C小鼠免疫功能及細(xì)胞因子的作用

1、發(fā)醉黃黃對BALB/C小鼠免疫功能及細(xì)胞因子的作用作者：王曉波，劉殿武2,郭麗莉，王本華【摘要】目的研究發(fā)酵黃苣對小鼠免疫功能及細(xì)胞因子的影響。方法將小鼠隨機(jī)分成正常對照組、免疫抑制組、黃苣對照組和發(fā)酵黃苣低、中、高3個劑量組(劑量分別為1,2,5g/kg),飲水法喂飼小鼠，分別檢測以下指標(biāo)：小鼠胸腺和脾臟指數(shù)，淋巴細(xì)胞亞群，淋巴細(xì)胞增殖功能，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、IL-1、IL-2分泌。結(jié)果與免疫抑制對照組比較，發(fā)酵黃苣高、中劑量能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使CDSCD4、CD4/CD8明顯上調(diào)，促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力，促進(jìn)白介素-1(IL-1)和白介素-2(IL2)的產(chǎn)生(P均&

2、;lt;0.05)。結(jié)論發(fā)酵黃苣能提高機(jī)體的免疫功能，具作用機(jī)制與激活T細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群、巨噬細(xì)胞功能及促進(jìn)細(xì)胞因子分泌有關(guān)。【關(guān)鍵詞】發(fā)酵黃苣;免疫功能；細(xì)胞因子；小鼠黃苣作為常用的補(bǔ)益類中藥，具有補(bǔ)氣固表及健脾利肺的功效。目前國內(nèi)外現(xiàn)代研究也已證實(shí)，黃苣含有多糖、甘類、生物堿、黃酮、微量元素及其氨基酸等成分具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用1,2。為了進(jìn)一步開發(fā)傳統(tǒng)的中藥劑型，研究發(fā)酵黃苣對小鼠免疫系統(tǒng)及功能的作用，對傳統(tǒng)中藥的二次開發(fā)提供理論及應(yīng)用的可行性依據(jù)。1材料與儀器1.1動物及細(xì)胞株健康BALB/C小鼠，雌雄各半78周齡，體質(zhì)量1822g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；C57BL/

3、0雌性體質(zhì)量1820g,一級動物，合格證號：冀醫(yī)動字第04035號?；?小牛血清： 美國GIBCO司;胰蛋白酶、 曝噪藍(lán)（MTT）、 刀豆蛋白（ConA）為Sigma公司產(chǎn)品?？筎hy1、2;抗LST4抗Lyt2美國FLUKA公司;環(huán)磷酰胺，上海第二制藥廠制造，（CycloPhosPhamideCP）二甲基亞碉（DMSO購于上海化學(xué)試劑公司，其余試劑均為分析純。1.3儀器倒置顯微鏡（PM-10AD） ,OLYMOUS日本。 二氧化碳孵箱（TC2323美國SHEL.LA公司）;酶標(biāo)儀（奧地利J公司）。流式細(xì)胞儀，美國（FAC陽20）。2方法2.1動物分組處理與給藥BALB/C小鼠隨機(jī)分成6組，

4、每組7只動物，分別為生理鹽水對照組、環(huán)磷酰胺組、黃苣對照組、發(fā)酵黃苣小劑量組（1g/kg）、中劑量組（2g/kg）和高劑量組（5g/kg）。黃苣組（1g/kg）每天每只灌服0.5ml,對照組灌服等量生理鹽水。環(huán)磷酰胺組ip給藥連續(xù)3d造模。第8天各組頸椎脫臼處死小鼠，無菌取胸腺、脾測定。2.2臟器/體重比值測定實(shí)驗(yàn)結(jié)束，稱質(zhì)量、胸腺重、脾重，取小鼠脾臟和胸腺稱重（濕重），計(jì)算臟器指數(shù)（尸臟器重量（g）/動物質(zhì)量（g）x100%2.3小鼠脾細(xì)胞懸液的制備及脾淋巴細(xì)胞活力的檢測采用MTT法網(wǎng)小鼠分組與喂飼方法同上。無菌取脾，經(jīng)過研磨200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾、經(jīng)常規(guī)裂解紅細(xì)胞，hanks液洗滌，離心2次

5、，制得單細(xì)胞接種于96孔板（100膜孔），每組6個平行孔，每孔100/37日呆濕培養(yǎng)68h后， 每孔加MTT104繼續(xù)培養(yǎng)4h后， 每孔加入DMSO150w,1振蕩5min,紫色結(jié)晶完全溶解后于酶標(biāo)儀570nm測定A值。2.4小鼠脾細(xì)胞亞群測定（流式細(xì)胞儀）4將68周齡、體質(zhì)量（202） gBALB/C性小鼠隨機(jī)分成6組， 每組6只。 無菌取小鼠胸腺細(xì)胞，4%甲醛固定，預(yù)冷PBS青洗，加入熒光標(biāo)記的CDSCD4CD8單克隆抗體50%137C30min1000r/min離 心10min,加 入 熒 光 標(biāo) 記 的 二 抗 工 作 液50%137c30minRNase消化，1ml碘化丙咤，每份樣本

6、平均測定1X10妗，分析相應(yīng)陽性細(xì)胞的含量。2.5小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測定5小鼠分組與喂飼方法同上。按常規(guī)制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，置24孔培養(yǎng)板每孔加細(xì)胞懸液1ml,5%CO237W養(yǎng)2h,去上清液，用RPMI1640培養(yǎng)液洗去未貼壁細(xì)胞，每孔加入0.1%中性紅生理鹽水液1ml,5%CO237W養(yǎng)2h后， 甩棄中性紅， 并用預(yù)溫的BPS青洗未吸收的中性紅，吸水紙吸干，每孔加入細(xì)胞裂解液1ml,靜置4C過夜，用蒸儲水調(diào)零，于722分光光度計(jì)550nm處測定吸光度A值，A值表示巨噬細(xì)胞吞噬功能的強(qiáng)弱。2.6腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1的誘生及測定5小鼠分組與喂飼方法同上。將24孔板中貼壁純化的腹腔巨

7、噬細(xì)胞各孔加入LPS（冬濃度10g/m婚養(yǎng)24h后收獲上清，為誘生的IL-1粗品，-20日呆存待測。無菌取C57BL/6小鼠胸腺細(xì)胞，用10%小牛血清的RPM-1640清洗并調(diào)細(xì)胞濃度1X10仆/ml,加入96孔平底板，每孔0.1ml,同時加入1C端釋的誘生IL-10.1ml,ConA監(jiān)濃度2.5g/ml）0.1ml每只鼠3個復(fù)孔，置5%CO237C培養(yǎng)，用MTT比色法測定胸腺細(xì)胞的增殖。2.7脾細(xì)胞IL-2的誘生及測定6小鼠分組與喂飼方法同上。按常規(guī)制備脾細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為2.5X106/ml,置24孔板孔/1ml,加入ConA（濃度2.5區(qū)g/ml）1m孔，置5%CO237C培養(yǎng)40h后，收獲上清為誘生的1-2,-20日呆存待測。常規(guī)制備正常小鼠脾細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度2.5X1061/ml,加入96孔平底板，每孔0.1ml,加入1C8稀釋的誘