背根神經節(jié)(DRG細胞起源于神經嵴， NGF研究先驅Levi-Montalcini的實驗表明，外原性NGF能刺激DRG細胞生長發(fā)育并形成廣泛的神經網絡。在體外，分離培養(yǎng)的神經節(jié)在 NGF存在的情況下，神經突起的生長在一天之內可長達數毫米，因此，利用培養(yǎng)的DRG細胞，進行軸突生長發(fā)育的研究，是最為經典而常用的方法之一。1 材料和方法取新生一天的大鼠 (wistar 種)和小鼠 (昆明種) 。用眼科剪在無菌條件下除去背部皮膚 , 然后剪取一段脊髓 , 背側朝上置于滅菌毛玻璃片上 , 在解剖顯微鏡下沿椎管兩側水平剪除腹側 一半椎骨

5、 , 暴露脊髓和神經節(jié) , 用解剖鑷分離出神經節(jié)。 雞胚背根神經節(jié)的取材方法同前。 剝 除神經節(jié)被膜，用0.125%胰蛋白酶消化(37 C 30min)分散后用種植(Plating)培養(yǎng)液稀釋成 0.2 x 105個細胞/ml密度的細胞懸液，接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿2ml細胞懸液置。置標本于 36C、10%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內種植培養(yǎng)液，改用飼 養(yǎng)(Feeding)培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種第 3d,在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15卩g/ml和尿苷35卩g/ml以抑制非神經細胞的增殖，作用48 h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液， 以后每周換液

6、兩次 , 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。2. 培養(yǎng)液成份種植培養(yǎng)液：80%Eagle's DMEM含葡萄糖 600mg/100ml、NaHCO3.7g/L);10% 胎牛血清；10% 馬血清;NGF 20ng/ml;谷氨酰胺100卩g/ml。脫氧核糖核酸酶I 40卩g/ml。飼養(yǎng)培養(yǎng)液 ： 95%Eagle's DMEM( 含葡萄糖 600mg/100ml、 NaHCO3 3.7g/L,) ；5 % 馬血清；NGF 20ng/ml ；神經營養(yǎng)素 1ml/100ml ;谷氨酰胺100卩g/ml。3 新生大鼠背根節(jié)神經元的生長分化和形態(tài)特征新生大鼠背根節(jié)神經元接種后4h,大部分細胞可

7、貼壁，呈圓形或橢圓形，直徑8-14卩m,胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈。神經元的細胞核位于中央或偏于胞體一側, 核仁明顯 , 亦可見雙核神經元。接種后 24h, 大部分貼壁細胞開始長出突起。其中多數為具有多個突起的多極神經元,少數為雙極和假單極神經元 , 突起細長 , 并可觀察到突起末端的生長錐。 除單個散布的神經元 外 , 還常見到幾個或多個神經元聚集在一起 , 它們向四周發(fā)出樹枝狀的神經突起。 培養(yǎng) 2-3d 后神經元的突起逐漸增多并延長 , 形成稀疏的神經網絡。隨著培養(yǎng)時間的延長 , 神經元突起 的主干和分枝明顯延長并增粗 , 神經突起網絡變得更加稠密 , 神經元胞體逐漸增大。 大鼠背根 節(jié)神經元

8、可維持培養(yǎng) 2 個月。4 新生小鼠背根節(jié)神經元的生長分化和形態(tài)特征 新生小鼠背根節(jié)神經元的形態(tài)結構和生長分化基本上與新生大鼠相似, 但小鼠背根節(jié)神經元的胞體較大鼠稍小。 神經元亦隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大。 小鼠背根節(jié)神經元亦可 維持培養(yǎng) 2 個月。5 雞胚背根節(jié)神經元的生長分化和形態(tài)特征 雞胚背根節(jié)神經元的生長分化基本上亦與新生大鼠和小鼠相似。但雞胚背根節(jié)神經元以 假單極為多見。 與大鼠或小鼠背根節(jié)培養(yǎng)神經元相比 , 神經突起分枝較少。 神經元胞體稍小 , 神經元亦隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大。雞胚背根節(jié)神經元亦可維持培養(yǎng)2 個月。三. 新生小鼠頸上交感神經元分散細胞培養(yǎng)交感神經系統(tǒng)在維持

