一種血型凝集反應(yīng)檢測的集成光纖微流控裝置

1、一種血型凝集檢測的集成光纖微流控裝置Melur K. Ramasubramanian & Stewart P. Alexander摘要：在本文中，描述了一種關(guān)于血型交叉匹配凝集反應(yīng)檢測的集成光纖微流控芯片裝置。這個(gè)裝置主要組成是由在注射泵的作用下把發(fā)生反應(yīng)的紅細(xì)胞懸浮液注入到一條直微流控溝道。這些液體與光纖交叉配對所產(chǎn)生的光學(xué)路徑被發(fā)射器接收并集成到微流控裝置中。一個(gè)波長為650nm的激光二級管作為光源，一個(gè)硅光電二極管用來檢測光強(qiáng)。兩根光纖末端的間隔可以進(jìn)行調(diào)節(jié)。當(dāng)光纖之間的間距過大和懸浮液的濃度過高時(shí)，散射現(xiàn)象將作為凝集檢測的主要原理。而當(dāng)濃度低和間隔小時(shí)，光電斷路現(xiàn)象將成為主要檢

2、測原理。通過數(shù)據(jù)計(jì)算出凝集強(qiáng)度因子。在對各種血型的研究表明，遙感方法能夠正確識別各種情況下的凝集反應(yīng)。將來臨床輸血前的檢查實(shí)施方法可以用一種一次性的集成裝置設(shè)計(jì)出來。關(guān)鍵詞： 紅細(xì)胞；凝集反應(yīng)；輸血；交叉匹配；散射；微流控芯片；光纖；光電斷路；血型1 簡介不法輸血的主要原因是人為錯(cuò)誤。涉及ABO血型的事件（以A型、B型、O型為分組）通過失敗的組織和管理在測試過程和分析中可能會出現(xiàn)不兼容性，有很大一部分的這類錯(cuò)誤發(fā)生在臨床。對病人錯(cuò)誤的輸血管理仍是產(chǎn)生急性溶血性輸血反應(yīng)的主要原因，其中經(jīng)常出現(xiàn)在對病人的錯(cuò)誤辨識。它還表明，執(zhí)行臨床兼容測試的可靠性是由培訓(xùn)者的培訓(xùn)和經(jīng)驗(yàn)為主要決定因素。最終的交叉匹

3、配和兼容性測試是作為一個(gè)故障保護(hù)機(jī)制用來防御可能出現(xiàn)在輸血過程中的任何時(shí)間的潛在的致命性輸血錯(cuò)誤，并已用了半個(gè)多世紀(jì)。在法國，自1965年以來臨床輸血兼容測試（PBCT）是法定存在的。雖然它廣泛強(qiáng)調(diào)在輸血過程的每個(gè)階段都必須有嚴(yán)格的安全預(yù)防措施，對于臨床測試套件的改善一直主張要使過程方便簡潔和提高凝集反應(yīng)的檢測，包括自動化技術(shù)。交叉匹配自動化裝置的發(fā)展能消除在過程和主觀問題解讀中出現(xiàn)的錯(cuò)誤，以及消除病人對主要的ABO血型不相容的錯(cuò)誤辨識的風(fēng)險(xiǎn)，并且大大提高了輸血的安全性。當(dāng)前為高容量使用而設(shè)計(jì)的血型自動化裝備是復(fù)雜而且昂貴的機(jī)械裝置，并且在一個(gè)集中的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中使用。最近，一種為客觀量化紅細(xì)胞

