分子生物學(xué)-5

1、第六部分第六部分分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù) 分子克隆技術(shù)分子克隆技術(shù) (重組重組 DNA 技術(shù)、基因工程技術(shù)、基因工程) 核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交技術(shù) DNA 測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù) PCR 技術(shù)技術(shù) RNA 干擾技術(shù)干擾技術(shù) 蛋白質(zhì)分析技術(shù)蛋白質(zhì)分析技術(shù)常用的分子生物學(xué)技術(shù)常用的分子生物學(xué)技術(shù) DNA、基因及基因組測(cè)序、基因及基因組測(cè)序 特定基因的克隆、表達(dá)及功能鑒定特定基因的克隆、表達(dá)及功能鑒定 基因表達(dá)調(diào)控序列的克隆和鑒定基因表達(dá)調(diào)控序列的克隆和鑒定 藥物研發(fā)及藥物生產(chǎn)藥物研發(fā)及藥物生產(chǎn) 基因治療基因治療 疾病相關(guān)基因的檢測(cè)疾病相關(guān)基因的檢測(cè) 病原微生物的檢測(cè)病原微生物的檢測(cè) DNA 指

2、紋分析指紋分析 重組病毒疫苗、重組病毒疫苗、DNA 疫苗疫苗 基因敲除動(dòng)物模型的建立基因敲除動(dòng)物模型的建立 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及轉(zhuǎn)基因植物的建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及轉(zhuǎn)基因植物的建立 利用微生物的能源生產(chǎn)及環(huán)境廢物處理利用微生物的能源生產(chǎn)及環(huán)境廢物處理分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用/genome/利用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素利用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素發(fā)酵裝置發(fā)酵裝置人胰島素人胰島素突變的基因突變的基因動(dòng)物動(dòng)物rhebC57BL/6 小鼠小鼠gpr55FVB/N 小鼠小鼠leprC57BL/6 小鼠小鼠wdr20aC57BL/6 小鼠小鼠mc3rSpragu

3、e Dawley 大鼠大鼠mc4rSprague Dawley 大鼠大鼠leprSprague Dawley 大鼠大鼠基因敲除動(dòng)物模型基因敲除動(dòng)物模型影響毛發(fā)生長(zhǎng)的基因敲除小鼠影響毛發(fā)生長(zhǎng)的基因敲除小鼠轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 (如羊、牛如羊、牛)生產(chǎn)蛋白藥物，如組織纖溶酶生產(chǎn)蛋白藥物，如組織纖溶酶原激活劑原激活劑 (tPA)、乳鐵蛋白、人、乳鐵蛋白、人類類-1 抗胰蛋白酶、促紅細(xì)胞生抗胰蛋白酶、促紅細(xì)胞生成素成素 (EPO) 等。等。 建立轉(zhuǎn)基因小鼠及大鼠疾病建立轉(zhuǎn)基因小鼠及大鼠疾病模型，用于心血管疾病模型，用于心血管疾病 、遺傳、遺傳病、腫瘤學(xué)和免疫學(xué)等研究。病、

4、腫瘤學(xué)和免疫學(xué)等研究。1982年在美國(guó)建立的年在美國(guó)建立的第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠模型第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠模型普通棉花普通棉花 轉(zhuǎn)基因棉花：抗病蟲害轉(zhuǎn)基因棉花：抗病蟲害 轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物重組病毒疫重組病毒疫苗苗DNA 疫苗疫苗 DNA 疫苗是將含有某種抗原基因序列的載體疫苗是將含有某種抗原基因序列的載體作為疫苗，直接導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)宿主細(xì)胞作為疫苗，直接導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答。對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答。 例如，含乳腺球蛋白例如，含乳腺球蛋白-A 編碼基因的編碼基因的 DNA 疫疫苗。苗。

5、對(duì)對(duì) Thermoanaerobacterium saccharolyticum 厭氧嗜厭氧嗜熱桿菌熱桿菌進(jìn)行遺傳改造，即刪除與有機(jī)酸生成有關(guān)的基因進(jìn)行遺傳改造，即刪除與有機(jī)酸生成有關(guān)的基因 (如如乙酸激酶、磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶乙酸激酶、磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶)，對(duì)木聚糖和，對(duì)木聚糖和來(lái)源于生物質(zhì)的糖發(fā)酵，生產(chǎn)高產(chǎn)量乙醇。來(lái)源于生物質(zhì)的糖發(fā)酵，生產(chǎn)高產(chǎn)量乙醇。Shaw AJ, et al. Metabolic engineering of a thermophilic bacterium to produce ethanol at high yield. PNAS 2008, 1

6、05(37):13769-13774.利用工程菌生產(chǎn)乙醇利用工程菌生產(chǎn)乙醇 對(duì)大腸桿菌的脂肪酸生物合成途徑進(jìn)行遺傳改造，以獲對(duì)大腸桿菌的脂肪酸生物合成途徑進(jìn)行遺傳改造，以獲得短鏈脂肪酸；通過(guò)引入一種新的合成途徑和培養(yǎng)條件的得短鏈脂肪酸；通過(guò)引入一種新的合成途徑和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，使短鏈脂肪酸轉(zhuǎn)換到其相應(yīng)的烷烴優(yōu)化，使短鏈脂肪酸轉(zhuǎn)換到其相應(yīng)的烷烴 (汽油汽油)。 目前正在嘗試提高短鏈脂肪酸的產(chǎn)率及生物汽油的產(chǎn)量。目前正在嘗試提高短鏈脂肪酸的產(chǎn)率及生物汽油的產(chǎn)量。 利用工程菌生產(chǎn)生物汽油利用工程菌生產(chǎn)生物汽油Lee SY and Choi YJ. Microbial production of sh