9、機體的正常功能和對環(huán)境的適應性反應中起著十分重要的作用。交感神經細胞培養(yǎng)特別有助于神經細胞發(fā)育和可塑性研究，利用體外培養(yǎng)系統(tǒng)可進行交感神經 細胞的發(fā)生、死亡、形態(tài)和生化發(fā)育、遞質表形的獲得，以及靶組織與傳入纖維的突觸形成 的研究。此外，通過體外培養(yǎng)系統(tǒng)可獲得關于神經營養(yǎng)因子、激素，細胞因子等調節(jié)交感神 經元發(fā)育的信息，了解傳入纖維的輸入以及與靶組織的聯(lián)系的機制。1 材料和方法實驗用出生當天的昆明種小鼠， 在無菌條件下腹部朝上固定于塑料泡沫板上 , 用微解剖鑷 在解剖顯微鏡下找到氣管兩側的頸總動脈 , 并以此為標志 , 在頸總動脈分為頸內外動脈交叉處 找到上頸交感節(jié) , 取出上頸交感節(jié) , 置于

10、含 1 % 膠元酶 (Collagenase) 和 1 % 消化酶 (Dispase)的2ml混合消化液中消化(37 C, 1 h)分散后，用種植(Plating)培養(yǎng)液稀釋成0.2 x 105個細胞/ml密度的的細胞懸液；接種于涂有小牛皮膠或以小鼠腦皮層膠質細胞為背景的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿 2ml細胞懸液置。置標本于 36C、10%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾 去培養(yǎng)皿內種植培養(yǎng)液 , 改用飼養(yǎng) (Feeding) 培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種第 3d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細 胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15卩g/ml和尿苷35卩g/ml,作用48 h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng) 液 , 以后

11、每周換液兩次 , 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。2 培養(yǎng)液成份種植培養(yǎng)液：80%Eagle's DMEM含葡萄糖 600mg/100ml、NaHCO3.7g/L) ; 10呱臺牛血清；10% 馬血清；NGF 20ng/ml;谷氨酰胺100卩g/ml。脫氧核糖核酸酶I 40卩g/ml。飼養(yǎng)培養(yǎng)液 ： 95%Eagle's DMEM( 含葡萄糖 600mg/100ml、 NaHCO3 3.7g/L,)； 5%馬血清； NGF20 ng/ml;神經營養(yǎng)素1ml/100ml ;谷氨酰胺100卩g/ml。3 新生小鼠交感節(jié)神經元的生長分化和形態(tài)特征新生小鼠交感節(jié)神經元在含 NGF 的培養(yǎng)液

12、中種植后 4h, 細胞即開始貼附在膠元薄膜或 在皮層膠質細胞層上生長 , 交感神經元的胞體一般為圓形 , 有時亦可見橢圓或梭形 , 體積較大 , 直徑約8-14卩m左右，胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈，神經元的細胞核大多偏于胞體一側，核仁明顯，亦可見雙核神經元 。接種后 24h, 大部分貼壁神經元開始長出突起。培養(yǎng) 2-3 天后 , 神經元 突起逐漸增多并延長 ， 形成稀疏的網絡。隨著培養(yǎng)時間的延長 ， 神經突起網絡變得更加稠密。 神經細胞的主干和分枝明顯延長并增粗 ， 神經元的胞體逐漸增大。小鼠交感神經元可維持培 養(yǎng) 1-2 個月。四 . 胚胎小鼠、大鼠、雞胚脊髓腹角運動神經元培養(yǎng)，中樞神經系統(tǒng)包括腦

13、和脊髓，脊髓是中樞的初級部分，其功能有二，一是傳導感覺和運 動沖動，二是完成軀體運動的基本反射。脊髓突然被橫斷并與高級中級失去聯(lián)系后產生脊休 克。因此，利用體外培養(yǎng)的脊髓腹角運動神經元進行脊髓損傷和修復的研究日益受到重視。1 材料和方法用 12-14d 胚齡的小鼠、 12-14d 胚齡的大鼠、 孵化 10 d 的雞胚，在無菌條件下取出胎 鼠或雞胚脊髓， 剝除脊膜后 ， 將整個脊髓腹側面朝上置于平皿中， 用微解剖鑷和雙面刀片沿脊 髓中央管縱切兩半，再將脊髓兩側的腹側部分切下，將組織塊切碎，用 0.125% 胰蛋白酶消5化（37 C 30min）分散后，用種植培養(yǎng)液（同第二節(jié)）稀釋成5X 10個細

