(完整版)斑馬魚動(dòng)物模型的應(yīng)用介紹

1、斑馬魚動(dòng)物模型的應(yīng)用斑馬魚（ Danio rerio ）屬于輻鰭亞綱（Actinopterygii ）鯉科（ Cyprinidae ）短擔(dān)尼魚屬（Danio ）的一種硬骨魚， 原產(chǎn)于南亞， 是一種常見的熱帶觀賞魚， 因其體側(cè)具有斑馬一樣暗藍(lán)與銀色相間的紋條而得名。斑馬魚個(gè)體小，易于飼養(yǎng)，成體長(zhǎng)4-5cm，雄魚體修長(zhǎng)，雌魚體肥大。可在有限空間里養(yǎng)殖相當(dāng)大的群體，可滿足樣本需求量大的研究。斑馬魚發(fā)育迅速，在 28.5培養(yǎng)條件下受精后約 40min 完成第一次有絲分裂，之后大約每隔15min 分裂一次， 24h 后主要器官原基形成，相當(dāng)于 28d 的人類胚胎， 幼魚孵出后約3 個(gè)月達(dá)到性成熟。雌雄魚

2、通過調(diào)控光周期控制14:10（光照 :黑暗）產(chǎn)卵時(shí)間，成熟魚每周可產(chǎn)卵一次，一尾雌魚每次可產(chǎn)卵100-300 枚。胚胎體外受精，體外發(fā)育，胚體透明，易于觀察。受精卵直徑約和細(xì)胞移植等操作。1mm，易于進(jìn)行顯微注射一、斑馬魚的品系經(jīng)過 30 多年的研究應(yīng)用和系統(tǒng)發(fā)展，已有約 20 個(gè)斑馬魚品系， 斑馬魚基因數(shù)據(jù)庫-ZFIN（http:/zfin/org ）里有相關(guān)的資料可供查詢和下載。目前研究中常用的斑馬魚野生型品系主要為 AB品系、 Tuebingen（ Tu）品系、 WIK品系，斑馬魚基因組計(jì)劃所用品系是Tu。AB品系是實(shí)驗(yàn)室常用的斑馬魚品系，由單倍體細(xì)胞經(jīng)早期加壓法獲得。 Tu 品系斑馬魚

3、具有胚胎致死突變基因， 用于基因組測(cè)序前敲除該致死突變基因。 WIK 品系較 Tu 品系具有更多的形態(tài)多樣性。此外，還保存有 3000 多個(gè)突變品系和 100 多個(gè)轉(zhuǎn)基因品系。這些品系資源對(duì)于利用斑馬魚開展各種科學(xué)研究起著很大的推動(dòng)作用。二、斑馬魚突變品系的篩選斑馬魚突變的方法主要有三種：已基亞硝脲（ENU ）化學(xué)誘導(dǎo)、或射線照射和插入誘變。 ENU 是一種 DNA 烴基化試劑， 在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前誘導(dǎo)堿基對(duì)的替換，誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變率為0.1%-0.2% ，涉及單個(gè)基因的突變。射線照射導(dǎo)致染色體大片段的缺失或染色體重排，產(chǎn)生突變率達(dá)1%。插入誘變是以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，用顯微注射法將目的基因片段

4、導(dǎo)入斑馬魚受精卵，整合到基因組中， 干擾正?；虮磉_(dá)。射線照射產(chǎn)生的突變率是ENU化學(xué)誘導(dǎo)的10 倍，但由于突變涉及多個(gè)基因，突變的表型是受若干基因調(diào)控的結(jié)果，不利于基因功能的分析，因此，ENU 化學(xué)誘導(dǎo)法是斑馬魚突變的主要方法。研究含有純合致死基因或隱形突變基因的突變表型時(shí)，可通過早期加壓法（胞獲得二倍體純合子。EP）處理母本獲得的單倍體卵細(xì)三、斑馬魚作為人類疾病動(dòng)物模型的生物學(xué)特性斑馬魚在基因水平上 87與人類同源，早期發(fā)育與人類極為相似，已成為研究相關(guān)疾病基因的最佳模式生物。篩選斑馬魚胚胎或成魚基因庫中類似于人類致病或特定功能的基因，構(gòu)建進(jìn)斑馬魚受精卵中， 觀察特定基因在斑馬魚胚胎發(fā)育過

5、程所起作用。 斑馬魚胚胎發(fā)育是全透明的， 可以全程觀察并研究其發(fā)育狀況。 目前， 斑馬魚模式生物的使用正逐漸拓展和深入生命體的多種系統(tǒng)（例如，神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等）的發(fā)育、功能和疾?。ɡ?，神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病等）的研究中，并已用于小分子化合物的規(guī)模新藥篩選。3.1 神經(jīng)系統(tǒng)模型斑馬魚研究表明，神經(jīng)特異性鈉離子通道大量表現(xiàn)在中樞和周邊感覺神經(jīng)系統(tǒng)，有效調(diào)控神經(jīng)的興奮性，其基因表達(dá)調(diào)控及信號(hào)通路是神經(jīng)學(xué)研究重點(diǎn)。阿爾茨海默氏?。ˋD ）是一種由于大腦神經(jīng)細(xì)胞死亡而造成的神經(jīng)退行性疾病。AD與淀粉樣蛋白（A ）的過量表達(dá)沉積有關(guān)，A 是由 APP 連續(xù)切割產(chǎn)生，而早