7、ort-chain alkanes. Cell 2013. doi:10.1038/nature12536生產(chǎn)短鏈烷烴的生產(chǎn)短鏈烷烴的大腸桿菌工程菌大腸桿菌工程菌分子克隆技術(shù)分子克隆技術(shù)大腸桿菌基因組大腸桿菌基因組人類基因組人類基因組真核細(xì)胞的基因及真核細(xì)胞的基因及 cDNAcDNADNA目的目的 DNA 片段片段分子克隆分子克隆 (Molecular cloning): 產(chǎn)生許多相同的產(chǎn)生許多相同的 DNA 分子分子的過(guò)程。的過(guò)程。分子克隆分子克隆 (Molecular cloning)基因組基因組 DNA載體載體限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切、電泳分離、純化限制性內(nèi)切酶酶

8、切、電泳分離、純化DNA 連接酶連接酶重組載體重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌大腸桿菌宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞細(xì)細(xì)菌菌增殖增殖分分子子克克隆隆的的基基本本過(guò)過(guò)程程重組載體在大腸桿菌宿主重組載體在大腸桿菌宿主細(xì)胞中復(fù)制以產(chǎn)生許多相細(xì)胞中復(fù)制以產(chǎn)生許多相同的同的 DNA 分子拷貝分子拷貝Route to the Production by Bacteria of Human Insulin完成分子克隆所需的條件完成分子克隆所需的條件 載體載體 目的目的 DNA 或或 cDNA 宿主細(xì)胞及導(dǎo)入重組宿主細(xì)胞及導(dǎo)入重組 DNA 分子到宿主細(xì)胞的分子到宿主細(xì)胞的手段手段 工具酶工具酶 (限制性內(nèi)切酶、限制性內(nèi)

9、切酶、DNA 連接酶、修飾酶連接酶、修飾酶) 陽(yáng)性克隆陽(yáng)性克隆的篩選方法的篩選方法克隆載體克隆載體 用于構(gòu)建基因組文庫(kù)、用于構(gòu)建基因組文庫(kù)、cDNA 文庫(kù)以及克隆某文庫(kù)以及克隆某一特定基因或一特定基因或 cDNA 以測(cè)定其核苷酸序列。以測(cè)定其核苷酸序列。表達(dá)載體表達(dá)載體 用于表達(dá)某一基因或用于表達(dá)某一基因或 cDNA 以獲得目的蛋白。以獲得目的蛋白。載體載體 (Vectors) 和宿主細(xì)胞和宿主細(xì)胞 (Host cells)載體載體功能分析功能分析結(jié)構(gòu)分析結(jié)構(gòu)分析藥物篩選藥物篩選臨床藥物臨床藥物克隆克隆目的基因或目的基因或 cDNA到到克隆載體克隆載體亞克隆目的基因或亞克隆目的基因或 cDNA

10、到到表達(dá)載體表達(dá)載體高表達(dá)目的蛋白高表達(dá)目的蛋白基因治療基因治療一、克隆載體一、克隆載體 (Cloning vectors) 用于構(gòu)建基因組文庫(kù)、用于構(gòu)建基因組文庫(kù)、cDNA 文庫(kù)以及克隆某一特定基文庫(kù)以及克隆某一特定基因或因或 cDNA 以測(cè)定其核苷酸序列。以測(cè)定其核苷酸序列。 克隆質(zhì)?？寺≠|(zhì)粒 (cloning plasmid) 噬菌體載體噬菌體載體 ( phage) 粘粒粘粒 (cosmid) 細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (Bacterial artificial chromosome, BAC) 酵母人工染色體酵母人工染色體 (Yeast artificial chromosome,

11、 YAC)克隆載體克隆載體宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞載體結(jié)構(gòu)載體結(jié)構(gòu)外源插入片段外源插入片段克隆質(zhì)?？寺≠|(zhì)粒大腸桿菌大腸桿菌環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒0.1 - 10 kb 噬菌體載體噬菌體載體大腸桿菌大腸桿菌線狀病毒線狀病毒8 - 25 kb粘粒粘粒大腸桿菌大腸桿菌環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒35 - 45 kb細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體大腸桿菌大腸桿菌環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒50 - 300 kb酵母人工染色體酵母人工染色體酵母酵母線狀染色體線狀染色體100 - 1000 kb克隆載體的類型克隆載體的類型 低分子量、高拷貝數(shù)質(zhì)粒：高拷貝數(shù)質(zhì)?？纱罅繑U(kuò)增被低分子量、高拷貝數(shù)質(zhì)粒：高拷貝數(shù)質(zhì)粒可大量擴(kuò)增被克隆的目的基因、克隆的目的

12、基因、DNA 片段或片段或 cDNA。 含有一個(gè)或幾個(gè)可供選擇的標(biāo)記：抗生素的抗性基因、含有一個(gè)或幾個(gè)可供選擇的標(biāo)記：抗生素的抗性基因、細(xì)菌的細(xì)菌的 lacZ 基因片段及基因片段及 ccdB 致死基因等。致死基因等。 含多克隆位點(diǎn)含多克隆位點(diǎn) (Multiple cloning site, MCS)：在質(zhì)粒的在質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記選擇性標(biāo)記中有多個(gè)限制性內(nèi)切酶單一識(shí)別位點(diǎn)，允許外中有多個(gè)限制性內(nèi)切酶單一識(shí)別位點(diǎn)，允許外源源 DNA 插入。插入。1. 克隆質(zhì)粒克隆質(zhì)?？箍股厮氐牡目箍剐孕曰蛞虍a(chǎn)產(chǎn)物物功功能能AmpR ( -內(nèi)內(nèi)酰酰胺胺水水解解酶酶)催催化化青青霉霉素素分分子子中中 -內(nèi)內(nèi)酰酰