14、胞/ml密度的細胞懸液， 接種于涂有小牛皮膠的 35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿2ml，置36C、10%CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h 后傾去培養(yǎng)皿內種植培養(yǎng)液 ， 改用飼養(yǎng)培養(yǎng)液 （同第二節(jié) ） 進行培養(yǎng)。 以后每周換液兩次 ， 每次 更換 50%的新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。2 胚胎小鼠、大鼠、雞胚脊髓腹角運動神經元的生長分化和形態(tài)特征 胚鼠和雞胚脊髓腹側神經元培養(yǎng) 12h 后， 大部分神經元可貼壁 ， 貼壁神經元呈圓形 ， 直徑5-8卩m,其中少數神經元開始伸出1-2個突起。培養(yǎng)24h后，神經元突起逐漸增多并延長 ，形成稀疏的網絡 ， 培養(yǎng)的脊髓神經元以雙極和多極為多見 ， 神經元呈圓形或橢圓形及多邊形不 等

15、， 胞核清楚 ， 多數具 1-2 個核仁。 隨著培養(yǎng)時間延長 ， 神經元突起進一步增多、 增粗并延長 ， 形成稀疏的神經網絡 ， 神經元胞體逐漸增大。 多極胞體大的神經元逐漸增多 ， 經膽堿乙酰轉 移酶（ChAT免疫組織化學染色和乙酰膽堿酯酶（AChE）組化染色呈陽性反應。此后，只要定期換液并適當抑制非神經細胞的過度增殖 ， 胚眙大鼠、胚盼小鼠和雞胚脊髓腹側運動神經元在 體外可維持培養(yǎng) 2 個月。五 . 新生大鼠海馬神經元分散培養(yǎng)海馬屬大腦邊緣系統(tǒng)，與情緒、學習及記憶有關，它具有明顯的長突觸傳遞的長時間程長時程增強（LTP）和長時程抑制（LDT）的能力。LTP和LDP具有協(xié)動性、特異性、長時性

16、 的特點， 目前已被認為是學習和記憶的基礎。 而且海馬組織常常是引起癲癇發(fā)作的病變部位， 并且海馬細胞對缺血、缺氧特別敏感。這些特征反映了海馬神經元的內在性。例如，對缺氧 的可塑性和易感性均與NMD（ N-methyi-D-aspartate, N-甲基-D-天冬氨酸）受體的獨特性質相關。海馬具有中樞神經系統(tǒng)的典型特性，有相對同源性的神經元群體，據估計，海馬主 要的細胞類型-錐體神經元占海馬全部神經元的85%-90%海馬CA1和CA2區(qū)含有的錐體細胞在電生理特性及其相互連接的形式上各不相同，并能分別進行培養(yǎng)。海馬錐體細胞具有特 征性的形態(tài)， 它們有單根軸突和數根樹突組成， 所有的樹突都高度分化

17、并密布樹突嵴。 此外， 海馬錐體神經元相互之間與中間神經元群體之間均有直接聯(lián)系，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)缺乏外源性 傳入纖維的情況下，海馬神經元相互間仍然能產生廣泛的突觸聯(lián)系。1 材料和方法取當天出生的 Wistar 大鼠 ， 在無菌條件下取腦、 分離出雙側海馬， 用 0.125%胰蛋白酶消化（36 C、30min）分散后,用種植培養(yǎng)液（同第二節(jié)）稀釋成5X 105個細胞/ml密度的細胞液,接 種于涂有小牛皮膠的 35mn塑料培養(yǎng)皿中,每皿2ml,置標本于36C ,含1O%C0勺培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。 24 h 后頃去培養(yǎng)皿內種植培養(yǎng)液 , 改用飼養(yǎng)培養(yǎng)液 （同第二節(jié) ） 培養(yǎng)。接種第 5 d, 在培養(yǎng)皿中 分