6、老素增強(qiáng)子（pen-2）和前咽陷子（Aph-1 ）參與 A 的產(chǎn)生。研究表明，將斑馬魚相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn) Pen-2 與 P53 依賴型神經(jīng)細(xì)胞的存活有重要作用。并且在構(gòu)建綠色熒光蛋白（ GFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系中，發(fā)現(xiàn)在2-3 月齡轉(zhuǎn)基因斑馬魚大腦中，廣泛大量表達(dá)GFP-APP。這些說明斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育在進(jìn)化上和人類的保守關(guān)系。帕金森氏?。?PD）與多巴胺能（ DA ）通路的破壞有關(guān)。神經(jīng)毒物MPTP 對(duì)人類中腦多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的損傷現(xiàn)象與PD 類似。研究者將多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制物和MPTP 共同作用于斑馬魚幼魚，發(fā)現(xiàn)這些藥物具有保護(hù)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的作用。3.2 心血管系統(tǒng)模型斑

7、馬魚胚胎期和幼魚期為透明體，這為心血管發(fā)育的研究提供了良好模型。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的心臟受損后具有自動(dòng)修復(fù)功能， 這是首次發(fā)現(xiàn)脊椎動(dòng)物的心臟具有再生功能， 為探尋人類心臟受損修復(fù)帶來希望。 斑馬魚突變品系可作為研究心臟節(jié)律、 心臟管形成、 瓣膜發(fā)生和心臟環(huán)化的模型。例如，突變品系gridlock （gdl）可用于研究人類主動(dòng)脈縮窄疾病?？寺∨c斑馬魚同源的人類載脂蛋白基因apoE 和 apoA-1 ，發(fā)現(xiàn)這些蛋白對(duì)哺乳動(dòng)物脂質(zhì)的吸收和分布具有重要作用， 而 Apo-1 在 AD 治療中也有重要作用。 胚胎注射血管內(nèi)皮因子 （ VEGF ）的斑馬魚在發(fā)育過程中可以觀察到明顯的新生血管， 而腫瘤的發(fā)生

8、與轉(zhuǎn)移又與血管新生有密切關(guān)系，這啟發(fā)人們通過阻斷 VEGF 抑制血管增生而治療腫瘤。3.3 免疫疾病模型和感染疾病模型斑馬魚具有較完整的特異性免疫系統(tǒng)，體內(nèi)的 T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞具有免疫活性，非特異性免疫系統(tǒng)也呈現(xiàn)出與人類的相似性，同時(shí)保留了TLR信號(hào)通道。成魚體內(nèi)注射細(xì)菌和胚胎浸沒感染法可使斑馬魚感染細(xì)菌，有效建立相應(yīng)的細(xì)菌發(fā)病機(jī)理研究模型。海分枝桿菌感染的斑馬魚體內(nèi)的肺結(jié)核肉芽腫和人類一樣出現(xiàn)干酪樣壞死，該模型可能在肺結(jié)核研究中發(fā)揮重要作用。3.4 腫瘤模型腫瘤是造成人類死亡的主要原因之一，斑馬魚可以自發(fā)產(chǎn)生腫瘤， 并且許多腫瘤與人類腫瘤非常相似， 因此，斑馬魚作為最有前途且最廉價(jià)

9、的模式生物而被廣泛的應(yīng)用。腫瘤模型的構(gòu)建主要是通過移植術(shù)、化學(xué)誘變和基因突變獲得。移植術(shù)即直接將腫瘤細(xì)胞注射到不同發(fā)育階段的斑馬魚的特定部位，或者將含有GFP 表達(dá)基因的腫瘤細(xì)胞顯微注射到斑馬魚胚胎或幼魚中。 化學(xué)誘變可以快速獲得斑馬魚腫瘤模型，例如， 誘變劑處理斑馬魚胚胎或幼魚可以獲得肝癌、 血管瘤、 細(xì)胞間質(zhì)瘤等。 但是化學(xué)誘變會(huì)引起非特異性表型，而且腫瘤定位困難。基因突變則是將含有GFP 報(bào)告基因的腫瘤基因通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到斑馬魚體中，可用以進(jìn)一步鑒定腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制。3.5 視網(wǎng)膜自動(dòng)修復(fù)機(jī)能斑馬魚研究發(fā)現(xiàn)， 斑馬魚視網(wǎng)膜具有可再生放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞可分化為健康的視網(wǎng)膜細(xì)胞， 并能

