一種新型結(jié)締組織生長因子人源單鏈抗體的可溶性表達(dá)以及分離純化

1、一種新型結(jié)締組織生長因子人源單鏈抗體的可溶性表達(dá)以及分離純化 11-03-25 10:12:00 編輯：studa20 作者：范小波，茍麗霞，劉昭，沈子龍，劉乃豐，吳國球，奚濤【摘要】 目的：研究單鏈抗體(scFv)在不同載體和菌株中的表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)活性評價。方法：將人源化單鏈抗體的基因通過酶切、連接等生物技術(shù)的方法克隆到pET28a、pET32a和pETEI:X 3種不同的載體中，并選用不同的表達(dá)菌株進(jìn)行表達(dá)，觀察單鏈抗體的表達(dá)情況并對抗體的可溶性表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化，采用親和層析和分子篩層析對目的蛋白進(jìn)行純化，并在體外研究目的蛋白的生物學(xué)活性。結(jié)果：抗結(jié)締組織生長因子單鏈抗體在pET28

2、a/BL21(DE3)中不能表達(dá)，在pET32a/BL21(DE3)和pETEI:X/BLR(DE3)中均成功表達(dá)，但是在pETEI:X/BLR(DE3)中scFv抗體無法從內(nèi)含肽(intein)上裂解。scFv在pET32a/BL21(DE3)中表達(dá)量占總蛋白的30%左右，經(jīng)過兩步層析純化后純度達(dá)到85%以上。體外免疫試驗(yàn)顯示，目的蛋白具有良好的免疫學(xué)活性。結(jié)論：人源化抗結(jié)締組織生長因子單鏈抗體scFv在大腸桿菌中的表達(dá)需要分子伴侶，通過低溫表達(dá)策略在pET32a/BL21(DE3)中成功得到表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】 人源單鏈抗體; 結(jié)締組織生長因子; 彈性蛋白; 分離純化Abstract Obj

3、ective： To investigate the expression of a noval antiCTGF singlechian Fv(scFv) antibody within different plasmid and/or host cell and the in vitro immunoreactivity of this scFv antibody. Methods: In this study, a scFv antibody against CTGF/CCN2 with full human sequence was cloned into three differen

4、t vectors, pET28a, pET32a and pETEI: X, and expressed in BL21(DE3), BL21(DE3), BLR(DE3), respectively. In addition, we optimized the temperature for soluble expression of the scFv. The expressed target protein was then purified by using molecular filter and affinity chromatography, and the bioactivi

5、ty was also analyzed. Results: The scFv antibody could not be expressed in pET28a/BL21(DE3) while it was expressed well in pET32a/BL21(DE3) and pETEI: X/BLR(DE3). However, the scFv antibody could not be cleaved from the ELPinteinscFv fusion. After optimization, the fusion protein was overexpressed m

6、ainly as soluble form in pET32a/BL21(DE3) and approximately achieved 30% of total proteins. After purified with NiSepharose affinity chromatography, the fusion protein was cleaved with thrombin protease. Finally, the scFv was separated from the fusion partner by gel filtration chromatography, and th

7、e purity could reach over 85%. Immunoreactivity study demonstrated that this scFv we obtained had a special affinity towards CTGF/CCN2. Conclusion: The results show that this scFv should be expressed with a fused partner to achieve satisfied amount in E. coli. It is well expressed and purified in pE

8、T32a/ BL21(DE3).Key words human derived singlechain Fv antibody; connective tissue growth factor; elastinlike protein; separation and purification結(jié)締組織生長因子(CTGF)含有344個氨基酸，由生長因子結(jié)合區(qū)、整合素蛋白識別功能域、肝素和黏蛋白結(jié)合域以及二聚體作用位點(diǎn)4個分泌蛋白模塊組成1。在纖維化疾病中，組織生長因子(TGF)作為一個重要的細(xì)胞因子能調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)的形成，研究認(rèn)為胞外基質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)紊亂和肺纖維化、腎纖維化、肌營養(yǎng)不良以及其他的許多纖