18、別加入細胞分裂抑制劑5'-氟-2'-脫氧尿苷15卩g/ml和尿苷35卩g/ml或加入阿糖胞苷3卩g/ml以抑制非神經細胞的過度增殖，作用48h后更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液2次，每次更換 50%新鮮培養(yǎng)液。2 新生大鼠海馬神經元的生長分化和形態(tài)特征新生大鼠海馬神經元種植后 12h, 大部分細胞可貼壁 , 呈圓形 , 其中少數神經細胞開始伸 出1-2個突起。培養(yǎng)24h后,伸出突起的神經細胞逐漸增多，突起一般為20-40卩m,長者可達60卩m培養(yǎng)3d后，神經元突起進一步增多并延長，形成稀疏的網絡。培養(yǎng)的海馬細胞以錐體細胞為多見，胞體較大，直徑6-12卩m隨著培養(yǎng)時間的延長，神經元胞

19、體逐漸增大，胞突主干 和分技明顯延長并增粗 , 形成更加稠密的網絡。海馬神經元在體外可維持培養(yǎng) 2 個月。 六新生大鼠隔神經元分散培養(yǎng)隔亦屬大腦邊緣系統(tǒng)，主要與一系例內臟活動、軀體活動，情緒活動有密切關系。1 材料和方法取當天出生的 Wistar 大鼠 ， 在無菌條件下取腦、分離出雙側隔區(qū)，培養(yǎng)方法同海馬神經 元培養(yǎng)。2 新生大鼠隔神經元的生長分化和形態(tài)特征新生大鼠隔區(qū)培養(yǎng)神經元的生長分化基本上與新生大鼠海馬神經元相似。但隔神經元大 多為具有兩個突起的雙極神經元，神經元胞體呈橢圓形，直徑6-8卩m隨著培養(yǎng)時間的延長，神經元胞體逐漸增大 ， 神經突起逐漸增粗 ， 并互相聯(lián)絡成網。 新生大鼠隔神經

20、元亦可持續(xù)培養(yǎng)2 個月。七新生大鼠下丘腦神經元分散培養(yǎng)下丘腦，作為神經系統(tǒng)和內分泌系統(tǒng)的連接點，在神經內分泌研究中有很重要的地位。 它不僅通過神經 - 神經，神經 體液通路與垂體發(fā)生直接的聯(lián)系，以興奮與抑制兩種不同的機 制維持垂體內分泌的相對恒定，而且與腦干網狀結構、皮質邊緣系統(tǒng)等共同調節(jié)機體的各種 活動。下丘腦的分泌功能以及其所分泌的各種肽類激素、神經多肽是下丘腦參與調節(jié)內臟活 動、生理機能以及垂體內分泌的重要物質基礎。1 材料和方法取當天出生的 Wistar 大鼠 ， 在無菌條件下取腦、分離出雙側下丘腦，培養(yǎng)方法同海馬神 經元培養(yǎng)。2 新生大鼠下丘腦神經元的生長分化和形態(tài)特征新生大鼠下丘腦

21、神經元的生長分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠隔神經元相似。培養(yǎng)的 下丘腦神經元大多為具有兩個突起的雙極神經元，神經元胞體呈橢圓形，直徑6-8卩m,偶見胞體較大（直徑9-12卩m）的多極神經細胞。隨著培養(yǎng)時間的延長，下丘腦神經元胞體逐漸增大。下丘腦神經元亦可維持培養(yǎng) 2 個月。 八新生大鼠大腦皮層神經元分散培養(yǎng)大腦皮質是大腦半球最外表的一層灰質， 大腦皮質內神經元的數量極大， 其類型也很多， 但均屬多極神經元，神經元之間具有復雜的聯(lián)系，反映皮質的高度發(fā)展。有人從機能上將皮 質分為：感覺皮質、聯(lián)絡皮質、運動皮質。1 材料和方法取當天出生的 Wistar 大鼠 ， 在無菌條件下取腦、分離出雙側皮層，培

22、養(yǎng)方法同海馬神經元培養(yǎng)。2 新生大鼠大腦皮層神經元的生長分化和形態(tài)特征新生大鼠皮層元的生長分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠海馬神經元相似。培養(yǎng)的皮層神經元中既可見到體積較大 （直徑8-12卩m）的錐體細胞和顆粒細胞（如星狀細胞、籃狀細胞和 梭形細胞 ）, 也可見到馬提諾蒂細胞 , 胞體較小 , 呈三角形或多角形。隨著培養(yǎng)時間的延長, 神經元胞體逐漸增大 , 突起增粗。新生大鼠皮層神經元亦可持續(xù)培養(yǎng) 2 個月。 九新生大鼠紋狀體神經元培養(yǎng)位于大腦皮質下，緊靠丘腦背外側的幾塊灰質，稱為基底神經節(jié)，它們包括尾狀核、殼 核和蒼白球，前兩者合起來又稱為紋狀體。紋狀體是中樞神經系統(tǒng)的高級部位，在這里進行 著

