實(shí)驗(yàn)室實(shí)習(xí)報(bào)告

1、西安交通大學(xué) 機(jī)械學(xué)院實(shí)驗(yàn)室實(shí)習(xí)報(bào)告陳萱 2130101001 一、 依托單位：?jiǎn)挝幻Q：先進(jìn)制造技術(shù)研究所研究方向：生物三維打印責(zé)任教師：連芩指導(dǎo)碩士生：毛偉時(shí)間及地點(diǎn)：七月三日至七月十四日；生物制造實(shí)驗(yàn)室二、 認(rèn)知內(nèi)容和方式：1、 了解所在研究室或課題組的研究方向、科研項(xiàng)目及特色成果。2、 觀摩或適當(dāng)參與科研工作，協(xié)助研究生完成有關(guān)儀器操作、數(shù)據(jù)記錄或處理等方面的工作，了解科學(xué)研究基本方法、基本過程。三、 實(shí)驗(yàn)相關(guān)實(shí)驗(yàn)名稱：無(wú)菌操作及細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過程：實(shí)驗(yàn)器具準(zhǔn)備（1）藍(lán)蓋瓶：洗潔精清洗，自來水沖洗干凈，放入烘箱烘干后在酸缸中浸泡，戴耐酸手套，撈出藍(lán)蓋瓶，自來水沖洗后用純凈水沖洗，放入烘箱

2、烘干蓋上瓶蓋，用錫箔紙包裹瓶蓋，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，滅菌完成后拿出放入烘箱烘干，烘干后放入紫外燈儲(chǔ)物柜中備用。（2）移液器一個(gè)完整的移液循環(huán)：槍頭安裝，容量設(shè)定，預(yù)洗吸頭，吸液，放液，卸去吸頭 槍頭：10 L， 100 L， 1000 L，均為一次性用品，使用后丟掉。 5ml 和 10ml 槍頭為循環(huán)使用，用過的丟入超聲清洗機(jī)中。裝配移液槍頭：將移液槍垂直插入吸頭，左右旋轉(zhuǎn)半圈，上緊預(yù)洗槍頭：為獲得較高的精度，吸頭需預(yù)先吸取一次樣品溶液，然后再正式移液，因?yàn)槲⊙宓鞍踪|(zhì)溶液或有機(jī)溶劑時(shí)，吸頭內(nèi)壁會(huì)殘留一層”液膜”，造成排液量偏小而產(chǎn)生誤差。 高溫和低溫不適合潤(rùn)洗。濃度和粘度大的液體，會(huì)產(chǎn)生誤差

3、，為消除其誤差的補(bǔ)償量，可由試驗(yàn)確定，補(bǔ)償量可用調(diào)節(jié)旋鈕改變讀數(shù)窗的讀數(shù)來進(jìn)行設(shè)定。在吸取有機(jī)溶劑或高揮發(fā)液體時(shí)，揮發(fā)性氣體會(huì)在白套筒室內(nèi)形成負(fù)壓，從而產(chǎn)生漏液，需要預(yù)洗四到六次，讓白套筒室內(nèi)的氣體達(dá)到飽和，負(fù)壓就會(huì)自動(dòng)消失（3）超凈臺(tái)使用前準(zhǔn)備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無(wú)誤后將其放置操作場(chǎng)所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開始消毒。操作野消毒：超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用 75酒精擦洗。然后紫外線照射 30min。在工作臺(tái)面消毒時(shí)不能將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不能過多或重疊放置否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果。洗手和著裝：帶手套，并于開始操作前要用 75酒

4、精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩?；鹧嫦荆菏紫纫c(diǎn)燃酒精燈。 酒精燈內(nèi)添加的是無(wú)水乙醇，不可過滿或者過少，添加至 2/3 為宜。以后一切操作，如安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。操作：進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。為拿取方便，工作臺(tái)面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。工作由始至終要保持一定順序性，組織或細(xì)胞在未做處理之前，勿過早

5、暴露在空氣中。實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：1、將alginate粉末 紫外光下照射12h 2、用去離子水配制3.5%alginate 3、配置4%CaCl2 通過過濾網(wǎng)滅菌4、預(yù)熱培養(yǎng)液、 PBS 液和胰蛋白酶5、培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞圖1：高分子溶液攪拌細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程：傳代前準(zhǔn)備：1） .預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、 PBS 液和胰蛋白酶的瓶子放入 37水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。2） .點(diǎn)燃酒精燈；準(zhǔn)備好將要使用的無(wú)菌培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶；取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。3）.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：不可倒置培養(yǎng)皿，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。4）