4、的紫外光和可見光分光光度法被提出來了。在這種方法中，血型組的確定是通過比較光譜密度在665nm到1000nm而獲得。在數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，計(jì)算出了一種比較有價(jià)值的數(shù)據(jù)，稱之為凝集指數(shù)（AI）。AI值較小表明沒有凝集反應(yīng)發(fā)生，而較高的AI值則表明凝集反應(yīng)很強(qiáng)烈。這種方法需要使用分光光度計(jì)并且需要足夠?qū)I(yè)的人員進(jìn)行數(shù)據(jù)采集并計(jì)算出凝集指數(shù)。不管怎樣這種方法還是非常有希望和潛力使臨床病人輸血測試實(shí)現(xiàn)自動化和簡潔化。一種簡化的傳感器裝置已經(jīng)通過設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了它的可行性，通過不斷的對光纖交替設(shè)計(jì)的嘗試進(jìn)一步簡化了該裝置。這種簡化傳感器的設(shè)計(jì)已與分光光度法的步驟一樣完整。分光光度法設(shè)計(jì)最重要的方面仍然是仔細(xì)確

5、保樣品通過稀釋。在傳感器構(gòu)造中必須要使光學(xué)透鏡小心地按要求對準(zhǔn)。通過對光纖集成和信號調(diào)節(jié)的進(jìn)一步小型化使得這種傳感器電子產(chǎn)品的設(shè)計(jì)成為可能，但是可能會很復(fù)雜。按照血細(xì)胞的凝集程度的大小規(guī)模設(shè)計(jì)測試裝置，凝集反應(yīng)的效果將會被放大并能夠輕松檢測出來。在本文中，我們設(shè)計(jì)了一種簡單的光纖微流控集成裝置通過凝集細(xì)胞的規(guī)模和大小來檢測凝集反應(yīng)。圖一 微流控凝集裝置示意圖圖二 微流控芯片裝置圖1.1 背景為了設(shè)計(jì)這個(gè)傳感器，對血液的生理學(xué)的理解非常重要。這里給出一個(gè)簡短的概括。紅細(xì)胞數(shù)量占總血量的40-50%左右。人體的紅細(xì)胞是雙凹的球體，它的平均直徑為7.5m，邊緣圖4凝集傳感器裝置圖3 光電二極管放大電

6、路厚度為2.4m，中心厚度為1m。紅細(xì)胞的主要組成成分是血紅蛋白，它占細(xì)胞總重量的90% 。血型是紅細(xì)胞表面抗原類中的一種，并且隨后血漿中包含的抗體取決于對應(yīng)的紅細(xì)胞中的哪種血型抗原和對應(yīng)的血漿中的哪種互補(bǔ)抗體。存在在紅細(xì)胞中的A型抗原被定義為A型血；存在紅細(xì)胞中的B型抗原被定義為B型血；而紅細(xì)胞中同時(shí)存在A、B型抗原的定義為AB型血；紅細(xì)胞中沒有A型和B型抗原的定義為O型血。對于血型組ABO(A型、B型、O型)就是病人紅細(xì)胞抗體（抗體A或抗體B）試劑的混合配制成的，而另一個(gè)血型組是由血漿中試劑細(xì)胞的混合配制的。而Rh因子的分類是另一種重要的血型系統(tǒng)。按照紅細(xì)胞中是否存在Rh抗原而分類。如果有

7、Rh抗原那么就是Rh陽性，如果沒有Rh抗原那么是Rh陰性。Rh型血的定義來源于確定恒河猴體內(nèi)是否存在Rh抗原的基本測試?？贵wD被用來檢測Rh因子。因此當(dāng)用ABO系統(tǒng)和Rh系統(tǒng)進(jìn)行血型測試時(shí)，對結(jié)果進(jìn)行組合，叫做ABO陽性和ABO陰性。2 裝置設(shè)計(jì)當(dāng)凝集的紅細(xì)胞懸浮液稀釋后流向一條面積算的上足夠狹窄的通道時(shí)，凝集細(xì)胞能夠阻礙或者破壞光線的對準(zhǔn)。如果通道較寬且光束直徑較大，那么在光路中那些細(xì)胞將會引發(fā)可測量的向前分散現(xiàn)象，測量向前分散強(qiáng)度和它的依賴波長可以作為確定凝集反應(yīng)程度的方法。在本文中，我們提出了一種集成的光纖微流控裝置用來檢測凝集反應(yīng)。整體設(shè)計(jì)思路如圖1所示。在注射泵的作用下，發(fā)生反應(yīng)的紅