13、胺胺環(huán)環(huán)酰酰胺胺鍵鍵的的水水解解，造造成成氨氨芐芐青青霉霉素素失失活活KanR (氨氨基基磷磷酸酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移酶酶)使使卡卡那那霉霉素素磷磷酸酸化化而而失失活活NeoR (氨氨基基磷磷酸酸轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移酶酶)使使新新霉霉素素磷磷酸酸化化而而失失活活TetR (Tet 蛋蛋白白)Tet 蛋蛋白白位位于于細(xì)細(xì)菌菌的的內(nèi)內(nèi)膜膜，可可 Tet 阻阻止止進(jìn)進(jìn)入入細(xì)細(xì)胞胞CAT (氯氯霉霉素素乙乙酰酰基基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移酶酶)使使氯氯霉霉素素乙乙酰?；涡纬沙?3-乙乙酰酰氧氧化化氯氯霉霉素素而而失失活活抗生素抗性基因產(chǎn)物及其功能抗生素抗性基因產(chǎn)物及其功能MCS (pUC18 )ApR: Ampicillin resis

14、tance generep (ori): replication originlacZ: N-terminal -galactosidaseMCS: multiple cloning sitesE. coli 乳糖操縱子乳糖操縱子(異丙基異丙基 -D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷)(5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚- -D-半乳糖苷半乳糖苷)IPTG：誘導(dǎo)物：誘導(dǎo)物X-Gal (X-gal)： 底物底物DH5 F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG 80dlacZM15(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-mK+),

15、 - JM109endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+(lac-proAB) e14-F traD36 proAB+ lacIq lacZM15 hsdR17(rK-mK+) XL1-BlueendA1 gyrA96 (nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F:Tn10 proAB+ lacIq(lacZ) M15 hsdR17(rK-mK+) 用于基因克隆的大腸桿菌菌株用于基因克隆的大腸桿菌菌株 克隆質(zhì)粒帶有克隆質(zhì)粒帶有E. coli lac 啟動(dòng)子及編碼啟動(dòng)子及編碼 -半乳糖苷酶氨半乳糖苷酶氨基端基端 ( -供

16、體片段，供體片段，146 氨基酸氨基酸) 的的 DNA 片段。片段。 E. coli 宿主細(xì)胞的宿主細(xì)胞的 -半乳糖苷酶基因?yàn)槿毕菪?，只能編半乳糖苷酶基因?yàn)槿毕菪?，只能編碼碼 -半乳糖苷酶的羧基端片段半乳糖苷酶的羧基端片段 ( -受體片段受體片段)。 質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的 -供體片段和宿主細(xì)胞的供體片段和宿主細(xì)胞的 -受體片段同時(shí)表達(dá)，受體片段同時(shí)表達(dá)，兩者結(jié)合后具有兩者結(jié)合后具有 -半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性 ( -互補(bǔ)互補(bǔ))，使底物，使底物 X-gal 產(chǎn)生藍(lán)色。產(chǎn)生藍(lán)色。 -互補(bǔ)互補(bǔ) ( -complementation)藍(lán)藍(lán)/白斑篩選白斑篩選 由由 噬菌體改造而成的載體，可容納噬菌體改造

17、而成的載體，可容納 8 - 25 kb 的外源的外源 DNA 片段，常用于構(gòu)建基因組文庫(kù)或片段，常用于構(gòu)建基因組文庫(kù)或 cDNA 文庫(kù)。文庫(kù)。(1) 插入型載體插入型載體 只有一個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)可供外源只有一個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)可供外源 DNA 插入。插入。(2) 置換型載體置換型載體 在非必需在非必需 DNA 兩側(cè)有一對(duì)克隆位點(diǎn)，外源兩側(cè)有一對(duì)克隆位點(diǎn)，外源 DNA 將非將非必需必需 DNA 置換掉。置換掉。2. 噬菌體載體噬菌體載體pBeloBAC11 (7.5 kb)MCS：BamHI，SphI，HindIIICmR：氯霉素抗性基因：氯霉素抗性基因Oir2：F 因子的復(fù)制子因子的復(fù)制子parA-C：確保

18、子細(xì)胞含有單拷貝載體：確保子細(xì)胞含有單拷貝載體3. 細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (BAC)可容納可容納 - 300 kb 的外源的外源 DNA 片段，常用于基因組測(cè)序。片段，常用于基因組測(cè)序。二、表達(dá)載體二、表達(dá)載體 (Expression vectors) 用于表達(dá)某一基因或用于表達(dá)某一基因或 cDNA 以獲得目的蛋白。表達(dá)載以獲得目的蛋白。表達(dá)載體的種類較多，體的種類較多， 根據(jù)要表達(dá)的目的蛋白的特點(diǎn)對(duì)載體進(jìn)行根據(jù)要表達(dá)的目的蛋白的特點(diǎn)對(duì)載體進(jìn)行選擇。選擇。 原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體 (質(zhì)粒質(zhì)粒)：用原核細(xì)胞表達(dá)目的蛋白：用原核細(xì)胞表達(dá)目的蛋白 真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體 (質(zhì)粒質(zhì)粒)：用

19、真核細(xì)胞表達(dá)目的蛋白用真核細(xì)胞表達(dá)目的蛋白 用于酵母用于酵母的表達(dá)載體的表達(dá)載體 用于昆蟲細(xì)胞的表達(dá)載體用于昆蟲細(xì)胞的表達(dá)載體 用于哺乳類細(xì)胞的表達(dá)載體用于哺乳類細(xì)胞的表達(dá)載體表達(dá)載體表達(dá)載體 (質(zhì)粒質(zhì)粒) 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)大腸桿菌菌株大腸桿菌菌株 (基因組被改造基因組被改造)BL21(DE3), CD41(DE3), ER2566 等等酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞P. pastoris, S. cerevisiae, S. pombe 等等昆蟲細(xì)胞系昆蟲細(xì)胞系Sf9, Sf21各種高等真核生物的組織細(xì)胞各種高等真核生物的組織細(xì)胞用于表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞用于表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞

