凍存前后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性和支持造血的研究

1、凍存前后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性和支持造血的研究    作者：趙智剛，唐曉瓊，黎緯明，游泳，鄒萍    【摘要】 為了了解凍存復(fù)蘇過(guò)程對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cell，MSC) 生物學(xué)特性和支持造血能力的影響，采用常規(guī)方法分離培養(yǎng)骨髓MSC，將傳代后的細(xì)胞用含10二甲亞砜、40胎牛血清的IMDM細(xì)胞凍存液保存在-196液氮中，觀察短期（4周）和中期（9-15月）復(fù)蘇后MSC的活性、免疫表型、多向分化能力和支持造血的能力，并同凍存前的MSC進(jìn)行比較。 結(jié)果表明：中短期凍存后的MSC

2、的細(xì)胞活性分別為(90士3.75)和(93士2.51)；凍存后細(xì)胞的增殖能力、免疫表型、體外分化為脂肪和骨細(xì)胞的能力、支持集落（CFU-GM，CFU-E，CFU-GEMM）的生長(zhǎng)作用和凍存前MSC相似。結(jié)論：骨髓MSC在液氮中短期和中期保存后，細(xì)胞活性略有下降，但是并不影響MSC的增殖、分化和支持造血能力。    【關(guān)鍵詞】 支持造血 Biological Characteristics and Ability of Supporting Hematopoiesis of Bone Marrow Mesenchymal   

3、 Stem Cells Pre-and Post-Cryop-reservation Abstract This study was aimed to observe the biological characteristics of cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cell (MSC) and to examine their abilities to support in vitro hematopoiesis.Bone marrow MSC were cryopreserved in -196 liquid nitrogen

4、 for 4 weeks (short term) and 9-15 months (medium term) with IMDM containing 10% DMSO，40% fetal calf serum as cryoprotectant.The viability，proliferation，immunophenotype，in vitro differentiation and ability of supporting hematopoiesis of thawed MSC were investigated and compared with these of pre-cry

5、opreserved MSC.The results showed that the cell viability were (93士2.51) and (90士3.75) for MSC cryopreserved as long as 4 weeks or 9-15 months respectively.However，there were no changes detected，as compared with pre-cryopreserved MSC in immunophenotype，abilities of proliferation and supporting colon

6、y forming of CFU-GM，CFU-E and CFU-GEMM.It is concluded that bone marrow-derived MSC can be stored in liquid nitrogen for short-term (4 weeks) or medium-term (9-15 months) without changes of abilities of proliferation，differentiation and hematopoiesis support. Key words cryopreservation; mesenchymal

7、stem cell； hematopoiesis support 間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有多向分化和支持造血的能力，而且來(lái)源廣泛，容易在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床并顯示了良好的治療效果1-4。將培養(yǎng)后的MSC凍存，在患者需要MSC治療時(shí)給予輸注，具有很好的臨床應(yīng)用前景。但是，凍存是否會(huì)影響MSC的生物學(xué)特征，我們尚不清楚。因此，本研究將骨髓來(lái)源的MSC凍存于-196液氮中，觀察中期和短期凍存后MSC的增殖、分化和支持造血的能力并同凍存前的MSC進(jìn)行比較，為進(jìn)一步在臨床中的應(yīng)用提供詳盡的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法 試劑 IMDM、DMEM、DF1

8、2、MCDB培養(yǎng)液、胎牛血清、馬血清和甲基纖維素均為Gibco公司產(chǎn)品。鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR抗體購(gòu)自PharMingen公司; rh-SCF、 GM-CSF、 EPO、 IL-3購(gòu)自Peprotech公司;胰酶、EDTA、全反式維甲酸、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（IBMX）和二甲亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司。 MSC的分離和培養(yǎng) 骨髓來(lái)自8例健康志愿者（年齡18-34歲，平均29歲）。髂后上棘抽取骨髓，用淋巴細(xì)胞分離液（密度1.077）400×g 離心20分鐘，取白環(huán)以上細(xì)胞部分，計(jì)數(shù)后接種于含40% M