8、細(xì)胞懸浮液被抽到微流控溝道中。將一條合適的光纖插入到與微流控溝道中液體流動垂直的方向，并用激光通過光纖發(fā)射出來。而在光纖端口相反的另一端直接接上光源，另一光纖放置在穿過溝道并且由光電二級管探測器直接接收。光纖兩個(gè)末端端口的間距可以調(diào)節(jié)。從光電二級管接收到的光強(qiáng)通過信號調(diào)節(jié)電路被記錄成電壓。這個(gè)電壓和接收到的光強(qiáng)成正比，為使光纖間距比較緊密，小顆粒（單個(gè)紅細(xì)胞）通過的光路會變得微弱或者消失而光強(qiáng)幾乎是常數(shù)或者相對于平均值有較小的波動。當(dāng)凝集顆粒穿過光路時(shí)它們會引起光線的大幅度消失，因此通過的測量的光強(qiáng)和電壓信號也會顯著下降。圖5 步驟1的集成光纖微流控溝道。光纖間距為50m3 材料和方法3.1

9、微流控芯片光纖微流控裝置分成兩個(gè)步驟構(gòu)建而成。第一步，用適當(dāng)?shù)睦L圖程序繪出微流控溝道（例如Adobe Illustrator），并且用一臺噴墨打印機(jī)在透明的薄膜上打印出一張高分辨率（3556DPI）的圖片。微通道清晰的出現(xiàn)在通明薄膜上并且定位在路徑3，黑圈的直徑和路徑3正好相對應(yīng)。硅晶片，用來遮住打印出來的透明薄膜。制作微流控模型時(shí)硅晶片是用來當(dāng)做光滑的背襯。路徑3，硅晶片連接到勞瑞爾光致抗蝕劑涂料器的旋轉(zhuǎn)卡盤上，為實(shí)現(xiàn)所需要的厚度，在晶片和轉(zhuǎn)盤上涂上少量的光固化環(huán)氧樹脂膠（SU-8膠）。薄膜的厚度將會是完成微流控裝置所需要的溝道深度。一旦SU-8膠膜片成型，那么掩蓋在頂部的SU-8膠層將會在

10、紫圖6 樣本的生理鹽水溶液，AB型陽性裝置1。(a) 光電二極管輸出. (b) 信號柱狀圖外線下發(fā)生曝光。這是為了固化一部分暴露在外面的SU-8膠也就是溝道側(cè)面和金屬薄片其余未處理的部分。所有的沒反應(yīng)的SU-8膠部分都要被沖洗掉，只留下硅晶片上所需要的部分，將晶片上的模型通過150的烘烤使它硬化，經(jīng)過120分鐘后，模具就形成了。184硅酮樹脂膠基礎(chǔ)彈性體也是用來制作微流控裝備的，這種彈性體澆在位于淺盤底部的SU-8膠膜片上，184硅酮橡膠固化劑是用來固化裝置的，硅酮膠就這樣在SU-8膠膜片上成型。一旦硅酮膠成型就固化在SU-8膠膜片上，將它剝落后就會粘附在玻璃平板上形成流體通道。圖2顯示了這項(xiàng)

11、研究的微流控裝置的構(gòu)造圖，這兩個(gè)交叉通道分別是250m寬和125m深。在圖形的頂部可以看到一個(gè)硅膠孔，是通過泵把流體注入設(shè)備中用的。圖7 對照樣本，AB型陽性裝置1(a) 光電二級管輸出. (b) 信號柱狀圖圖8 A抗體樣本，AB型陽性裝置1 (a) 光電二極管輸出 (b) 信號柱狀圖為了方便處理將裝置固定在鋁板上，并把它牢固的夾在帶有彈性滑片的顯微鏡臺座的夾座上。將顯微鏡放在它的側(cè)面，這樣流體通道就是垂直的。這只不過是為了調(diào)整顯微鏡目鏡使得鏡片和視頻攝像機(jī)更容易的對接從而記錄下影像。相機(jī)用三腳架固定住，并且靠近裝置中水平放置的目鏡。此后，流體通過注射泵的壓力驅(qū)動，顯微鏡的傾斜對結(jié)果不會產(chǎn)生任