20、表達(dá)目的蛋白的特點(diǎn)用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞表達(dá)目的蛋白的特點(diǎn)1. 原核表達(dá)載體的特點(diǎn)原核表達(dá)載體的特點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn) (MSC)抗生素抗性基因抗生素抗性基因啟動(dòng)子啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子有些載體具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)有些載體具有核糖體結(jié)合位點(diǎn) (RBS)用于純化和鑒定目的蛋白的標(biāo)簽用于純化和鑒定目的蛋白的標(biāo)簽 (tag)(一一) 原核表達(dá)載體原核表達(dá)載體 (Prokaryotic expression vectors)(1) Lac 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 弱啟動(dòng)子，受弱啟動(dòng)子，受 IPTG 誘導(dǎo)。誘導(dǎo)。(2) Tac 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 Trp 啟動(dòng)子與啟動(dòng)子與 Lac 啟動(dòng)子構(gòu)成的雜合

21、啟動(dòng)子，啟動(dòng)子構(gòu)成的雜合啟動(dòng)子，中等強(qiáng)度啟動(dòng)子。中等強(qiáng)度啟動(dòng)子。(3) PL 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 噬菌體噬菌體啟動(dòng)子，強(qiáng)啟動(dòng)子，受溫度誘導(dǎo)。啟動(dòng)子，強(qiáng)啟動(dòng)子，受溫度誘導(dǎo)。2. 用于原核表達(dá)載體的啟動(dòng)子用于原核表達(dá)載體的啟動(dòng)子(4) T7 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 T7 噬菌體噬菌體啟動(dòng)子，極強(qiáng)啟動(dòng)子，受啟動(dòng)子，極強(qiáng)啟動(dòng)子，受 IPTG 誘導(dǎo)。誘導(dǎo)。(5) Ara BAD 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 受受 L-arabinose (L-阿拉伯糖阿拉伯糖) 誘導(dǎo)。誘導(dǎo)。(6) cspA 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 冷休克蛋白基因冷休克蛋白基因 cspA 的啟動(dòng)子使目的蛋白在低的啟動(dòng)子使目的蛋白在低溫溫 (16 C) 條件下表達(dá)；條件下表達(dá)；c

22、spA 啟動(dòng)子下游有啟動(dòng)子下游有 lac 操操縱基因，受縱基因，受 IPTG 誘導(dǎo)。誘導(dǎo)。(1) His-tag (Histidine-tag，組氨酸標(biāo)簽，組氨酸標(biāo)簽) 6 - 10個(gè)組氨酸個(gè)組氨酸 (His) 與目的蛋白的與目的蛋白的 N 或或 C 末末端形成融合蛋白，用端形成融合蛋白，用 His-Ni 或或 His-Co 親和層析親和層析法純化目的蛋白。法純化目的蛋白。(2) GST (glutathione S-transferase) GST 與目的蛋白的與目的蛋白的 N 端形成融合蛋白，用端形成融合蛋白，用 glutathione-Sepharose 純化目的蛋白。純化目的蛋白。3.

23、 用于純化目的蛋白的標(biāo)簽或蛋白質(zhì)用于純化目的蛋白的標(biāo)簽或蛋白質(zhì)(3) MBP (Maltose binding protein) MBP 與目的蛋白的與目的蛋白的 N 端形成融合蛋白，用端形成融合蛋白，用 amylose-Sepharose 純化目的蛋白。純化目的蛋白。(4) CBD-tag CBD (Cellulose binding domain) 與目的蛋與目的蛋白的白的 N 端形成融合蛋白，用纖維素純化目的蛋端形成融合蛋白，用纖維素純化目的蛋白。白。 T7 啟動(dòng)子：與啟動(dòng)子：與 T7 RNA 聚合酶特異結(jié)合聚合酶特異結(jié)合 核糖體結(jié)合位點(diǎn)：與核糖體結(jié)合位點(diǎn)：與16S rRNA互補(bǔ)，起動(dòng)目

24、的蛋白互補(bǔ)，起動(dòng)目的蛋白的翻譯的翻譯 T7 轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子 標(biāo)簽：標(biāo)簽： His-Tag (最常用最常用) T7-Tag S-Tag GST-Tag CBD-Tag4. pET 原核原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng) Novagen 公司公司pET 表達(dá)載體表達(dá)載體親和層析親和層析 當(dāng)高表達(dá)的目的蛋白在當(dāng)高表達(dá)的目的蛋白在 E. coli 中不能正確折疊時(shí)，以包含體形式中不能正確折疊時(shí)，以包含體形式存在。存在。5. 包含體包含體 (inclusion bodies) 避免包含體形成的方法：避免包含體形成的方法： 優(yōu)化表達(dá)條件優(yōu)化表達(dá)條件 (誘導(dǎo)物的濃度、誘導(dǎo)溫度和時(shí)間等誘導(dǎo)物的濃度、誘導(dǎo)溫度和時(shí)間等)

25、； 使使目的蛋白目的蛋白與與 GST 等形成融合蛋白質(zhì)；等形成融合蛋白質(zhì)； 使使 E. coli 共表達(dá)伴侶素共表達(dá)伴侶素 (chaperones)，如，如 DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES 等；等； 利用冷休克表達(dá)載體利用冷休克表達(dá)載體 pCold 在低溫條件下表達(dá)目的蛋在低溫條件下表達(dá)目的蛋白。白。 伴侶素伴侶素與目的蛋白與目的蛋白共表達(dá)共表達(dá)M. 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)1. BL21(DE3)/pKJE7, 細(xì)胞裂解液細(xì)胞裂解液 2. BL21(DE3)/pKJE7/pET16b-Tb rmlD, 細(xì)胞裂解液細(xì)胞裂解液3. BL21(DE3)/pKJ