9、維化相關(guān)疾病的發(fā)病密切相關(guān)1-2。然而，TGF是一個具有廣泛生理功能的細(xì)胞因子，大量研究顯示直接抑制TGF的生物學(xué)功能會抑制正常生理機(jī)能，從而對機(jī)體造成損害3。CTGF作為在纖維化疾病中TGF的一個主要下游分子，有望成為治療纖維化疾病的一個非常理想的靶點(diǎn)。單鏈抗體scFv由免疫球蛋白的可變區(qū)組成，分子量只有正?？贵w的1/54，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床治療和檢驗(yàn)。目前，片段抗體的生產(chǎn)大多采用原核表達(dá)，但是由于scFv抗體含有兩對二硫鍵，而原核細(xì)胞缺少翻譯后修飾，給scFv抗體的生產(chǎn)帶來了一定的技術(shù)難題。有文獻(xiàn)報道通過加入融合伴侶谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione Stransferas， GS

10、T)、硫氧還蛋白(thioredoxin， Trx)、麥芽糖結(jié)合蛋白(maltosebinding protein, MPB)可以幫助蛋白在細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)，增加可溶性，而且還具有較高的生物學(xué)活性5-6。1 菌株、載體和試劑1.1 菌株和質(zhì)粒大腸桿菌BLR(DE3)菌株和BL21(DE3)菌株購自New England Biolabs公司(Beverly, MA, USA),pET28a、pET32a購自novagen公司(Madison， Wisconsin，USA)，pETEI:X質(zhì)粒由普林斯頓大學(xué)David W Wood教授惠贈。1.2 試劑內(nèi)切酶Nco和Not購自New England

11、Biolabs公司;AntiCTGF scFv基因由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供7;LB培養(yǎng)基含0.2%葡萄糖、1.5%酵母提取物、2%酪蛋白、2%(NH4)2SO4、0.1% MgSO4、0.3% K2HPO4、1%NaCl，用作BL21的培養(yǎng)液;TB培養(yǎng)基(每升含12 g酪蛋白、24 g酵母提取物、2.31 g KH2PO4和12.54 g K2HPO4)用于BLR菌株的培養(yǎng)液;溶菌緩沖液(1 mmolL-1 TrisHCl、pH 8.5, 2 mmolL-1 EDTA, 0.1 mgml-1 lysoozyme)和裂解緩沖液(PBS緩沖液加上40 mmolL-1 BisTris、pH 6.2, 2

12、 mmolL-1 EDTA)用于pETEI:XEI:scFv表達(dá)的純化;羊抗鼠HRPIgG抗體、鼠抗CTGF/CCN2抗體和小牛血清購自R&D公司(USA);CTGF/CCN2標(biāo)準(zhǔn)品購自Peprotech公司(英國，倫敦);鎳親和柱和Sephadex gel G50購自Novagen公司(Madison, Wisconsin, USA)。本研究中所使用的其他試劑均為分析純。2 方 法2.1 Scfv抗體表達(dá)載體的構(gòu)建2.1.1 pET32aTrxAscFvHis、pET28a scFvHis載體的構(gòu)建 由噬菌體展示技術(shù)獲得的scFv基因片段含有Nco和Not位點(diǎn)。用Nco和Not內(nèi)切酶分別酶切

13、scFv基因和pET32a、pET28a質(zhì)粒，用連接酶過夜連接獲得pET32aTrxAscFvHis、pET28ascFvHis表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21。所構(gòu)建的兩個載體都具有ampicillin抗性。2.1.2 pETEI:scFv載體的構(gòu)建 scFv基因先經(jīng)PCR擴(kuò)增(引物：5AAAGTTGTACACAACATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGT;3 TGATGGTGATGATGATGTGCGGCCGCACCTA)，在scFv基因5端添加一個BsrG內(nèi)切酶位點(diǎn)。擴(kuò)增后的scFv基因和pETEi:X質(zhì)粒分別用BsrG和Not過夜酶切，然后用連接酶過夜處理，獲得pETEI:s

14、cFv表達(dá)載體。pETEI:scFv表達(dá)載體帶有ampicillin和kanamycin抗性。2.2 scFv在不同載體和菌株中的表達(dá)用pETEI:scFv質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BLR，經(jīng)涂板篩選出具有ampicillin抗性的菌株，在37 、170 rmin-1條件下用含有200 gml-1 ampicillin的TB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，然后在18 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。用pET32aTrxAscFvHis和pET28a scFvHis分別轉(zhuǎn)化BL21菌株，經(jīng)涂板ampcillin篩選后，挑選具有ampicllin抗性的克隆分別用BL21培養(yǎng)基在37 、170 rmin-1條件下培養(yǎng)過夜，用1

