培本方拆方調(diào)節(jié)哮喘大鼠內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素作用途徑的實(shí)驗(yàn)研究

1、培本方拆方調(diào)節(jié)哮喘大鼠內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素作用途徑的實(shí)驗(yàn)研究         【摘要】  目的研究培本方對(duì)哮喘大鼠內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素（GC）各作用途徑的調(diào)節(jié)作用。方法采用OVA（卵蛋白）致敏、激發(fā)復(fù)制大鼠慢性哮喘模型，以阿斯美膠囊為對(duì)照藥，通過(guò)放免法檢測(cè)血清CORT（皮質(zhì)酮）、血漿ACTH（促腎上腺皮質(zhì)激素）和下丘腦CRH（促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素）的含量及免疫組化法檢測(cè)肺組織GCR（糖皮質(zhì)激素受體）的表達(dá)，探討培本方及其拆方對(duì)大鼠哮喘模型的部分作用機(jī)制。結(jié)果模型對(duì)照組較正常對(duì)照組CORT及ACTH含量均顯著降

2、低、GCR蛋白表達(dá)亦明顯降低、CRH含量無(wú)明顯改變；培本方全方組及拆方組改善CORT，ACTH，GCR的影響作用更為顯著。結(jié)論 調(diào)節(jié)內(nèi)源性GC的作用途徑可能是培本方抗哮喘作用的機(jī)制之一。 【關(guān)鍵詞】  培本方 拆方 內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素 哮喘 大鼠AbstractObjectiveTo study the adjustment of Peibenfang on the functional route of endogenous GC in asthma rats. MethodsAsthma rats model was established by OVA through sensi

3、tizing and challenging. Asimei Capsule was used as positive control medicine. By investigating CORT in blood serum, ACTH in blood plasma, CRH in hypothalamus and GCR in the lung issue, the effects of Peibenfang on asthma were observed.ResultsThe levels of CORT, ACTH and GCR in model group were lower

4、 than those in normal group; in Peibenfang group and Peibenfang compatibility group(part), these indexes increased remarkably. ConclusionOne of the mechanisms of Peibenfang against asthma is to adjust the functional route of endogenous GC in asthma.Key wordsPeibenfang;   Compatibility;

5、0;  Endogenous GC;   Asthma ;   Rats   哮喘反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致內(nèi)源性GC濃度下降，體內(nèi)低濃度的GC會(huì)加重哮喘的炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，同時(shí)不足的應(yīng)激激素反應(yīng)將增加過(guò)敏性哮喘的易感性，也許這是哮喘長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作的機(jī)理之一。培本方是由著名老中醫(yī)徐輝光教授積30余年臨床之經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)中醫(yī)“久病成虛”“緩則治本”的理論，獨(dú)樹(shù)一幟創(chuàng)立的以平補(bǔ)氣血陰陽(yáng)藥物為主組成的復(fù)方，作為支氣管哮喘患者緩解期用藥，在臨床上取得了較好的療效。本實(shí)驗(yàn)旨在探討培本方通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性GC的作用途徑用于哮喘防治的機(jī)制。1 

6、 材料和方法1.1  動(dòng)物雄性健康SD大鼠，清潔級(jí)，60只，體重（130±10）g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物批號(hào)：SCXK（滬）2003-0002。1.2  藥品、試劑及儀器大鼠CORT試劑盒，美國(guó)DSL；ACTH放免試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所；神經(jīng)肽-CRH放免藥盒，第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室；GCR一抗（R），美國(guó)Santa Cruz；免疫組化EnVision 試劑盒（即用型），丹麥Dako公司；卵蛋白OVA，美國(guó)sigma公司；402A超聲霧化器，江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備有限公司。實(shí)驗(yàn)所需中藥材由上?？禈蛑兴庯嬈邢薰咎峁?。阿斯美膠囊，日本三共

7、株式會(huì)社。1.3  動(dòng)物模型復(fù)制SD大鼠60只，隨機(jī)分成6組，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、培本方全方組、培本方拆方組（由全方中補(bǔ)益氣血的藥物黃芪、當(dāng)歸組成）、培本方拆方組（由全方中補(bǔ)益陰陽(yáng)的藥物淫羊藿、女貞子組成）、阿斯美組，每組10只。   于實(shí)驗(yàn)第0，7天，除正常對(duì)照組給予1%氫氧化鋁佐劑，各組動(dòng)物均以新鮮配制的致敏液（1 mg/ml OVA，溶于1%氫氧化鋁佐劑內(nèi)）作皮下注射，每鼠在兩側(cè)后足跖、腹股溝、腰、背、頸部共取10點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.05 ml，同時(shí)腹腔注射0.5 ml，共計(jì)1 ml。于實(shí)驗(yàn)第14天開(kāi)始，將大鼠置于自制霧化箱（40 cm×30 c