9、CDB、2% FCS的DF12培養(yǎng)液中，置37、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后換液，去除未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%融合時(shí)，常規(guī)消化傳代。 MSC的凍存和復(fù)蘇 將1×106細(xì)胞加入含10 DMSO和40% FCS的IMDM中，總體積1.8 ml。先置于-80冰箱中，第二天轉(zhuǎn)入-196中凍存。將中期9-15個(gè)月（平均13個(gè)月）和短期（4周）凍存的MSC置于37水浴中快速?gòu)?fù)溫，凍融后加入8 ml IMDM混勻后離心，然后再用IMDM洗滌1次，置于37、5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天，更換新鮮培養(yǎng)液。 細(xì)胞活性和增殖能力測(cè)定 應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)拒染回收率（TBR）試驗(yàn)檢測(cè)復(fù)蘇細(xì)胞的活性，TB

10、R(%)凍存后活細(xì)胞計(jì)數(shù)/凍存前活細(xì)胞計(jì)數(shù)×臺(tái)盼藍(lán)拒染率×100。將凍存前后的MSC接種在24孔板中（5×103細(xì)胞/孔），置37、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1天取2孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，繪制生長(zhǎng)曲線。 細(xì)胞免疫表型分析 用含20 g/L BSA的PBS將胰酶消化后的MSC制成1×106 cells/ml的細(xì)胞懸液。每個(gè)上機(jī)試管中加入500 l細(xì)胞懸液，先加入鼠抗人CD11b、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD105和HLA-DR單克隆抗體，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，于4孵育30分鐘，PBS洗3遍。再加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，4孵

11、育30分鐘，PBS洗4遍，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。使用cellquest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。 體外誘導(dǎo)多向分化檢測(cè) 成骨誘導(dǎo) 將5×104細(xì)胞接種于6孔板中，加入含10-7mol/L地塞米松、10 mol/L 磷酸甘油、0.05 mol/L維生素C和10% FCS的IMDM，3周后應(yīng)用von Kossa染色檢測(cè)鈣化小結(jié)。 脂肪誘導(dǎo) 將5×104細(xì)胞接種于6孔板中，加入含10-6 mol/L地塞米松、0.5 mol/L IBMX 、0.1 mol/L維生素C和10% FCS的IMDM，7天后油紅O染色檢測(cè)脂肪滴。 支持造血的能力測(cè)定 將凍存前后的骨髓MSC用10.0 Gy 60Co

12、 線照射，然后更換為長(zhǎng)期培養(yǎng)液（含12.5 FCS、 12.5%馬血清、2 mmol/L谷氨酰胺、10-6 mol/L 氫化考的松的IMDM）。獲取健康人骨髓單個(gè)核細(xì)胞，預(yù)先培養(yǎng)4小時(shí)以去除貼壁細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞按照1×106/ml接種在照射后的MSC中，在37、5% CO2條件下培養(yǎng)，每周半量換液。4周后獲取全部細(xì)胞接種于甲基纖維素體系中測(cè)定其集落形成能力。培養(yǎng)體系為: IMDM中含30%馬血清、1% BSA，2 mmol/L谷氨酰胺、1×10-4/L 2巰基乙醇、1%甲基纖維素和重組細(xì)胞因子。細(xì)胞因子包括: rhSCF 50 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，GM-

13、CSF 50 ng/ml 和EPO 4 U/ml。集落形成實(shí)驗(yàn)在24孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，于37、5% CO2條件下培養(yǎng)14天。每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞。14天后在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)集落，50個(gè)以上細(xì)胞為1個(gè)集落。    統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較應(yīng)用方差分析。    結(jié) 果 骨髓MSC的形態(tài)特征和生長(zhǎng)特點(diǎn) 于倒置顯微鏡下，凍存前骨髓MSC為成纖維樣，胞漿豐富，核染色質(zhì)細(xì)，核仁明顯，平行排列或旋渦樣生長(zhǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，骨髓MSC的倍增時(shí)