15、.0 mmolL-1 IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。各組的裂解產(chǎn)物用SDSPAGE電泳分析目的蛋白的表達(dá)情況。2.3 scFv在pETEI:scFv/BLR中的純化融合蛋白和scFv的純化步驟參照標(biāo)準(zhǔn)操作手冊8。通過搖瓶表達(dá)pETEI:scFv/BLR，5 000 rmin-1、4 條件下離心10 min回收細(xì)胞?；厥盏募?xì)胞按每克細(xì)胞使用5 ml溶菌液重懸，經(jīng)超聲破碎后于4 離心回收上清。取10 ml上清轉(zhuǎn)移到50 ml的離心管中，加入10 ml 3 molL-1 NaCl;37 孵化10 min，室溫下12 000 rmin-1離心10 min回收沉淀。將沉淀重懸到1 ml預(yù)冷的裂解液中，室溫下

16、裂解過夜，然后加入1 ml 3 molL-1 NaCl溶液，室溫下孵育10 min后5 000 rmin-1離心回收上清。2.4 scFv在pET32aTrxAscFvHis/BL21中可溶性表達(dá)的溫度優(yōu)化 根據(jù)pET使用手冊，本研究對影響蛋白可溶性表達(dá)的主要因素溫度進(jìn)行優(yōu)化。菌體在37 下過夜培養(yǎng)后，分別在37 和18 條件下用1.0 mmolL-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h。離心回收細(xì)胞，分別取1 g細(xì)胞用溶菌緩沖液裂解，進(jìn)行SDSPAGE電泳分析上清和沉淀中的目的蛋白。2.5 pET32aTrxAscFvHis中scFv的純化挑選1個含有pET32aTrxAscFvHis質(zhì)粒的BL21單克

17、隆在5 ml含0.1% ampicillin的LB培養(yǎng)液中37 過夜培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到500 ml含0.01% ampicillin的LB培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.6時迅速冷卻至18 ，并添加1.0 mmolL-1的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)5 h。發(fā)酵液在室溫條件下，5 000 rmin-1離心10 min回收細(xì)胞?；厥盏募?xì)胞按每克細(xì)胞使用5 ml溶菌液重懸;重懸液室溫下放置過夜后超聲破碎;4 下8 000 rmin-1離心20 min回收上清液。上清液用鎳親和層析回收融合蛋白，回收的融合蛋白于純水中過夜透析后凍干處理，凍干樣品按mg蛋白ml-1酶切裂解液溶解，經(jīng)凝血酶酶切后用G50

18、層析柱除去雜質(zhì)，回收scFv蛋白。2.6 scFv的生物活性測定將獲得的scFv抗體用2稀釋的方法從1.6 gml-1到0.1 gml-1的濃度以50 l孔-1包被到96孔板上。4 過夜后，用含1% tween的PBS洗滌后加入50 l孔-1的1.0 gml-1的CTGF標(biāo)準(zhǔn)品，于37 溫箱中孵育2 h后洗滌并加入50 l孔-1的1.0 gml-1的鼠抗CTGF/CCN2抗體，并在37 下孵育1 h，再經(jīng)洗滌后加入50 l孔-1的1 gml-1羊抗鼠HRPIgG抗體。最后加入顯色劑，待顯色完全后加入終止液并用ELISA酶標(biāo)儀記錄結(jié)果9。3 結(jié) 果3.1 pET28ascFvHis、pET32a

19、TrxAscFvHis、pETEI:scFv質(zhì)粒的構(gòu)建 3個質(zhì)粒構(gòu)建完畢之后送往上海生工(上海)測序，結(jié)果顯示3個質(zhì)粒構(gòu)建成功。如表1所示，pET28ascFvHis中，scFv只在N端添加了1個Met密碼子，末尾連接6個HIS密碼子并緊接1個終止密碼子;pET32aTrxAscFvHis中，scFv被融合到TRxA蛋白的C端，scFv N端附加6個His;pETEI:scFv中，scFv被克隆到Intein C端。表1 抗體蛋白scFv在3種載體中的構(gòu)建、表達(dá)和純化3.2 scFv在3個質(zhì)粒和菌株中的表達(dá)如表1所示，scFv蛋白在pET28ascFvHis/BL21中，誘導(dǎo)前后沒有觀察到目的