12、何影響。一根管道插入到洞孔進(jìn)入到微通道而管道的另一端插入到注射泵中。流體樣品通過注射泵以每分鐘0.5L的比例注入到裝置的每個(gè)部位。3.2 光纖垂直通道被用來流體的流通，水平交叉管道被用來引入檢測和測量凝集反應(yīng)結(jié)果的光纖。我們用了兩種不同的多模、低氧化、可見的紅外光纖，并用一根康寧SMF-28e的單模光纖進(jìn)行兩種不同的配置。第一種組合是把康寧SMF-28e光纖作為源光纖，而AFS 50/125光纖作為接收光纖。第二種組合是把AFS50/125光纖既作為源光纖也作為接收光纖。對于波長為630nm的光源，AFS50/105Y 和AFS105/125Y光纖的傳輸速度規(guī)定為99.99%/m，對于康寧SM

13、D-28e光纖的衰減為0.05dB/Km，在我們設(shè)計(jì)中，距離設(shè)計(jì)的很短，對所有的光纖而言衰減可以忽略不計(jì)的。AFS光纖由石英晶體熔合，直徑是50m或105微米，包層直徑為125m，丙烯酸脂涂層直徑為250m。而康寧SMD-28e光纖的纖芯直徑為8.2m，包層直徑為125m，涂層直徑為245m。然而康寧單模光纖的截止波長為1260nm，而模場直徑大約為9.2nm的光纖的截止波長在1310nm。用光源波長為650nm的光源通過激光二極管照射光纖上，那么單模光纖(SMF28-e)圖9 B抗體樣本，AB型陽性裝置1 (a) 光電二極管輸出 (b) 信號柱狀圖圖10 D抗體樣本，AB型陽性裝置1 (a)

14、 光電二級管輸出 (b) 信號柱狀圖可以轉(zhuǎn)換成多模光纖，進(jìn)一步發(fā)生色散的附加多模光纖在這些條件下變得更加有活性，但是在這個(gè)程序中它不受關(guān)注，由于光纖纖芯的尺寸問題，它的模場直徑比其他兩根光纖更小，因此在本文中，它是用來構(gòu)建更窄的光束。將光纖的涂層或者外層完整的去除掉，使得引入到流體通道的所有三根光纖的外層直徑都是125m。溝道的寬帶是250m、深度為125m。將剩余的光纖插入到水平的流體通道中防止流體泄露。在顯微鏡下，通過對光纖間距的調(diào)整使得光纖完全對齊。對三種不同的裝置進(jìn)行評估，裝置1和裝置2使用的第一種光纖組合（SMD-28光纖作為源光纖，AFS 50/150Y作為檢測光纖），而裝置三是用

15、的第二種光纖組合（AFS105/105Y既用來作為源光纖也用來作為檢測光纖）。裝置1的微流控溝道中光纖的間距是50m，而在裝置2中的間距是25微米。裝置3中的光纖間距就是完整的溝道寬度，即為250m。3.3 激光光源我們通常用廉價(jià)而且具有代表性的classA激光二極管用來做為一個(gè)紅色激光指針。波長大約是650nm（激光指針激光二極管的指定波長是從610nm到670nm），最大輸出功率為5mW。二極管通過一根小的毛細(xì)鋁管和光纖末端進(jìn)行耦合，并用黑膠帶進(jìn)行固定。在這個(gè)過程中會產(chǎn)生耦合損失，但在整個(gè)裝置中都是一個(gè)恒量，對結(jié)果不產(chǎn)生影響。3.4 電子接收器接收器是由一個(gè)硅光電二級管（Hamamatsu