23、運動機能的最高級整合，它們與隨意運動的穩(wěn)定、肌緊張和軀體運動的整合有密切關系。 中腦黑質除含有較多的多巴胺（ DA神經元外，還含有丫 -氨基丁酸（GABA神經元等，紋狀 體是其主要的靶組織，共同組成黑質紋狀體DA系統(tǒng)。1 材料和方法取當天出生的 Wistar 大鼠 ,在無菌條件下取腦、分離出雙側紋狀體，培養(yǎng)方法同海馬神 經元培養(yǎng)。2 新生大鼠紋狀體神經元的生長分化和形態(tài)特征 新生大鼠紋狀體神經元的生長分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠隔神經元相似。培養(yǎng)的 紋狀體神經元大多為具有兩個突起的雙極神經元，神經元胞體呈橢圓形，直徑6-8卩隨著培養(yǎng)時間的延長 , 紋狀體神經元胞體逐漸增大。紋狀體神經元亦可維

24、持培養(yǎng) 2 個月。 十新生大鼠中腦黑質神經元培養(yǎng)黑質由中腦背側的致密部和腹側的網狀部組成，中腦黑質是多巴胺神經元存在的部位， 實驗表明，大鼠中腦腹側多巴胺在運動和行為中起著關鍵性的作用。黑質多巴胺能神經元退 性病變可引起帕金森綜合癥。因此，多巴胺神經元的體外培養(yǎng)為多巴胺神經元的形態(tài)、受體 分布、藥物作用、電生理特性的研究以及多巴胺神經元移植研究提供了較好的實驗手段。1 材料和方法取當天出生的 Wistar 大鼠 ， 在無菌條件下取腦、分離出雙側黑質，培養(yǎng)方法同海馬神經 元培養(yǎng)。2 新生大鼠中腦黑質神經元的生長分化和形態(tài)特征新生大鼠中腦黑質神經元的生長分化和形態(tài)特征基本上和新生大鼠下丘腦神經元相

25、似。培養(yǎng)的中腦黑質神經元大多為具有兩個突起的雙極神經元，神經元胞體呈橢圓形，直徑6-8卩m,隨著培養(yǎng)時間的延長，中腦黑質神經元胞體逐漸增大。中腦黑質神經元亦可維持培養(yǎng)2個月。十一 .新生大鼠小腦神經神經元培養(yǎng)小腦由外層的灰質（皮質） 、內部的白質和三對深部的核團（頂核、間位核和齒狀核）組成。與大腦皮質相比,小腦皮質的結構和神經元環(huán)路的組成相對簡單,整個小腦皮質共有三 層結構：分子層、浦肯野細胞層和顆粒層。其中含有五種神經元,即顆粒細胞,浦肯野細胞、 籃狀細胞、星形細胞和高爾基細胞。小腦是中樞神經系統(tǒng)中最大的運動機構,主要作用是維 持軀體平衡,調節(jié)肌肉張力和協(xié)調隨意運動。小腦的另一個與運動有關的

26、重要功能是在技巧 性運動的獲得和建立過程中發(fā)揮運動學習的作用。在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中,小腦細胞大小和形態(tài) 的特征明顯,容易識別。另外,小腦缺陷神經突變的小鼠種系比較多,這些條件都使小腦細 胞成為發(fā)育研究的良好對象。1 材料和方法取當天出生的 Wistar 大鼠 ， 在無菌條件下取腦、分離出雙側小腦,培養(yǎng)方法同海馬神經 元培養(yǎng)。2 新生大鼠小腦神經細胞的生長分化和形態(tài)特征新生大鼠小腦神經元的生長分化基本和新生大鼠皮層神經元相似。培養(yǎng)的小腦神經元以顆粒細胞為多見，體積較小，直徑3-5卩m,亦可見到一定數量的星狀細胞 ，哺肯野細胞和籃狀 細胞（胞體直徑6-8卩m）,它們均隨著培養(yǎng)時間的延長 ,神經元胞體逐