20、蛋白明顯表達(dá)，Western結(jié)果顯示scFv蛋白不表達(dá)(data not shown);在pETEI:scFv/BLR和pET32aTrxAscFvHis/BL21中均成功表達(dá)(見圖1、2)，其中融合蛋白TrxAscFvHis相對分子質(zhì)量約為43 000，ElastininteinscFv融合蛋白約為90 000。1. Marker; 2. 總蛋白; 3. 經(jīng)過1次鹽析純化后的樣品; 4. 鹽析純化后除去的蛋白; 5. 經(jīng)過3次鹽析純化后的樣品圖 1 scFv抗體蛋白在pETEI:scFv/BLR中的表達(dá)和純化Fig 1 The expression and purification of s

21、cFv in pETEI:scFv Lane 1. Marker; Lane 2. total protein of lysate; Lane 3. the precipitation after one purification cycle by salt addition, heating and centrifugation; Lane 4. the supernatant after one purification cycle; Lane 5. the precipitation after cleaving inducing by pH shift and three cycles

22、 of purification by salt addition, heating and centrifugation3.3 scFv在pETEI:scFv/BLR中的表達(dá)純化通過反復(fù)的加入高鹽鹽析和重新溶解，融合蛋白不斷得到純化，但是電泳結(jié)果顯示，scFv無法從融合蛋白ElastininteinscFv中裂解游離出來(圖1)。 11-03-25 10:12:00 編輯：studa203.4 溫度對scFv蛋白在pET32aTrxAscFvHis/BL21中表達(dá)的影響 pET32aTrxAscFvHis/BL21在37 條件下表達(dá)的產(chǎn)物主要為包涵體或者其他不能與鎳柱結(jié)合的形式，而18 條件

23、下scFv的表達(dá)主要為可溶性表達(dá)，可以吸附到鎳親和柱上，并能被高濃度咪唑溶液洗脫下來(圖3)。1. Marker; 2. 經(jīng)過分子篩柱色譜純化得scFv蛋白; 3. 純化融合蛋白經(jīng)凝血酶酶切16 h后樣品; 4. 經(jīng)親和柱色譜純化后的樣品; 5. 表達(dá)的溶解性總蛋白; 6. IPTG誘導(dǎo)表達(dá)前總蛋白; w1. scFv蛋白的western blotting結(jié)果; w2. 融合蛋白的western blotting結(jié)果3.5 scFv蛋白在pET32aTrxAscFvHis/BL21中的表達(dá)和純化 優(yōu)化后，在18 條件下表達(dá)的scFv主要以可溶性的形式存在，融合蛋白占總蛋白的30%左右，經(jīng)鎳柱初

24、步純化后回收的融合蛋白的純度能達(dá)到50%左右。酶切后經(jīng)進(jìn)一步的分子篩分離純化，電泳純度能達(dá)到85%以上(圖2)。3.6 scFv生物學(xué)活性測定如圖4所示，在包被0、5、10、20、40、80 ng scFv抗體所測得OD450 nm分別為0.022 150.000 85、0.080 350.002 45、0.162 500.005 50、0.321 400.015 30、0.631 350.002 95、1.295 200.048 80，組內(nèi)變異系數(shù)小于10%。經(jīng)回歸統(tǒng)計(jì)，OD450 nm吸收值和抗體含量成線性關(guān)系(y=0.016 016x+0.005 071),R=99.94%,P0.05,

25、說明純化所得抗體scFv與CTGF是能特異性結(jié)合的，具有良好的生物活性。4 討 論本研究中scFv的基因來源于Griffin.1 library，之前的研究顯示這種來源的基因都很難獲得可溶性表達(dá)的產(chǎn)物。我們通過構(gòu)建pET32aTrxAscFvHis質(zhì)粒在低溫表達(dá)的條件下成功獲得溶解性的且具有免疫活性的產(chǎn)物，不同于以往的任何一種已經(jīng)報道的方法4。大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)被大規(guī)模運(yùn)用于重組蛋白的表達(dá)和生產(chǎn)，具有操作簡單、周期短、耗費(fèi)低的特點(diǎn)，而且大部分表達(dá)的外源蛋白都能保持生物活性。但是，原核系統(tǒng)缺乏真核表達(dá)系統(tǒng)所具有的翻譯后修飾功能，很多復(fù)雜的具有二硫鍵的外源蛋白會以不具有生物學(xué)活性的包涵體形式存在

