PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置

1、PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)置為防止污染，必須嚴(yán)格遵循臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室。 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室四個(gè)隔開(kāi)的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專(zhuān)用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以防止設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)簡(jiǎn)稱(chēng)擴(kuò)增區(qū)至產(chǎn)物分析區(qū)，防止發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別。此外，當(dāng)工作者離開(kāi)工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。 清潔方法不當(dāng)也是污染

2、發(fā)生的一個(gè)主要原因，因此實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。一試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)下述操作在該區(qū)進(jìn)行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。貯存試劑和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過(guò)產(chǎn)物分析區(qū)。在打開(kāi)含有反應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當(dāng)貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝貯存?zhèn)溆茫乐褂捎诮?jīng)常打開(kāi)反應(yīng)管吸液而造成污染。含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴(kuò)增的試劑都應(yīng)冰凍貯存。為防止因單次

3、反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一次測(cè)定所需的擴(kuò)增反應(yīng)數(shù)來(lái)決定。主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過(guò)預(yù)試驗(yàn)來(lái)檢查，評(píng)價(jià)結(jié)果必須有書(shū)面報(bào)告。對(duì)于"熱啟動(dòng)"技術(shù)在第一個(gè)高溫變性步驟后加入酶，聚合酶也可不包含在主反應(yīng)混合液中。在整個(gè)本區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施。 嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。工作結(jié)束后必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔。本工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)外表應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺(tái)外表的紫外

4、照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能量對(duì)去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動(dòng)紫外燈254nm波長(zhǎng)，在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上6090cm內(nèi)照射。由于擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百bp，對(duì)紫外線(xiàn)損傷不敏感，因此紫外照射擴(kuò)增片段必須延長(zhǎng)照射時(shí)間，最好是照射過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。二標(biāo)本制備區(qū)下述操作在該區(qū)進(jìn)行：臨床標(biāo)本的保存，核酸RNA、DNA提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。 要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)防止在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)?？赏ㄟ^(guò)在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件防止從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為防止樣本間的交叉污染，加入待測(cè)核酸后

5、，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。對(duì)具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。 用過(guò)的加樣器吸頭必須放入專(zhuān)門(mén)的消毒例如含次氯酸鈉溶液容器內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室桌椅外表每次工作后都要清潔，實(shí)驗(yàn)材料原始血標(biāo)本、血清標(biāo)本、提取中的標(biāo)本與試劑的混合液等如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。 對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)適當(dāng)?shù)淖贤庹丈?54nm波長(zhǎng)，與工作臺(tái)面近距離適合于滅活去污染?？梢苿?dòng)紫外線(xiàn)管燈可用來(lái)確保工作后對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面的充分照射。 樣本處理對(duì)核酸擴(kuò)增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開(kāi)展臨床標(biāo)本檢測(cè)前對(duì)提取方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。 用于RNA擴(kuò)增檢測(cè)樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cDNA合成，因?yàn)閏DNA鏈較RNA穩(wěn)定

6、，保存相對(duì)容易。為保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的需要，應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)設(shè)置一個(gè)以上的溫育裝置。 cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其較cDNA合成后再開(kāi)蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)生污染的可能性降低。 待測(cè)RNA的cDNA拷貝須保存在標(biāo)本制備區(qū)，不得在本區(qū)對(duì)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。三擴(kuò)增區(qū)下述工作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA來(lái)自樣本制備區(qū)的加入和主反應(yīng)混合液來(lái)自試劑貯存和制備區(qū)制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開(kāi)反

7、應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。 不能從本區(qū)再進(jìn)入任何"上游"區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以防止氣溶膠從本區(qū)漏出。 為防止氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動(dòng)。如有加樣則應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。打開(kāi)預(yù)處理過(guò)的反應(yīng)混合液時(shí)必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴(kuò)增步驟之間。一個(gè)簡(jiǎn)單的方法是在打開(kāi)反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機(jī)，因其所占實(shí)驗(yàn)臺(tái)面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺(tái)。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過(guò)的加樣器必須注意清潔消毒。 完成操作及每天工作后都必須對(duì)實(shí)

8、驗(yàn)室臺(tái)面進(jìn)行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。四擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)下述操作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：擴(kuò)增片段的測(cè)定。 核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測(cè)序方法等。目前國(guó)內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標(biāo)記的微孔板上探針雜交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探針雜交方法。 本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此必須注意防止通過(guò)本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，必須使用洗板機(jī)洗板，廢液必須收集至1mol/L HC1中，并且不能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉。用過(guò)的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處