10、自動(dòng)修復(fù)受損視網(wǎng)膜。人類視網(wǎng)膜擁有類似斑馬魚的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，但是這些細(xì)胞無活性。 研究人員已成功將放射狀角質(zhì)細(xì)胞分化的視網(wǎng)膜細(xì)胞移植到老鼠上，這為激活人類放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的研究奠定了重要的基礎(chǔ)。四、斑馬魚在發(fā)育遺傳學(xué)中的應(yīng)用斑馬魚作為發(fā)育生物學(xué)模式生物有很多優(yōu)勢(shì)，胚胎清透可見， 從受精卵發(fā)育到完整的胚胎形成只需24h，發(fā)育過程便于觀察。GFP 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的運(yùn)用可對(duì)特定組織進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察?？蓪?duì)批量樣本進(jìn)行免疫組化或熒光免疫研究。 可對(duì)胚胎進(jìn)行顯微注射 DNA 或 RNA ，影響基因表達(dá)。嗎啉代（ morpholino ）基因敲除技術(shù)和異位基因表達(dá)技術(shù)是目前斑馬魚發(fā)育遺傳學(xué)研究中的新興技術(shù)。 200

11、0 年，有研究者提出注射嗎啉代修飾性寡聚核苷酸可產(chǎn)生基因敲除斑馬魚。嗎啉代有抑制翻譯起始， 減少傳統(tǒng)反義寡聚核苷酸非特異性的效應(yīng)。 注射嗎啉代能產(chǎn)生以往證實(shí)的基因突變的擬表型， 有助于確定功能基因。 嗎啉代寡核苷酸正成為快速、 高效的基因敲除方法。 對(duì)越早期胚胎注射外源基因， 基因表達(dá)范圍就越廣， 異位基因表達(dá)技術(shù)就是為使基因在斑馬魚特定細(xì)胞、組織和特定時(shí)間表達(dá)而建立的一系列新技術(shù)。如 RNA caging 技術(shù)， RNA 與 RNA caging 共價(jià)結(jié)合時(shí)處于非活性狀態(tài)，經(jīng)特定波長(zhǎng)照射， RNA caging 被破壞，激活 RNA ，基因得以表達(dá)。同樣，激光誘導(dǎo)基因表達(dá)技術(shù)即外源基因與熱休

12、克蛋白啟動(dòng)子重組，激光熱敏效應(yīng)啟動(dòng)基因表達(dá)。五、斑馬魚在生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用斑馬魚模型最早用于發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)研究，近幾年，斑馬魚模型逐漸應(yīng)用于生態(tài)毒理研究和檢測(cè)技術(shù)。5.1 常規(guī)毒性實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用斑馬魚模型可用于急性毒性實(shí)驗(yàn)、慢性毒性實(shí)驗(yàn)， 以及蓄積毒性實(shí)驗(yàn)。斑馬魚急性毒性實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)各種農(nóng)藥、有機(jī)試劑和污染物等的急性毒性。斑馬魚胚胎比成年斑馬魚敏感，對(duì)于急性毒性方面是一個(gè)很好研究模型，可于顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育的生態(tài)毒理學(xué)終點(diǎn)。慢性毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)定低濃度污染物在斑馬魚生活周期內(nèi)的毒性作用，來確定化學(xué)物質(zhì)最大容許濃度及其影響程度。通過慢性毒性實(shí)驗(yàn)可觀察同種魚在不同發(fā)育階段（發(fā)育代） 對(duì)化學(xué)物質(zhì)的毒性

13、差異。蓄積實(shí)驗(yàn)則檢測(cè)外來化學(xué)物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)蓄積或富集性大小的實(shí)驗(yàn)。5.2 分子及細(xì)胞生態(tài)毒理中的應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入生物體后，對(duì)生物產(chǎn)生不同程度的危害。生物在受到損傷或致死前，其行為、 生理、生化已發(fā)生反應(yīng)，可以選擇這些在分子和細(xì)胞水平上的指標(biāo)測(cè)定化學(xué)物質(zhì)對(duì)生物的影響。 例如，在斑馬魚胚胎發(fā)育晚期，硫代硫酸鈉可刺激胚胎細(xì)胞的大量異常增殖，這些異常細(xì)胞會(huì)引起胚胎的部分器官發(fā)育畸形?？赏ㄟ^胚胎、 軟骨組織染色， 或全組織包埋原位雜交等技術(shù)進(jìn)行顯微觀察。5.3 水質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用運(yùn)用轉(zhuǎn)基因斑馬魚的某些效用元件來顯示其接觸的特定污染物可檢測(cè)水質(zhì)的變化。例如，斑馬魚可檢測(cè)水環(huán)境中雌激素污染，當(dāng)水樣中存在一定濃度的雌激素時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)斑馬魚發(fā)育過程中出現(xiàn)性別的干擾和反轉(zhuǎn)現(xiàn)象。