6、 .打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。胰蛋白酶消化；1） .加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用 PBS沖洗，加入適量胰蛋白酶液，消化液的量以蓋住細(xì)胞最好。2） . 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。3） .吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。吹打分散細(xì)胞：1） .吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。2） .吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入 10ml 離心管中。3） .平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以 1000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 3-5 分鐘。4） .棄上清液

7、，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入 2ml 培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。圖2：吹打分散細(xì)胞分裝稀釋細(xì)胞：1） .分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至 2-3 個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。圖3、4、5：分裝好的細(xì)胞2） .顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于 5×105/ml。最后要做好標(biāo)記。細(xì)胞計(jì)數(shù)：66細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)/ml） =4 個(gè)大方格內(nèi)活細(xì)胞數(shù)/4×104×稀釋倍數(shù)=16.5×104繼續(xù)培養(yǎng)：圖6：細(xì)胞在培養(yǎng)皿中貼壁生長(zhǎng)圖7：細(xì)胞在海藻酸鈉中封裝細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)過程

8、：（ 1）凍存前一天換液，取細(xì)胞形態(tài)好和無(wú)污染培養(yǎng)瓶換液。（ 2）凍存盒中液體為異丙醇，每?jī)龃?5 次后更換一次。 4預(yù)冷。（ 3）混合消化液消化細(xì)胞，終止消化后離心 1000 r/min， 5 分鐘，棄上清，加入 44預(yù)冷的冷凍保存液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為（ 1-2） ×106-107/ml。（ 5）將細(xì)胞懸液分裝至 2ml 凍存管中，每管 11.5 ml；將凍存管口封，貼上標(biāo)簽（ 6）放入 4 度預(yù)冷的程序性降溫盒中， -80 度冰箱過夜后取出放入液氮罐中。慢凍快融。細(xì)胞的復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)過程(由于設(shè)備故障未進(jìn)行，以下為理論了解)： 細(xì)胞復(fù)蘇的原則快速融化：必須將凍存在-196 液氮中的細(xì)

9、胞快速融化至 37 ，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。l 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1） .將水浴鍋預(yù)熱至 37 ，培養(yǎng)液預(yù)熱 37 后吸出 5 ml 放入無(wú)菌離心管中。2） .用 75酒精擦拭超凈臺(tái)，并紫外線照射 30 min。3） .在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。l 取出凍存管：1） .根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。2） .從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。l 迅速解凍：1） .迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。2） .約 1-2min

10、后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。吸取細(xì)胞懸液加入準(zhǔn)備好的 37培養(yǎng)液中。l 平衡離心：用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中 1000 r/min 離心 3 min。l 制備細(xì)胞懸液：1） .吸棄上清液。2） .向離心管內(nèi)加入 10 ml 培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。l 細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)：取待測(cè)細(xì)胞懸液 0.1 ml和 0.4%臺(tái)盼藍(lán) 0.1 ml，混勻，靜置 23 min。從計(jì)數(shù)板邊緣輕輕加 10 L 染色的細(xì)胞懸液，使之充滿在計(jì)數(shù)板與蓋玻片間的空隙；于顯微低倍鏡下計(jì) 4 角 4 個(gè)大方格內(nèi)的活細(xì)胞（透明未著色）和死亡細(xì)胞（細(xì)胞核著藍(lán)色）的總數(shù)，然后

11、用下式計(jì)算：細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)/ml） =4 個(gè)大方格內(nèi)活細(xì)胞數(shù)/4×104×稀釋倍數(shù)細(xì)胞活力=活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死亡細(xì)胞數(shù)） ×100計(jì)數(shù)時(shí)，對(duì)大方格邊緣壓線細(xì)胞應(yīng)計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右。七.培養(yǎng)細(xì)胞將符合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入 37 和 5CO2的培養(yǎng)箱內(nèi) 2-4 小時(shí)（或者 24-48 小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。初學(xué)者易犯錯(cuò)誤：1 水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到 37 。2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長(zhǎng)。3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。實(shí)習(xí)感受這次實(shí)習(xí)讓我了解研究室的一些相關(guān)實(shí)驗(yàn)，對(duì)部分的儀器操作有了基本的認(rèn)識(shí)，也擴(kuò)寬了我的視野。在以往的認(rèn)知里我認(rèn)為機(jī)械工程專業(yè)的