26、。雖然目前的蛋白復(fù)性技術(shù)也在不斷發(fā)展，但是應(yīng)用的范圍往往受二硫鍵的多寡和蛋白空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度的限制，只能應(yīng)用于一些小的、簡單的、二硫鍵少的蛋白的復(fù)性。相對于包涵體表達(dá)，可溶性表達(dá)具有很多優(yōu)點(diǎn)，之前很多的研究顯示大量的可溶性表達(dá)的蛋白可以不經(jīng)過復(fù)性就具有生物活性。有文獻(xiàn)報道通過加入融合伴侶GST、NusA、MPB可以幫助蛋白在細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)，增加可溶性，而且還具有生物活性5,10-11?；钚缘鞍椎纳梢蕾囉谡_空間結(jié)構(gòu)的形成，二硫鍵的正確形成是含二硫鍵的蛋白能否正確折疊的首要影響因素12。大部分分子伴侶無法使scFv在胞內(nèi)形成二硫鍵，需要在周質(zhì)空間里進(jìn)一步的氧化修飾或者體外復(fù)性處理。Trx是一

27、種細(xì)菌來源的特殊的分子伴侶，它不但能夠促進(jìn)目的蛋白的折疊，而且能幫助蛋白在細(xì)菌體內(nèi)高效表達(dá)、提高穩(wěn)定性，并形成正確的二硫鍵13。溫度是影響細(xì)菌可溶性表達(dá)的一個非常重要的因素,在不同的溫度下外源蛋白的表達(dá)形式也是不一樣的。有研究報道同一種蛋白在37 下基本表達(dá)成包涵體的形式，但是在30 下卻主要表達(dá)成溶解性的形式，且具有生物活性14。低溫能通過降低蛋白合成相關(guān)酶的活性減緩蛋白的表達(dá)速率，使蛋白有足夠的時間折疊成正確的空間結(jié)構(gòu)15。在pET32ascFvHis/BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)中，溫度是影響蛋白表達(dá)形式的主要因素，TrxscFvHis融合蛋白在37 下主要以包涵體的形式表達(dá)，而在18 下

28、主要表達(dá)成可溶性蛋白。目的蛋白scFv無法以游離的形式在pET28ascFvHis/ BL21(DE3)中表達(dá)，可能是mRNA不穩(wěn)定無法正常轉(zhuǎn)錄，也可能是蛋白的翻譯過程中出現(xiàn)了某些差錯。在過去的研究中，外源蛋白的不表達(dá)一直是一個復(fù)雜的至今沒有定論的問題。經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)，分子伴侶的加入不僅可以幫助外源蛋白成功表達(dá)，而且還能大大提高表達(dá)產(chǎn)率和穩(wěn)定性。Inteinsystem是近年來出現(xiàn)的一種新型表達(dá)系統(tǒng)，融合蛋白CBDintein不但具有純化標(biāo)簽而且具有自我切割功能16。pETEI:X是最近在Nature上才報道的一種，在Inteinsystem基礎(chǔ)上改進(jìn)的集表達(dá)純化于一體的新型表達(dá)系統(tǒng)。目的

29、蛋白在pETEI:scFv/BLR(DE3)中也成功得到表達(dá)。ELP的功能類似于Trx能幫助scFv的表達(dá)，而且由于ELP具有獨(dú)特的自我聚集和溶解特性，可以不借助任何傳統(tǒng)的純化方法，只需要通過反復(fù)加入高濃度的NaCl就可以達(dá)到滿意的純化效果。pETEI:X的另一個特性就是具有intein，它能通過特定的條件誘導(dǎo)自我裂解將scFv從融合蛋白中釋放出來。然而和現(xiàn)有的其他的具有intein的表達(dá)系統(tǒng)一樣，intein的自我裂解并非嚴(yán)格意義上可控，和與intein相連的幾個起始氨基酸有著重要關(guān)系，甚至外源蛋白的空間結(jié)構(gòu)也能大大影響裂解的效率17。scFv蛋白在pETEI:scFv/BLR(DE3)中成功得到表達(dá)，但是最終無法從融合蛋白上裂解下來，可以通過在外源蛋白的起始區(qū)加入一段連接肽，比如在這個系統(tǒng)中已經(jīng)表達(dá)成功的GFP的一段起始蛋白序列來幫助目的蛋白從融合蛋白上成功裂解。體外酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)顯示，通過pET32ascFvHis