16、 S1226-18BK）和一個(gè)信號調(diào)節(jié)電路組成。這種光電二級管專門把紫外可見區(qū)域設(shè)計(jì)為720nm，從而抑制紅外光靈敏度達(dá)到最大。信號調(diào)節(jié)電路如圖3所示。AD549是當(dāng)前一種超低偏置的電流輸入運(yùn)算放大器，OP7是一種超低補(bǔ)償電壓運(yùn)算放大器。R是反饋電阻，并且設(shè)置在5G。為了消除外部的電池干擾(EMI)，將整個(gè)電路安置在一個(gè)由電池組供電的金屬容器內(nèi)。輸入的光通過一個(gè)小孔從光電二極管的端口傳輸?shù)轿⒘骺匮b置的光纖中并進(jìn)入金屬場。輸出信號線通過一個(gè)小孔傳輸?shù)浇饘倨帘魏械臄?shù)據(jù)分析系統(tǒng)。這種屏蔽作用是重要的而且必要，因?yàn)橐粋€(gè)5G的電阻只能用在R上。電路中的噪聲在沒有屏幕作用的情況下從幾V降到5mV的有效值，

17、幾乎和有屏蔽作用的情況下相差三個(gè)數(shù)量級。圖11 裝置2 光纖間距為25m由于系統(tǒng)的非常微弱的光信號以至于需要進(jìn)行這樣的大型放大處理。雖然通過選擇大功率的激光二極管可以增加輸入功率。這項(xiàng)工作的目標(biāo)就是運(yùn)用簡單現(xiàn)成的部件使得功率需求變得更低以至于未來的集成微流控芯片裝置的研制可以基于這種設(shè)備而實(shí)現(xiàn)。即使這個(gè)大的研究設(shè)置中用到了離散的電子器件，但整個(gè)系統(tǒng)還是抽取了50mW的功率。如圖4所示為完整裝置圖。圖12 生理鹽水溶液樣本，AB型陽性裝置2. (a)光電二極管輸出 (b)信號柱狀圖圖13 對照樣本，AB型陽性裝置2，(a)光電二級管輸出 (b)信號柱狀圖3.5 數(shù)據(jù)采集國有的USB-6008數(shù)據(jù)

18、采集硬件裝置用來讀取信號調(diào)節(jié)電路中從OP7運(yùn)算放大器輸出的模擬電壓并把它連接到安裝了Labview軟件的電腦上。用一根同軸的電纜來連接從屏蔽電路到數(shù)據(jù)采集卡的輸出信息。3.6 樣品制備我們得到了一組來自杜克大學(xué)輸血服務(wù)醫(yī)療中心實(shí)驗(yàn)室捐贈的未經(jīng)測試的包括A+，A-，B+，B-，O+，O-和AB陽性血型的樣品。單克隆的抗體A、抗體B和多克隆的抗體D會對ABO血型組的起反作用。用于裝置1和2的紅細(xì)胞對照樣本是用20l來自捐贈的紅細(xì)胞樣本和2ml的生理鹽水樣本混合而成，而裝置3的對照樣品則是和0.2ml的生理鹽水混合而成。紅細(xì)胞測試樣本是將20l的紅細(xì)胞加到20l的抗體（抗體A、抗體B或抗體D三個(gè)的一

19、種）中而配成的。在5min內(nèi)，將混合物處于規(guī)定溫度在37的溫度下發(fā)生反應(yīng)，在被注入到微流控溝道前，加2ml的生理鹽水溶液到混合物中進(jìn)行稀釋。對裝置3來說，稀釋的時(shí)候?qū)?.2ml換成2ml的生理鹽水溶液。這樣不管凝集反應(yīng)是否發(fā)生，在任何情況下，對照樣本和凝集樣本中紅細(xì)胞的數(shù)量都是相同的。圖14 抗體A樣本，AB型陽性裝置2. (a)光電二級管輸出 (b)信號柱狀圖4 結(jié)果和討論AB陽性血型會與抗體A，抗體B和抗體D發(fā)生凝集反應(yīng)。因此，在本文中我們只需要詳細(xì)的記錄AB陽性血型的反應(yīng)結(jié)果。這個(gè)數(shù)據(jù)是通過測試其他血型而獲得的具有代表性的結(jié)果。對生理鹽水溶液、對照、抗體A、抗體B和抗體D樣本的實(shí)驗(yàn)測試裝