14、間約為42.03士2.41小時(shí)。細(xì)胞形態(tài)和倍增時(shí)間隨著細(xì)胞傳代并不發(fā)生改變。 凍存后MSC的活性率和增殖能力 骨髓MSC的活性率（TBR）隨著凍存時(shí)間的延長(zhǎng)略有下降。短期凍存MSC的TBR為93士2.51；中期凍存MSC的TBR為90士3.75。二者之間并沒(méi)有顯著性差異。凍存后MSC的增殖能力同凍存前相比較，沒(méi)有明顯差異。依據(jù)生長(zhǎng)曲線可以得出短期和中期凍存后骨髓MSC的倍增時(shí)間分別為39.54士3.53小時(shí)和41.64士1.68小時(shí)。 凍存前后MSC的免疫表型 通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凍存前后骨髓MSC的免疫表型發(fā)現(xiàn)，凍存前后MSC均表達(dá)CD29、CD44、CD105，而CD11b、CD31、CD3

15、4、CD45和HLA-DR均為陰性(表1)。CD分子的表達(dá)量在凍存前后略有不同，但均不存在顯著性差異。Table 1.Flow-cytometric phenotype analysis of adult bone marrow derived MSC before and after cryopreservation（略） 多系分化的鑒定 成骨分化 2周后細(xì)胞聚集成集落，并有少量鈣鹽沉積，繼續(xù)培養(yǎng)1周，細(xì)胞呈現(xiàn)多層生長(zhǎng)的結(jié)節(jié)狀，并有大量鈣鹽沉積，而對(duì)照組細(xì)胞仍為單層生長(zhǎng)，無(wú)鈣鹽沉積。von Kossa 染色證實(shí)為鈣鹽沉積(圖A)，對(duì)照組無(wú)上述現(xiàn)象出現(xiàn)。 成脂肪分化 3-5天后發(fā)現(xiàn)少量細(xì)胞中有

16、小脂肪滴出現(xiàn)，繼續(xù)誘導(dǎo)，1周后可以看見大部分細(xì)胞胞體變大，胞漿出現(xiàn)大量脂肪滴，油紅O染色證實(shí)為脂肪滴(圖B)，而對(duì)照組細(xì)胞胞漿中無(wú)脂肪滴出現(xiàn)，油紅O染色為陰性。    凍存后的MSC同樣具有成骨和成脂肪分化能力(圖C，D)。 支持造血作用 為了評(píng)估凍存是否影響MSC支持造血的能力，將骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于照射過(guò)的凍存前和復(fù)蘇的MSC中，在長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)液中培養(yǎng)4周后檢測(cè)CFU生成情況。如表2所示，凍存前后MSC均具有支持造血作用。CFU-GM，CFU-E和CFU-GEMM的產(chǎn)率在以凍存前、短期凍存和中期凍存后MSC為滋養(yǎng)層的骨髓長(zhǎng)期培養(yǎng)體系中并無(wú)顯著性差異。

17、Table 2.Hematopoiesis supported by MSC in long term bone marrow culture（略） 討 論 MSC是造血微環(huán)境中主要組成部分，通過(guò)合成、分泌多種造血因子和黏附分子來(lái)調(diào)控造血干細(xì)胞的增殖、分化和自我更新。既往研究顯示，MSC可以合成并分泌多種造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有維持長(zhǎng)期培養(yǎng)起始細(xì)胞(LTC-IC)的能力，促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖和分化5。聯(lián)合MSC的移植方案還可以促進(jìn)HSC的植入和移植后的造血恢復(fù)6。但是，在體外培養(yǎng)擴(kuò)增中，MSC的增殖能力會(huì)逐漸下降并發(fā)生分化，支持造血的能力減弱。將擴(kuò)增后或者增殖旺盛的MSC進(jìn)行凍存，在需要的時(shí)候復(fù)