26、E7/pET16b-Tb rmlD,上清上清4-8. 純化的組分純化的組分 1-5伴侶素伴侶素與與 Tb RmlD 蛋白蛋白共表達(dá)共表達(dá) 真核表達(dá)載體為穿梭載體真核表達(dá)載體為穿梭載體 (shuttle vector)，既能在大腸桿菌中復(fù)制擴(kuò)增既能在大腸桿菌中復(fù)制擴(kuò)增 (便于基因克隆便于基因克隆)，又，又能在真核細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白。能在真核細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白。(二二) 真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體 (Eukaryotic expression vectors)1. 真核表達(dá)載體的特點(diǎn)真核表達(dá)載體的特點(diǎn) 用于用于大腸桿菌的復(fù)制起始點(diǎn)大腸桿菌的復(fù)制起始點(diǎn) 多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn) (MCS) 用于用于大腸桿

27、菌的抗生素抗性基因；大腸桿菌的抗生素抗性基因；用于用于真核細(xì)真核細(xì)胞的抗生素抗性基因胞的抗生素抗性基因 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子 添添加加 PolyA 的信號(hào)序列的信號(hào)序列 畢赤酵母畢赤酵母 (Pichia pastoris) 表達(dá)系統(tǒng)是高效表達(dá)系統(tǒng)是高效表達(dá)目的蛋白的酵母表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)目的蛋白的酵母表達(dá)系統(tǒng)。 AOX1 啟動(dòng)子；啟動(dòng)子； 用甲醇誘導(dǎo)目的基因表達(dá)；用甲醇誘導(dǎo)目的基因表達(dá)； 可表達(dá)胞內(nèi)蛋白及分泌蛋白。可表達(dá)胞內(nèi)蛋白及分泌蛋白。2. 酵母表達(dá)載體酵母表達(dá)載體畢赤酵母表達(dá)載體畢赤酵母表達(dá)載體用于表達(dá)分泌型目的蛋白用于表達(dá)分泌型目的蛋白用于表達(dá)胞內(nèi)目的蛋白用于表達(dá)胞內(nèi)目的蛋白

28、2. 昆蟲表達(dá)載體昆蟲表達(dá)載體 桿狀病毒桿狀病毒 (Baculovirus) 表達(dá)載體可在昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體可在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白。中表達(dá)目的蛋白。 DES (果蠅表達(dá)系統(tǒng)果蠅表達(dá)系統(tǒng)) InsectSelect 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng) BaculoDirect 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng) Bac-to-Bac 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng) Bac-N-Blue 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)桿狀病毒桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的比較昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的比較 多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn) Ampicillin, kanamycin, Hygromycin B 抗性基因抗性基因 用于用于 E.coli 中中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn) 來(lái)源于來(lái)源于SV4

29、0 的復(fù)制起點(diǎn)的復(fù)制起點(diǎn) Neomycin, zeocin, blasticidin 抗性基因，用于篩選抗性基因，用于篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系 CMV (cytomegalovirus), SV40 (Simian virus 40), RSV, 人人EF1 啟動(dòng)子等啟動(dòng)子等 轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子 加加 PolyA 的信號(hào)序列的信號(hào)序列3. 哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體目的蛋白與目的蛋白與 GFP (綠色綠色熒光蛋白熒光蛋白) 的的 N 端形成端形成融合蛋白。融合蛋白。Actin-GFP 融合蛋白融合蛋白在在 HeLa 細(xì)胞中的暫細(xì)胞中的暫態(tài)表達(dá)。態(tài)表達(dá)。 來(lái)自腦心肌炎病毒來(lái)自

30、腦心肌炎病毒 (encephalomyocarditis virus) 的的 IRES (Internal ribozyme entry site, 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)) 使雙順?lè)醋邮闺p順?lè)醋?RNA 同時(shí)翻譯出兩同時(shí)翻譯出兩種蛋白質(zhì)種蛋白質(zhì) (目的蛋白和目的蛋白和GFP)。 用于基因治療的病毒表達(dá)載體用于基因治療的病毒表達(dá)載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 (Retroviral vectors) 慢病毒載體慢病毒載體 (Lentivirus vectors) 腺病毒載體腺病毒載體 (Adenoviral vectors) 用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表達(dá)載體

31、含組織表達(dá)特異性的啟動(dòng)子含組織表達(dá)特異性的啟動(dòng)子 用于噬菌體展示用于噬菌體展示 (Phage Display) 的載體的載體 將目的基因插入噬菌體外殼蛋白基因，形成的融合蛋白將目的基因插入噬菌體外殼蛋白基因，形成的融合蛋白出現(xiàn)在噬菌體表面，目的蛋白或多肽保持相對(duì)獨(dú)立的空間出現(xiàn)在噬菌體表面，目的蛋白或多肽保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。5. 其他特殊表達(dá)載體其他特殊表達(dá)載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (Transformation)將載體或重組載體導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。將載體或重組載體導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (Transfection)將將載體或重組載體載體或重組

32、載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。 轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo) (Transduction)利用噬菌體將利用噬菌體將載體或重組載體載體或重組載體導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。 感染感染 (Infection)利用病毒將利用病毒將載體或重組載體載體或重組載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。(三三) 載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 (Competent cells) 是有利于外源是有利于外源 DNA 分分子進(jìn)入的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法不同，制備感受態(tài)細(xì)胞的方法也子進(jìn)入的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法不同，制備感受態(tài)細(xì)胞的方法也不同。不同。 化學(xué)轉(zhuǎn)化法化學(xué)轉(zhuǎn)化法 用用 CaCl2 處理

33、大腸桿菌，處理大腸桿菌，CaCl2 促進(jìn)促進(jìn) DNA 結(jié)合到細(xì)菌結(jié)合到細(xì)菌表面并增加細(xì)胞對(duì)表面并增加細(xì)胞對(duì) DNA 的通透性。的通透性。 電穿孔法電穿孔法 (Electroporation) 當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受高壓電流脈沖時(shí)，細(xì)胞膜上可逆地形成小至當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受高壓電流脈沖時(shí)，細(xì)胞膜上可逆地形成小至 2 nm大小的孔洞，使大小的孔洞，使 DNA 分子通過(guò)孔洞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)分子通過(guò)孔洞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。1. 轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化方法Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+化學(xué)轉(zhuǎn)化化學(xué)轉(zhuǎn)化基因組基因組 DNA質(zhì)粒質(zhì)粒 DNA熱休克熱休克 (42 C)電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)儀 (Ele