27、漸增大,突起逐漸增粗。 新生大鼠小腦神經元亦可持續(xù)培養(yǎng) 2 個月。十二新生大鼠腦腺垂體細胞培養(yǎng)大鼠的垂體分為前、中、后三葉，前葉亦稱腺垂體，主要分泌生長激素、催乳素、各種 促激素及黑素細胞刺激素。因此建立體外培養(yǎng)腺垂體細胞的方法，可用來探討各種因素直接 對細胞分泌功能的影響，以及開展神經內分泌分子生物學的研究。1 材料和方法取當天出生的 Wistar大鼠,在無菌條件下分離出腺垂體， 用0.125%胰蛋白酶消化（36 C、 30min）分散后，用種植培養(yǎng)液（同第二節(jié)）稀釋成2X 106個細胞/ml密度的細胞液，接種于涂有 小牛皮膠的 35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿2ml,置標本于 36C,含10%C

28、O勺培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。 24 h 后頃去培養(yǎng)皿內種植培養(yǎng)液 ,改用飼養(yǎng)培養(yǎng)液 （同第二節(jié) ）培養(yǎng)。以后每周換液 2次,每次更換 50%新鮮培養(yǎng)液。2 新生大鼠腦腺垂體細胞的生長形態(tài)特征接種后 24h, 新生大鼠腦腺垂體分散細胞即開始貼附在膠元薄膜上生長 , 腦腺垂體細胞最 初分散或聚集成小團 , 隨后迅速分裂增殖。細胞境界清楚 , 形狀不規(guī)則 , 有圓形 , 卵圓或多角 形。核位于胞體中央或偏于胞體一側 , 可見 1-2 個核仁。隨著培養(yǎng)時間的延長 , 腦腺垂體細胞 胞體逐漸增大 , 形成單層 , 鋪滿皿壁底層。腦腺垂體細胞可持續(xù)培養(yǎng) 1 個月。十三 神經膠質細胞培養(yǎng)（一）雪旺細胞雪旺細胞（Sch

29、wann cell , SC是外周神經系統(tǒng)最主要的膠質細胞，也是外周神經的成髓 鞘細胞； 它形成髓鞘， 或包裹軸突而不形成髓鞘。 雪旺細胞的功能極其活躍， 一旦神經受損， 它能反應性分裂增殖，分泌神經營養(yǎng)因子，產生細胞外基質和細胞粘附分子，對神經元及其 軸突起營養(yǎng)和修復作用。近年來的研究表明，雪旺細胞也能促進中樞神經對脫髓鞘損傷的修 復，如對脊髓的再生， 對視網膜神經節(jié)以及對隔 -海馬通路再生等。 說明雪旺細胞也能改善中 樞神經再生的微環(huán)境，因而近年來對雪旺細胞的研究，尤其是體外培養(yǎng)研究已成熱點。1 材料和方法雪旺細胞培養(yǎng)取材于各類哺乳動物的外周神經和背根神經節(jié)，取孵化8-12d 雞胚、出生1

30、-3d 的小鼠或大鼠和人工流產的人胎兒， 在無菌條件下用解剖鑷分離出神經節(jié)， 剝除神經節(jié) 被膜，用0.125%胰蛋白酶消化（37 C 30min）后用培養(yǎng)液（90% DMEM 10 %胎牛血清，2mM 谷氨酰胺）吹打分散成細胞懸液，先接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中孵育30 min后，翻轉瓶子吸出細胞懸液，除去已貼壁的成纖維細胞，再接種于涂有鼠尾膠的 35mn塑料培養(yǎng)皿中，種 植密度為0.2 x 105個細胞/ml，每皿2ml細胞懸液置。置 36C、10%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種 第3 d,在培養(yǎng)皿中分別加入細胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15卩g/ml和尿苷35卩g/ml ,以進一步