18、蘇培養(yǎng)，可以有效地解放上述問(wèn)題并確保提供足夠的MSC應(yīng)用于臨床。    既往的大量研究顯示，造血干細(xì)胞可以在液氮中長(zhǎng)期凍存，復(fù)蘇后仍然具有良好的造血重建能力。但是，MSC經(jīng)過(guò)低溫凍存和復(fù)蘇，其增殖和分化能力、支持造血功能是否受影響，尚不明確。因此，我們觀察了骨髓MSC經(jīng)過(guò)短期（4周）和中期（9-15月）凍存后的生物學(xué)特性和支持造血能力。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)中期和短期凍存后MSC的形態(tài)并未發(fā)生改變，仍為梭形，貼附在培養(yǎng)瓶底。凍存后MSC的活性略有下降，但凍存并不影響細(xì)胞的增殖能力，凍存前和中期、短期凍存后MSC的倍增時(shí)間在40小時(shí)左右，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不具有顯著性差

19、異。通過(guò)FACS檢測(cè)，凍存前后的MSC的免疫表型沒(méi)有明顯改變，表現(xiàn)為CD29、CD44和CD105為陽(yáng)性，而CD11b、CD34、CD31、CD45、和HLA-DR為陰性。多向分化能力是MSC的主要特征之一，我們將經(jīng)過(guò)中期和短期凍存后MSC誘導(dǎo)向脂肪和骨分化，結(jié)果顯示凍存后MSC仍然具有向脂肪和骨分化的能力，而且這種分化能力，并不隨著復(fù)蘇后細(xì)胞的傳代而發(fā)生變化。由此可見，中期和短期凍存并不影響MSC的生物學(xué)特性。    支持造血是骨髓MSC的重要功能之一，凍存后MSC支持造血能力是否發(fā)生變化將直接影響MSC的臨床應(yīng)用。Majumdar等7的研究顯示，骨髓

20、MSC可以分泌多種造血生長(zhǎng)因子，具有支持造血作用，能促進(jìn)骨髓來(lái)源的CFU-GM，CFU-E，CFU-Meg和CFU-GEMM的增殖。但是凍存后MSC支持造血能力如何變化，既往并無(wú)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)檢測(cè)體外長(zhǎng)期培養(yǎng)體系中集落形成情況來(lái)評(píng)估凍存后MSC對(duì)造血干細(xì)胞的支持作用。骨髓單個(gè)核細(xì)胞在以凍存前、短期凍存和中期凍存后MSC作為滋養(yǎng)層的骨髓長(zhǎng)期培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，4周后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的CFU生成率在各體系之間沒(méi)有顯著性差別。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)中期和短期凍存后MSC仍具有支持造血能力，同凍存前比較，支持造血能力沒(méi)有明顯變化。進(jìn)一步分析上述不同培養(yǎng)體系中CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的生成

21、情況，結(jié)果表明：凍存前后MSC均可以促進(jìn)CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM的增殖，而且MSC促進(jìn)定向祖細(xì)胞的增殖能力在凍存前后沒(méi)有明顯差別。這些結(jié)果表明，凍存并不影響MSC促進(jìn)不同階段造血祖細(xì)胞增殖、分化的能力。    綜上所述，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)：經(jīng)過(guò)中期和短期低溫凍存的骨髓MSC并不改變其固有的生物學(xué)特性。雖然凍存可以導(dǎo)致部分細(xì)胞損傷，但是并不影響剩余細(xì)胞的增殖能力和多向分化能力。此外，凍存后的MSC仍然具有支持造血的功能。但是，凍存后MSC是否在體內(nèi)仍具有上述生物學(xué)性狀和支持造血功能，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。 【參考文獻(xiàn)】 1Jiang

22、 Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of me-senchymal stem cell derived from adult marrow.Nature，2002; 418（6893）: 41-492Krause DS，Theise ND，Collector MI，et al.Multi-organ，multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell.Cell，2001; 105: 369-3773Noort WA，Kruisselbrink AB，int-Anker PS，et al.Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord blood-derived CD34 ( ) cells in NOD/SCID mice.Exp Hematol，2002; 30: 870-8784Koc ON，Gerson SL，Cooper BW，et al.Rapid hematopoietic reco-very after coinfusion o