34、ctroporator)電轉(zhuǎn)杯電轉(zhuǎn)杯電穿孔法電穿孔法 (電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化)電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)杯電轉(zhuǎn)杯1 mm 間隙間隙 ：用于細(xì)菌的轉(zhuǎn)化：用于細(xì)菌的轉(zhuǎn)化2 mm 間隙間隙 ：用于細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、：用于細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、 真菌的轉(zhuǎn)化真菌的轉(zhuǎn)化 (染染)4 mm 間隙間隙：用于哺乳類細(xì)胞、用于哺乳類細(xì)胞、 人類細(xì)胞的轉(zhuǎn)染人類細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 CaPO4-DNA 共沉淀法共沉淀法 鈣離子與鈣離子與 DNA 的磷酸基團(tuán)結(jié)合形成不溶性沉淀的磷酸基團(tuán)結(jié)合形成不溶性沉淀 CaPO4-DNA，并附著于細(xì)胞表面，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞，并附著于細(xì)胞表面，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用被細(xì)胞所吸收。作用被細(xì)胞所吸收。 DEAE-葡聚糖方法葡聚糖方法 帶正電荷

35、的帶正電荷的 DEAE-葡聚糖與帶負(fù)電荷的葡聚糖與帶負(fù)電荷的 DNA 磷酸基團(tuán)結(jié)合形成磷酸基團(tuán)結(jié)合形成 DEAE-葡聚糖葡聚糖-DNA 復(fù)合物并復(fù)合物并結(jié)合帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用被細(xì)結(jié)合帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用被細(xì)胞所吸收。胞所吸收。2. 轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染方法 脂質(zhì)體法脂質(zhì)體法 陽(yáng)離子脂質(zhì)富集陽(yáng)離子脂質(zhì)富集 DNA 分子，形成穩(wěn)定的分子，形成穩(wěn)定的 DNA-脂質(zhì)體并附著于帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，脂質(zhì)體與細(xì)胞脂質(zhì)體并附著于帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，脂質(zhì)體與細(xì)胞膜發(fā)生融合，膜發(fā)生融合，DNA 被細(xì)胞所吸收。被細(xì)胞所吸收。人工合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)人工合成的陽(yáng)離子脂質(zhì) Transfectam 的結(jié)構(gòu)的

36、結(jié)構(gòu) 電穿孔法電穿孔法 原理同原理同電穿孔電穿孔轉(zhuǎn)化方法，但所用的參數(shù)不同。轉(zhuǎn)化方法，但所用的參數(shù)不同。 顯微注射法顯微注射法 (microinjection) 利用管尖極細(xì)利用管尖極細(xì) (0.1 - 0.5 m) 的玻璃微量注射針，的玻璃微量注射針，將外源基因直接注射到受精卵的原核將外源基因直接注射到受精卵的原核 (pronuleus) 或培養(yǎng)細(xì)胞中。或培養(yǎng)細(xì)胞中。 構(gòu)建攜帶目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建攜帶目的基因的表達(dá)載體表達(dá)載體被細(xì)胞吸收到細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)載體被細(xì)胞吸收到細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中目的基因及選擇性標(biāo)記整合到目的基因及選擇性標(biāo)記整合到基因組基因組 DNA 中

37、中(四四) 目的基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)目的基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)暫態(tài)表達(dá)暫態(tài)表達(dá) 穩(wěn)定表達(dá)穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 暫態(tài)表達(dá)暫態(tài)表達(dá) (Transient expression) 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞后，表達(dá)載體以附加體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞后，表達(dá)載體以附加體 (episome) 形式存在于細(xì)胞核中形式存在于細(xì)胞核中。 表達(dá)載體上的表達(dá)載體上的目的基因在目的基因在 24 - 72 小時(shí)內(nèi)表達(dá)，并隨著附加小時(shí)內(nèi)表達(dá)，并隨著附加體的消失而最終消失。體的消失而最終消失。 穩(wěn)定表達(dá)穩(wěn)定表達(dá) (Stable expression) 用選擇培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì)胞而獲得穩(wěn)定細(xì)胞系，用選擇培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì)胞而

38、獲得穩(wěn)定細(xì)胞系，表表達(dá)載體上的達(dá)載體上的目的基因整合到細(xì)胞的基因組目的基因整合到細(xì)胞的基因組 DNA 中中。 穩(wěn)定細(xì)胞系可以持續(xù)表達(dá)目的基因。穩(wěn)定細(xì)胞系可以持續(xù)表達(dá)目的基因。一、限制性內(nèi)切酶一、限制性內(nèi)切酶 (Restriction endonucleases) 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶一類存在于細(xì)菌中的核酸內(nèi)切酶，它們識(shí)一類存在于細(xì)菌中的核酸內(nèi)切酶，它們識(shí)別雙鏈別雙鏈 DNA分子上特異的核苷酸序列，并對(duì)分子上特異的核苷酸序列，并對(duì) DNA 分子進(jìn)分子進(jìn)行剪切。行剪切。限制性限制性： 細(xì)菌的細(xì)菌的 DNA 甲基化酶可對(duì)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序甲基化酶可對(duì)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列中的堿基進(jìn)行甲基化修飾，因