31、去除成纖維細胞 , 作用 48 小時后更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液兩次 , 每次更換一 半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。2雪旺細胞的生長和形態(tài)特征培養(yǎng)15d后可獲得較高純度的雪旺細胞，雪旺細胞呈雙極梭狀，核卵居中，相互平行排列， 經 S-100 免疫組織化學染色呈陽性反應。增殖分裂的雪旺細胞可用于進一步傳代培養(yǎng)，也可 進行冷凍保存?zhèn)溆?。（二）星形膠質細胞 星形膠質細胞是膠質細胞中體積最大，數量最多的一種，胞體呈星形，核大，呈卵圓 形，染色質稀少，星形膠質細胞分兩類，一類為原漿性星形膠質細胞（protoplasmicastrocyte ），其突起短粗，分枝多。另一種為纖維性星形膠質細胞（ fibrous as

32、trocyte ）， 它的突起細長，分枝少。纖維性星形膠質細胞是與少突膠質細胞源自同一前體細胞。星形膠 質細胞具有多種功能，中樞神經系統(tǒng)內神經元及其突起間的空隙幾乎全部由星形膠質細胞充 填，起結構的支持作用，星形膠質細胞的突起構成血腦屏障，星形膠質細胞能攝取和代謝某 些神經遞質如丫-氨基丁酸等。調節(jié)局部神經遞質的濃度，使神經網絡能平穩(wěn)地發(fā)揮作用。 還能吸收細胞間隙中過多的 K+,為K+的存儲庫，通過調節(jié)K+的水平而影響神經元的電生理活動。 星形膠質細胞能合成和分泌大量神經營養(yǎng)因子，有維持神經元生存和促進神經元突起生長的 作用，亦能分泌白細胞介素，腫瘤壞死因子和干擾素等多種細胞因子，星形膠質細胞

33、有分裂 能力，在中樞神經系統(tǒng)損傷后，星形膠質細胞增生、肥大，填補缺損，形成膠質瘢痕。（ 1 ）方法和結果選擇出生2d的SD大鼠，無菌條件下分離出大腦皮層，用0.125%胰蛋白酶消化（37 C30min）后用培養(yǎng)液（90% DMEM 10 %胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成細胞懸液，先 接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中孵育 30 min 后，翻轉瓶子吸出細胞懸液，除去已貼壁的成 纖維細胞，再接種于涂有鼠尾膠的75cm2塑料培養(yǎng)瓶中，種植密度為1X 105個細胞/cm2,每瓶10ml細胞懸液置。置 36 C、10%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液 2次，培養(yǎng)10-14h，細胞分 為兩層, 下一層為 I

34、 型膠質細胞即原漿形膠質細胞, 上一層是 O-2A 前體細胞, 根據兩類細胞 貼壁能力的差異，以振蕩培養(yǎng)技術進行分選，在37C搖床上振蕩，16 h （180r/min ） O-2A2前體細胞可被搖下來，搖下來的細胞種植在涂有鼠尾膠的75mcm塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液使用20 %胎牛血清促進O-2A前體細胞分化為II型膠質細胞即纖維型膠質細胞?？煞至言鲋车脑?漿形膠質細胞和纖維型膠質細胞可用于進一步傳代培養(yǎng),也可進行冷凍保存?zhèn)溆?。純度鑒定 可用膠質纖維酸性蛋白抗體（ GFAP染色確定。（三）少突膠質細胞1 方法和結果少突膠質細胞培養(yǎng)方法同星形膠質細胞培養(yǎng)。 少突膠質細胞比星形膠質細胞小, 光鏡下 少突膠質細胞胞體呈圓形或多角形,突起呈串珠狀,根據其所在部位的不同可分為束間少突 膠質細胞、神經元周圍少突膠質細胞。在中樞神經系統(tǒng)內,少突膠質細胞主要形成及維持髓 鞘。討論在神經生理、 生化和神經藥理的研究中、 神經細胞的體外培養(yǎng)日益受到重視，因為它是研究單個神經細胞功能和結構的適宜方法。在體外培養(yǎng)條件下背根神經節(jié)、頸上交感節(jié)、胚胎 脊髓和不同腦區(qū) （海馬、隔、下丘腦、大腦皮層、小腦和垂體細胞等）培養(yǎng)細胞的形態(tài)特征都不盡相同,這與它們具有不同功能有關。交感和感覺神經元以及不同腦區(qū)神經元的體外培養(yǎng) 成功 ， 為我們深入研究它們的結構和功能提供了合適的體外實驗模