20、置提前進(jìn)行討論。生理鹽水溶液樣本是沒有紅細(xì)胞的純生理鹽水溶液，對照樣本而是將紅細(xì)胞和生理鹽水溶液以相同比例混合的，作為凝集反應(yīng)的樣本溶液，它僅僅只是沒有加入抗體。在將樣品注入到系統(tǒng)期間，通過數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)測量并用圖像描繪出來的整個(gè)裝置的光電二極管輸出為5kHz。圖5所示為裝置1中的顯微鏡觀察到的畫面。光纖間距為50m。圖6(a)描繪了生理鹽水溶液樣本中光電二極管輸出圖，信號保持在6.3V，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.005V，變化系數(shù)是0.000863.圖6(b)所示的柱狀圖從數(shù)據(jù)方面描述了每增加0.1V時(shí)該電壓值（光輸出）對應(yīng)的頻率大小。頻率是以半對數(shù)的比例描繪到圖上。在柱狀圖中分布比較狹窄的區(qū)域表示電壓時(shí)

21、穩(wěn)定的并且大部分實(shí)際測量值都非常接近于平均值。圖7(a)所示為AB型陽極紅細(xì)胞對照樣本的光電二級管輸出圖，凝集顆粒穿過光路時(shí)信號顯示沒有出現(xiàn)較大的峰值。探測器電壓的平均值是6.2V，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06，變化系數(shù)為0.01。信號產(chǎn)生波動時(shí)因?yàn)榧t細(xì)胞非均勻的穿過光路，從而紅細(xì)胞群同時(shí)會阻礙光的傳播和較小瞬時(shí)輸出電壓。圖7(b)所示的柱狀圖表示了標(biāo)準(zhǔn)偏差變的更大，分布更寬。圖8(a)所示為AB型陽性懸浮液和抗體A發(fā)生反應(yīng)的結(jié)果，在這里我們可以看到當(dāng)凝集的紅細(xì)胞群穿過光路時(shí)，電壓達(dá)到負(fù)方向的波峰。平均電壓為6.26V，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.09V，標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.015。盡管這標(biāo)準(zhǔn)誤差增長了圖15 抗體B樣本，

22、AB型陽性裝置2。(a)光電二級管輸出 (b)信號柱狀圖圖16 抗體D樣本，AB型陽性裝置2。 (a)光電二級管輸出(b)信號柱狀圖50%，但它并不完全影響凝集反應(yīng)的程度。通過計(jì)算出來的平均值大約超過30,000數(shù)據(jù)點(diǎn)(6min內(nèi)5kHz)，只有6個(gè)大的凝集顆粒交叉穿過缺口。但還是有很大并不是特別大的顆粒，它們產(chǎn)生的電壓接近5.75V。電壓分布柱狀圖可以很清晰的顯示出它們的分布，電壓和頻率是以0.1V的增量繪制的。因?yàn)榇蟛糠謹(jǐn)?shù)據(jù)都接近于平均值，所以少數(shù)處于峰值的數(shù)據(jù)并不改變對整個(gè)結(jié)果的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。由于峰值代表大的凝集顆粒通過光路，所以他們在凝集檢測中就會表示成很大的一片區(qū)域。圖8(b)所示的以半

23、對數(shù)比例繪制的柱狀圖描繪了凝集反應(yīng)中大量數(shù)據(jù)的傳播。為了強(qiáng)調(diào)即使樣本中只有一個(gè)強(qiáng)烈的凝集顆粒（如果不兼容將會全部退回到血液袋中），我們減去最小的平均電壓并除以平均值，因此觀察到的凝集反應(yīng)中反應(yīng)較差的部分就會更突出。這個(gè)值稱為歸一化信號值，生理鹽水溶液、對照和抗體A反應(yīng)樣品的歸一化信號值分別為0.003、0.079和0.382。圖9(a)所示為抗體B樣品反應(yīng)結(jié)果，可以看到抗體B樣本和一些大的凝集細(xì)胞的反應(yīng)比抗體A更劇烈。圖9(b)所示為柱狀圖并且歸一化信號值為0.58,。盡管有很多凝集細(xì)胞進(jìn)入到光路中，但平均值(6.17V)并沒有發(fā)生顯著變化。圖10(a)所示為抗體D的反應(yīng)，從幾個(gè)峰值可以看出，