39、此，細(xì)菌列中的堿基進(jìn)行甲基化修飾，因此，細(xì)菌 DNA 不被限制性不被限制性內(nèi)切酶剪切，而外源內(nèi)切酶剪切，而外源 DNA 分子被限制性內(nèi)切酶所剪切。分子被限制性內(nèi)切酶所剪切。內(nèi)切酶內(nèi)切酶：是指酶切位點(diǎn)在：是指酶切位點(diǎn)在 DNA 分子內(nèi)，而不是兩端。分子內(nèi)，而不是兩端。限制性內(nèi)切酶和修飾酶限制性內(nèi)切酶和修飾酶噬菌體與噬菌體與細(xì)菌宿主細(xì)菌宿主噬菌斑噬菌斑 (plaques)限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 (EcoRI)甲基化的甲基化的 DNA未甲基化的未甲基化的 DNA甲基甲基 (CH3)EcoRI 與識(shí)別序列結(jié)合與識(shí)別序列結(jié)合EcoRI 與與甲基化的甲基化的識(shí)別序列不結(jié)合識(shí)別序列不結(jié)合DNA 被被 Ec

40、oRI 酶切酶切DNA 不被不被 EcoRI 酶切酶切類型類型ATP組成組成識(shí)別序列識(shí)別序列酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)甲基化酶活性甲基化酶活性I 需要需要由三種亞基組由三種亞基組成的復(fù)合物成的復(fù)合物兩側(cè)不對(duì)稱兩側(cè)不對(duì)稱序列序列在離識(shí)別序列至在離識(shí)別序列至少少 1000 個(gè)堿基個(gè)堿基處酶切處酶切 DNA有有II 不需要不需要單鏈多肽單鏈多肽為為 4-6 個(gè)堿個(gè)堿基，常具有基，常具有回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)酶切位點(diǎn)在識(shí)別酶切位點(diǎn)在識(shí)別序列之中或其相序列之中或其相鄰位置鄰位置無(wú)無(wú)III 需要需要由二種亞基組由二種亞基組成的復(fù)合物成的復(fù)合物兩側(cè)不對(duì)稱兩側(cè)不對(duì)稱序列序列在離識(shí)別序列在離識(shí)別序列 3端的端的 24-26 個(gè)

41、堿個(gè)堿基處酶切基處酶切 DNA有有(一一) 限制性內(nèi)切酶的分類限制性內(nèi)切酶的分類回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu) (palindrome) 是雙鏈?zhǔn)请p鏈 DNA 分子中的反向重復(fù)分子中的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，即每條鏈從結(jié)構(gòu)，即每條鏈從 5 3 方向讀其核苷酸序列都相同。方向讀其核苷酸序列都相同。5 GGATCC 33 CCTAGG 55 AGATCT 33 TCTAGA 55 CCCGGG 33 GGGCCC 51. 命名命名屬名屬名 (genus ) 的第一個(gè)字母，用大寫表示的第一個(gè)字母，用大寫表示種名種名 (species ) 的前兩個(gè)字母，用小寫表示的前兩個(gè)字母，用小寫表示細(xì)菌株名細(xì)菌株名 (strain)，

42、用大寫或小寫表示用大寫或小寫表示同一細(xì)菌株中不同的限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)和分離同一細(xì)菌株中不同的限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)和分離的順序，用羅馬字表示。的順序，用羅馬字表示。(二二) 類型類型 II 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶EcoRIE = Escherichia 屬屬co = coli 種種R = RY13 株株I = 第第 1 個(gè)被分離的限制性內(nèi)切酶?jìng)€(gè)被分離的限制性內(nèi)切酶BamHIB = Bacillus 屬屬am = amyloliquefaciens 種種H = H 株株I = 第第 1 個(gè)被分離的限制性內(nèi)切酶?jìng)€(gè)被分離的限制性內(nèi)切酶2. 識(shí)別序列識(shí)別序列(1) 具有回文結(jié)構(gòu)具有回文結(jié)構(gòu)BamHI5

43、GGATCC 33 CCTAGG 5KpnI5 GGTACC 33 CCATGG 5(2) 具有間斷的回文結(jié)構(gòu)具有間斷的回文結(jié)構(gòu)HinfI (XmnI)5 GANTC 33 CTNAG 5(3) 具有簡(jiǎn)并性堿基具有簡(jiǎn)并性堿基HincII5 GT(T/C)(A/G)AC 33 CA(A/G)(T/C)TG 5(4) 無(wú)回文結(jié)構(gòu)無(wú)回文結(jié)構(gòu)MboII5 GAAGA(N)8 33 CTTCT(N)7 5酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)識(shí)別序列識(shí)別序列 (回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu))DNA 片段片段 1DNA 片段片段 2EcoRI 二聚體和二聚體和 DNA3. 經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后所產(chǎn)生的末端類型經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后所產(chǎn)生的末

44、端類型(1) 粘性末端粘性末端 (sticky ends, cohesive ends)5 凸端凸端 (5 overhang) 粘性末端粘性末端EcoRI3. 經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后所產(chǎn)生的末端類型經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后所產(chǎn)生的末端類型(1) 粘性末端粘性末端 (sticky ends, cohesive ends)3 凸端凸端 (3 overhang) 粘性末端粘性末端(2) 平端或鈍端平端或鈍端 (blunt ends)4. 異源同工酶異源同工酶 (Isoschizomer) 來(lái)源于不同細(xì)菌但具有相同識(shí)別序列的限制性來(lái)源于不同細(xì)菌但具有相同識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶為異源同工酶內(nèi)切酶為異源同工酶。

45、 識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)均相同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)均相同的限制性內(nèi)切酶; 識(shí)別序列相同但酶切位點(diǎn)不同的限制性內(nèi)切識(shí)別序列相同但酶切位點(diǎn)不同的限制性內(nèi)切酶酶酶活性單位酶活性單位在在 37 C (某些限制性內(nèi)切酶在某些限制性內(nèi)切酶在 25 C 或或 50 C) 條件下，條件下，每小時(shí)酶切每小時(shí)酶切 1 g DNA 所用的酶量為個(gè)單位所用的酶量為個(gè)單位 (Unit)。限制性內(nèi)切酶緩沖液限制性內(nèi)切酶緩沖液NaCl, KCl: 提供正確的離子強(qiáng)度提供正確的離子強(qiáng)度Tris-HCl: 提供合適的提供合適的 pH 環(huán)境環(huán)境Mg2+: 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的輔助因子的輔助因子DTT: 還原劑還原劑