8、m×20 cm）內(nèi)，用超聲霧化器以霧化量0.8 ml/min霧化1%OVA生理鹽水溶液15 min，1次/d，以激發(fā)哮喘。正常對(duì)照組霧化以生理鹽水。 連續(xù)激發(fā)3周后，停止激發(fā)6 d，然后激發(fā)1次，24 h后處死。1.4   給藥方法于實(shí)驗(yàn)第14天開(kāi)始灌胃給藥，1次/d，直至處死前1日。培本方全方組、培本方拆方組、培本方拆方組、阿斯美組，分別按1 ml/100 g體重灌胃給予相應(yīng)的水煎液，給藥量分別為23.2，8.2，9.5，25.11 mg·kg-1·d-1。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組：按1 ml/100 g體重灌胃給予生理鹽水。1.5 

9、 標(biāo)本制備及檢測(cè)血液：25%烏拉坦4 ml/kg腹腔注射，腹主動(dòng)脈取血， 2 ml注入事先加入30 l EDTA-二鈉和40 l抑肽酶的離心管內(nèi)，立即顛倒混合，4靜置，離心取血漿；其余血液室溫靜置后離心，取血清。   肺組織：迅速開(kāi)胸，取出肺組織，適量剪取左肺上部，浸泡于10%中性甲醛緩沖液中固定，脫水石蠟包埋，制成4 m厚的切片。   下丘腦：斷頭，迅速摘取下丘腦，稱重后置入液氮內(nèi)，后轉(zhuǎn)入-70冰箱內(nèi)凍存。   血清CORT，血漿ACTH和下丘腦CRH均采用放射免疫分析法檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。  

10、肺組織GCR表達(dá)按丹麥 Dako公司免疫組化試劑盒Envision系統(tǒng)操作說(shuō)明進(jìn)行，每組隨機(jī)選取6張切片，用高清晰度圖文分析系統(tǒng)分析GCR陽(yáng)性細(xì)胞的平均總面積（average general area）和平均光密度（average OD）值，每張切片取2個(gè)視野，計(jì)算平均值。1.6   統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析，相關(guān)分析采用線性回歸法，所有資料的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 11.0 for Windows軟件包完成。2  結(jié)果2.1  各組大鼠血清CORT，血漿ACTH和下丘腦CRH水平的比較結(jié)果見(jiàn)表1。表

11、1  培本方拆方對(duì)大鼠血清CORT（略）   結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清CORT和血漿ACTH含量顯著降低（P0.01或P0.05），下丘腦CRH含量無(wú)明顯改變；與模型對(duì)照組比較，各給藥組均可以顯著升高CORT含量，可明顯升高ACTH含量的是培本方全方組和培本方拆方組（P0.01），明顯升高CRH含量的是培本方拆方組（P0.05）；與阿斯美組比較，CORT含量明顯升高的是培本方全方組和拆方組（P0.05），影響ACTH含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的是培本方拆方組（P0.05）。       

12、  2.2  各組大鼠肺組織GCR表達(dá)的比較結(jié)果見(jiàn)表2。表2  培本方拆方對(duì)大鼠肺組織GCR表達(dá)的影響（略）   結(jié)果顯示，GCR陽(yáng)性細(xì)胞可表達(dá)于肺內(nèi)各級(jí)支氣管，幾乎所有的類型的細(xì)胞都可以表達(dá)，免疫反應(yīng)主要定位于胞漿及胞核內(nèi)（見(jiàn)圖16）。由表2可以看出，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組GCR陽(yáng)性細(xì)胞的平均面積及平均光密度均明顯降低（均為P0.01）；與模型對(duì)照組比較，培本方全方組及拆方組能明顯升高GCR陽(yáng)性細(xì)胞的平均面積（分別為P0.01,P0.05），培本方全方組及培本方拆方，組能明顯升高平均光密度值（分別為P0.01，P0.05，P0.05），