24、當(dāng)凝集細(xì)胞穿過光路時(shí)反應(yīng)時(shí)呈陽性的。圖10(b)所示為柱狀圖，平均電壓為6.25V，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.15V，歸一化信號值為0.328。因此與抗體A、抗體B一般的反應(yīng)結(jié)果相比，抗體D只發(fā)生了微弱的反應(yīng)。將反應(yīng)樣本的歸一化信號值和對照樣本的歸一化信號值相除，就可以顯示出凝集反應(yīng)的程度。分別抗體A、抗體B和抗體D反應(yīng)樣本的歸一化信號值除以對照樣本的歸一化信號值(0.0027)，得到的歸一化信號比分別為4.85，7.35和4.16。由于光纖間距為50m，很多小的顆粒能夠同時(shí)出現(xiàn)在光路中并同時(shí)和更大的凝集顆粒相抵消，除了實(shí)際特別大的凝集顆粒?？s短光纖的間距同時(shí)減少光路中的顆粒數(shù)量，減少相抵消的小顆粒組的影

25、響，則更加明顯的凝集反應(yīng)就可以觀察的到。因此，通過研究并設(shè)計(jì)出了裝置2。這個(gè)裝置的參數(shù)和裝置1完全相同，唯一的不同之處就是光纖的間距變得更短了，如圖11所示，光纖的間距為25m。如圖6和圖12所示，分別將裝置1中的生理鹽水溶液樣本反應(yīng)結(jié)果對比，我們可以看到光纖的間距幾乎沒有什么影響。然而，兩個(gè)裝置（圖7和圖13）的對照樣本的結(jié)果顯示出了非常重要的不同之處,。裝置1（圖7）的歸一化信號標(biāo)準(zhǔn)值為0.0788，而裝置2（圖13）的歸一化信號標(biāo)準(zhǔn)值為0.0307，只是裝置一的一半左右。正如光纖的距離減少到一半一樣，光纖之間的空間體積也減少了一半。在凝集樣本中，裝置2中的大塊樣本在光路中占用的相對體積比

26、裝置1更多。這樣，通過匯集光纖減少光纖間距使得大塊樣本和反應(yīng)的小顆粒（噪聲）相抵消而看不見反應(yīng)。因此，這個(gè)裝置的信噪比就變得更高。圖14，15和16所示為凝集樣本的反應(yīng)結(jié)果，可以看到，整個(gè)裝置的噪聲水平都很低。圖中顯示的峰值更有可能是一個(gè)大的凝集塊而不是由許多小的凝集顆?；蚰瘔K合并而成的。通過移動光纖縮短間距使得裝置2的歸一化信號值降到裝置1的一半甚至更少。然而對于凝集樣本來說，減少率從20%變?yōu)?5%。對照，抗體A，抗體B和抗體D樣本的歸一化信號值分別為0.0307，0.3029，0.3158和0.2089。這樣歸一化信號值就提高了（抗體A，抗體B和抗體D分別為9.87，10.29和6.8

27、）。結(jié)果概括如表1?？s短光纖間距和減少光路中細(xì)胞數(shù)量或塊的體積效果一樣都可以使得信噪比增加，此外也可以將懸浮液以2:1的比例稀釋同時(shí)保持和裝置1相同的間距。圖17 裝置3 AB型陽性生理鹽水樣本 圖19 裝置3 AB型陽性對照樣本圖18 裝置3 AB型陽性對照樣本 圖20 裝置3 AB型陽性紅細(xì)胞強(qiáng)烈凝集抗 體A樣本 圖21 裝置3 AB型陽性抗體A樣本 圖23 裝置3 AB型陽性抗體B樣本 替代凝集反應(yīng)的數(shù)字表達(dá)式來自于凝集反應(yīng)柱狀圖中可觀測到的增長區(qū)域。因此，如圖12，13，14，15，16所示，凝集柱狀圖的對數(shù)頻率從0V到7V以0.1V的增量遞增用來共同表示凝集反應(yīng)的程度。進(jìn)一步，反應(yīng)樣