46、BSA: 保護(hù)保護(hù)限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶5. 類型類型 II 限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件限制性內(nèi)切酶緩沖液限制性內(nèi)切酶緩沖液 (Fermentas 公司公司)限制性內(nèi)切酶及其限制性內(nèi)切酶及其緩沖液緩沖液 (Fermentas 公司公司)星活性星活性 (star activity, * activity) 某些限制性內(nèi)切酶在非最適反應(yīng)條件時(shí)，酶的專一性某些限制性內(nèi)切酶在非最適反應(yīng)條件時(shí)，酶的專一性發(fā)生改變。發(fā)生改變。原因：原因： 酶濃度過(guò)高，甘油濃度過(guò)高；酶濃度過(guò)高，甘油濃度過(guò)高； 緩沖液的緩沖液的 pH 值過(guò)高；值過(guò)高； 緩沖液的離子強(qiáng)度過(guò)低；緩沖液的離子強(qiáng)度過(guò)低； 有機(jī)溶

47、劑存在有機(jī)溶劑存在5GAATTC 33CTTAAG 5EcoRI5 AATT 33 TTAA 5EcoRI*酶的專一性改變酶的專一性改變(1) 用一種限制性內(nèi)切酶酶切用一種限制性內(nèi)切酶酶切 DNA 分子時(shí)，應(yīng)使用其最佳緩分子時(shí)，應(yīng)使用其最佳緩 沖液，給限制性內(nèi)切酶提供最佳的沖液，給限制性內(nèi)切酶提供最佳的 pH 和離子濃度。和離子濃度。(2) 需用兩種限制性內(nèi)切酶酶切需用兩種限制性內(nèi)切酶酶切 (雙酶切雙酶切) 同一同一 DNA 分子時(shí)，分子時(shí)， 應(yīng)注意緩沖液的選擇應(yīng)注意緩沖液的選擇 兩種限制性內(nèi)切酶使用相同的緩沖液時(shí)，這兩種限制性內(nèi)切酶的活兩種限制性內(nèi)切酶使用相同的緩沖液時(shí)，這兩種限制性內(nèi)切酶的

48、活 性均為性均為 100。 兩種限制性內(nèi)切酶使用相同的緩沖液，但其中一種限制性內(nèi)切酶的兩種限制性內(nèi)切酶使用相同的緩沖液，但其中一種限制性內(nèi)切酶的 活性低于活性低于 100，而必須達(dá)到，而必須達(dá)到 75。 兩種限制性內(nèi)切酶使用不同的緩沖液，先用限制性內(nèi)切酶兩種限制性內(nèi)切酶使用不同的緩沖液，先用限制性內(nèi)切酶 1 (緩沖液緩沖液 1) 酶切酶切 DNA 分子，純化酶切反應(yīng)，將分子，純化酶切反應(yīng)，將 DNA 溶解在緩沖液溶解在緩沖液 2 中，中， 用限制性內(nèi)切酶用限制性內(nèi)切酶 2 酶切同一酶切同一 DNA 分子。分子。酶酶切切反應(yīng)小結(jié)反應(yīng)小結(jié)T4 DNA 連接酶連接酶 (T4 DNA ligase)

49、堿性磷酸酶堿性磷酸酶 (Alkaline phosphatase)DNA 聚合酶聚合酶 I 大片段大片段 (Klenow)T4 DNA 聚合酶聚合酶 (T4 DNA polymerase)T7 DNA 聚合酶聚合酶 (T7 DNA polymerase) Taq DNA 聚合酶聚合酶 (Taq DNA polymerase) 等熱穩(wěn)定等熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (Reverse transcriptase)末端脫氧多核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧多核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (Terminal deoxynucleotidyl transferase)多核苷酸激酶多核苷酸激酶 (Polynucle

50、otide kinase) DNA 核酸酶核酸酶 I (DNA nuclease I)S1 核酸酶核酸酶 (S1 nuclease)外切核酸酶外切核酸酶 III (Exonuclease III) 外切核酸酶外切核酸酶 ( Exonuclease)二、修飾酶二、修飾酶 (modifying enzymes)T4 DNA 連接酶連接酶, ATPTGCTTAA5 - 3 -ACG -OH 3 -P 5AATTCGTGCA- 3 - 55 P - 3 OH -TGCTTAA5 - 3 -ACG AATTCGT GCA- 3 - 5(一一) T4 DNA 連接酶連接酶 (T4 DNA ligase)

51、催化催化兩個(gè)兩個(gè) DNA 分子的分子的 3-OH 和和 5-P 之間形成磷之間形成磷酸二酯鍵。酸二酯鍵。連接帶粘性末端的兩個(gè)連接帶粘性末端的兩個(gè) DNA 分子分子T4 DNA連接酶連接酶, ATPACG5 - 3 -TGC -OH 3-P 5TAGCCGTATCGGCA- 3 - 5 5 P - 3 OH -5 - 3 -TGCTAGCCGTACGATCGGCA- 3 - 5連接帶平端的兩個(gè)連接帶平端的兩個(gè) DNA 分子分子 粘性末端粘性末端平端平端(二二) 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 (Alkaline phosphatase) 使使 DNA，RNA，rNTP 和和 dNTP 的的 5 末端末端 (5-P) 去磷去磷酸化。酸化。(三三) E. coli DNA 聚合酶聚合酶 I 的的 Klenow 片段片段 Klenow 片段是片段是 E. coli DNA 聚合酶聚合酶 I 的羧基端片段，的羧基端片段，長(zhǎng)度為全酶的長(zhǎng)度為全酶的 70；具有；具有 5 3 聚合酶活性及聚合酶活性及