13、阿斯美組無(wú)顯著影響。2.3  培本方影響哮喘大鼠CORT作用的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，培本方通過(guò)影響內(nèi)源性GC而發(fā)揮防治哮喘的作用與ACTH和GR有一定的相關(guān)性。表3   培本方影響哮喘大鼠CORT作用的相關(guān)分析（略）3  討 論   有不少臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，哮喘存在下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸不同程度的抑制現(xiàn)象13，體內(nèi)GC濃度不足，使哮喘炎癥反應(yīng)加重并增加過(guò)敏性哮喘的易感性，也許這是哮喘長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作的機(jī)理之一。 GC在體內(nèi)發(fā)揮作用依賴于與細(xì)胞內(nèi)GCR的結(jié)合，GCR是決定靶細(xì)胞對(duì)GC反應(yīng)性的關(guān)鍵因素之一。GCR缺陷在哮喘發(fā)病

14、機(jī)制中具有重要意義4，可能是導(dǎo)致哮喘發(fā)展、炎癥遷延的重要原因。有研究表明，哮喘患者腎上腺皮質(zhì)功能尚未受到明顯損害，其GCR功能即存在異常5。   目前用于治療哮喘的藥物以局部治療作用為主，亟待加強(qiáng)整體調(diào)節(jié)藥物的研發(fā)和應(yīng)用。以平補(bǔ)氣血陰陽(yáng)立法的培本方，由黃芪、當(dāng)歸、女貞子、淫羊藿等藥組成，扶正固本，長(zhǎng)于對(duì)機(jī)體的整體調(diào)節(jié)。曾通過(guò)大鼠同種被動(dòng)皮膚過(guò)敏實(shí)驗(yàn)、急性小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)、福氏完全佐劑小鼠氣囊法等實(shí)驗(yàn)，證實(shí)培本方具有良好的抑制炎癥介質(zhì)的釋放、抗炎、抗過(guò)敏、調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的免疫功能等作用6，7，為進(jìn)一步研究培本方的作用機(jī)制奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)方中黃芪能提高血漿皮

15、質(zhì)醇含量，增強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)的功能，可通過(guò)內(nèi)源性GC發(fā)揮協(xié)同作用，并減少外源性GC的應(yīng)用所引起的不良反應(yīng)8；淫羊藿可保護(hù)外源性GC對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺軸形態(tài)與功能的抑制，對(duì)NEI（神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫）網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)起重要的作用9；補(bǔ)陰藥女貞子煎液可促使ACTH（促腎上腺皮質(zhì)激素）的合成與釋放來(lái)影響腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞合成與分泌GC10?；谏鲜龅膶?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察培本方對(duì)哮喘大鼠內(nèi)源性GC各個(gè)作用環(huán)節(jié)的影響，探討培本方防治哮喘的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)抗原激發(fā)后，哮喘模型組動(dòng)物CORT和ACTH，GCR水平顯著降低，提示哮喘動(dòng)物存在內(nèi)源性GC功能缺陷。培本方全方組及拆方，組均能顯著改

16、善哮喘大鼠CORT水平，可明顯升高ACTH含量的是培本方全方組和培本方拆方組，能明顯升高GCR陽(yáng)性細(xì)胞的平均面積和平均光密度值是培本方全方組及拆方組，提示培本方防治哮喘的作用機(jī)制與調(diào)節(jié)內(nèi)源性GC有關(guān)，且此作用機(jī)制與方中補(bǔ)益陰陽(yáng)的部分關(guān)系更為明顯?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1沈自尹，施賽珠，查良倫，等補(bǔ)腎法防治哮喘及其內(nèi)分泌和免疫方面的觀察J.中醫(yī)雜志，1981，22（5）：341.2張海波，羅文侗，劉志民支氣管哮喘患者外周血白細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體的改變J.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，15（4）：310.3童舜華，吳敦序，包照日格圖，等小青龍湯對(duì)哮喘大鼠肺組織糖皮質(zhì)激素受體和-受體等水平的影響J.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1999，5（3）：18.4胡克糖皮質(zhì)激素受體與支氣管哮喘J.國(guó)外醫(yī)學(xué)·呼吸系統(tǒng)分冊(cè)，1994，14（2）：61.5劉輝國(guó)，牛汝楫，胡道楨支氣管哮喘患者外周白細(xì)胞糖皮質(zhì)激素的受體變化J.中華內(nèi)科雜志，1994，33（3）：150.6郭 忻，毛 平，耿 婭，等培本方抗炎免疫作用的研究J.中成