28、本的區(qū)域被對照樣本的區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)化并定義為凝集強(qiáng)度因子(ASF)。AB型陽性紅細(xì)胞裝置1和裝置2中抗體A，抗體B和抗體D反應(yīng)樣本的凝集強(qiáng)度因子數(shù)值如表2所示。結(jié)果顯示兩個(gè)裝置都能清楚的檢測到凝集反應(yīng)，但和1.0有著很大的不同。 在裝置3中，接收器和發(fā)射器光纖都是纖芯為105m且間距為250m以至于光路中與凝集有關(guān)的大顆粒組的散射光能夠被測量出來。紅細(xì)胞散射光和Mie散射理論的應(yīng)用就很好的建立出來了。250m的光纖間距遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于光纖束的直徑(105m)而且細(xì)胞的濃度更高了（用0.2ml的生理鹽水溶液代替裝置1和裝置2中使用的2ml的生理鹽水溶液），從而增加了光路中細(xì)胞在測量出來的體積中的數(shù)量，并放大了

29、散射效應(yīng)。 如果以相同的細(xì)胞的數(shù)量，那么每單位體積的凝集反應(yīng)只能產(chǎn)生很少的大顆粒。如果凝集反應(yīng)更加強(qiáng)烈，則顆粒的大小就會增加，單位體積的顆粒數(shù)量就會減少。然而較大的顆粒會交叉抵消掉一部分，那么立方體的體積比就會減少。每單位體積的總散射光較少，從而傳輸信號隨著顆粒尺寸的增大而增加。在另一方面，許多大型顆粒對光的阻礙的直接影響引起了裝置1和裝置2測量強(qiáng)度的驟然減少。因此，兩個(gè)裝置都說明了散射抵消了并阻礙了光前進(jìn)的方向。從平均值的負(fù)峰值的出現(xiàn)表示了凝集作用增加了平均信號水平和光的直接中斷影響。圖17所示為純生理鹽水溶液的光電二極管輸出，與裝置1和裝置2的生理鹽水溶液一樣，結(jié)果顯示信號時(shí)一個(gè)常量為6.

30、62V，標(biāo)準(zhǔn)偏差時(shí)0.008V。圖18所示為對照樣本在顯微鏡下的情形。如圖19所示，對照測試樣本的信號平均值是3.31V。和圖17中生理鹽水的結(jié)果相比，可以說明對照樣本中的自由紅細(xì)胞被阻礙了，或者被分散了，只有一半的光穿過間隙。圖20所示為抗體A的強(qiáng)烈凝集樣本，圖21顯示了抗體A的數(shù)據(jù)，和對照樣本一樣，相同的紅細(xì)胞數(shù)量應(yīng)該已經(jīng)穿過了間隙。他們最大的不同之處在于產(chǎn)生了少數(shù)凝集大顆粒。平均電壓增長到5.67V，這表示抗體A的凝集紅細(xì)胞群只阻礙或者散射了15%的光，圖22裝置3 AB型陽性抗體B樣本的適度凝集 圖24 裝置3 AB型陽性抗體D的微弱圖25 裝置3 AB型陽性抗體D樣本比對照樣本少了35%。圖22所示為抗體B樣本，而圖23所示為抗體B樣本的光電二極管輸出?？贵wB阻礙或散射了22%的光?？贵wD樣本以及它的光電二極管輸出如圖24和25所示。分別地，抗體D阻礙或者散了26%的入射光?？贵wA阻礙的光最少，這解釋了它的樣本的凝集反應(yīng)最強(qiáng)。通過顯微鏡可以直觀的看