現(xiàn)代生物技術(shù)

1、一、 生物技術(shù)總論生物技術(shù)(biotechnology )也稱生物工程(bioengineering），是人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他基礎(chǔ)科學(xué)的科學(xué)原理，采用先進(jìn)的工程技術(shù)手段，按照預(yù)先的設(shè)計，改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的的一門新興的、綜合性的學(xué)科。(1)基因工程（重組DNA技術(shù)，gene engineering）用人工方法把不同生物的基因分離出來，在體外進(jìn)行剪切、拼接、重組在一起，然后把重組體放回宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖，最終獲得基因產(chǎn)物。既用人工的手段改造生物的遺傳性狀，獲得基因產(chǎn)物。(2)細(xì)胞工程（cell engineering）指以細(xì)胞為基本單位，在體外條

2、件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為的使細(xì)胞某些生物學(xué)特征按人們的意愿發(fā)生改變，從而達(dá)到改良生物品種和創(chuàng)造新品種，加速繁育動植物個體，以獲得某種有用的物質(zhì)的過程。即：有目的，有計劃地改造細(xì)胞，能達(dá)到細(xì)胞產(chǎn)物及組織本身的規(guī)模生產(chǎn)。細(xì)胞工程包括：動植物細(xì)胞的體外組織培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)（也稱細(xì)胞雜交技術(shù)）、細(xì)胞器移植技術(shù)、克隆技術(shù)、干細(xì)胞技術(shù)等(3)酶工程（enzyme enineering）利用酶、細(xì)胞器或細(xì)胞所具有的特異催化功能，對酶進(jìn)行修飾改造，并借助生物反應(yīng)器和工藝過程來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一項技術(shù)。它包括酶的固定化技術(shù)、細(xì)胞的固定化技術(shù)、酶的修飾改造技術(shù)及酶反應(yīng)器的設(shè)計等技術(shù)。(4)發(fā)酵工程（fer

3、mentation engineering利用生物材料（來自自然界的微生物，基因重組微生物等各種來源的動物細(xì)胞和植物細(xì)胞）生產(chǎn)有用物質(zhì)，服務(wù)人類的一門綜合科學(xué)技術(shù)。是生物工程的主要基礎(chǔ)和支柱。給微生物一個最適合生長的條件，利用微生物的代謝功能，通過現(xiàn)代化工程手段生產(chǎn)人類所需的產(chǎn)品-微生物工程(5)蛋白質(zhì)工程（protein engineering） 在基因工程的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)、計算機(jī)輔助設(shè)計和蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)知識，通過對基因的人工定向改造等手段，從而達(dá)到對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾改造、拼接，以產(chǎn)生能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì) 。生物芯片又稱DNA芯片或基因芯片，是將高密度DNA片段陣列通

4、過高速機(jī)器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測等方面研究的一項新技術(shù)?，F(xiàn)代生物技術(shù)在人類生產(chǎn)生活中的作用1.改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn),解決食品短缺,提高農(nóng)作物產(chǎn)量及其品質(zhì)A、培育抗逆的作物優(yōu)良品系,如高產(chǎn)、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)、抗蟲、抗病、除草劑、固氮酶基因等如：抗除草劑大豆、抗黃矮病小麥、抗病毒馬鈴薯、耐貯運(yùn)番茄。 B、植物種苗的工廠化生產(chǎn)c、生物農(nóng)藥，生產(chǎn)綠色食品。 D、提高糧食、飼料品質(zhì)，如可飼性疫苗、富含VE的不飽和油料等功能性食品。E、生物固氮,減少化肥使用量發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn)a.動物的大量快速無性繁殖b.培

5、育動物的優(yōu)良品質(zhì)2 、提高生命質(zhì)量,延長人類壽命開發(fā)制造奇特而又貴重的新型藥品疾病的預(yù)防和診斷基因治療人類基因組計劃(human genome project, HGP)3.解決能源危機(jī),治理環(huán)境污染解決能源危機(jī)A、乙醇的生產(chǎn) B、沼氣或氫氣的生產(chǎn) C、提高石油的開采率環(huán)境保護(hù)A、用生物技術(shù)方法生產(chǎn)化工產(chǎn)品 B、利用微生物凈化有毒的化合物、降解石油污染、清除有毒氣體和惡臭物質(zhì)、綜合利用廢水和廢渣、處理有毒金屬等4.制造工業(yè)原料,生產(chǎn)貴重金屬制造工業(yè)原料氨基酸類；酸味劑；甜味劑；化工原料等生產(chǎn)貴重金屬 利用細(xì)菌的浸礦技術(shù)，提取貧礦、尾礦、廢渣里面的貴重金屬談?wù)勀銓D(zhuǎn)基因食品的看法（1) 轉(zhuǎn)基因食

6、品的優(yōu)點(diǎn)：可延長蔬菜的貨架期及感官特性提高食品的品質(zhì)提高食品的營養(yǎng)提高肉、奶和畜類產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量增加農(nóng)作物抗逆能力，增加農(nóng)業(yè)產(chǎn)量生產(chǎn)可食性疫苗或藥物生物功能性食品（2) 轉(zhuǎn)基因食品的安全性目前有一些證據(jù)指出轉(zhuǎn)基因食品具有潛在的危險但更多科學(xué)家的試驗表明轉(zhuǎn)基因食品是安全的任何一種轉(zhuǎn)基因食品在上市之前都進(jìn)行了大量的科學(xué)試驗，國家和政府有相關(guān)的法律法規(guī)進(jìn)行約束，而科學(xué)家們也都抱有很嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度。一種食品會不會造成中毒主要是看它在人體內(nèi)有沒有受體和能不能被代謝掉，轉(zhuǎn)化的基因是經(jīng)過篩選的、作用明確的，所以轉(zhuǎn)基因成分不會在人體內(nèi)積累，也就不會有害二、細(xì)胞工程細(xì)胞全能性（totipotency）：是指分

7、化細(xì)胞保留著全部的核基因組，具有生物個體生長、發(fā)育所需要的全部遺傳信息，具有發(fā)育成完整個體的潛能。植物細(xì)胞的全能性：植物組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體均具有培養(yǎng)成一株完整植物體的潛在能力。植物組織培養(yǎng)：以細(xì)胞全能性學(xué)說為理論基礎(chǔ)，在無菌和人工控制條件下，培養(yǎng)、研究植物組織、器官，甚至進(jìn)而從中分化、發(fā)育出整體植株的技術(shù)。外植體（explant）：能被誘發(fā)產(chǎn)生無性增殖系的器官或組織切段。細(xì)胞分化（cell differentiation）：指由于細(xì)胞分工而導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。細(xì)胞脫分化（cell dedifferentiation）：培養(yǎng)條件下使一個已分化的細(xì)胞失去已

8、分化細(xì)胞的典型特征，或消除了細(xì)胞分工，使之回復(fù)到分生細(xì)胞狀態(tài)或胚性細(xì)胞狀態(tài)的過程。或具有特異結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞轉(zhuǎn)化成沒有特異結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞的過程。細(xì)胞再分化（redifferentiatio）脫分化后無序生長的分生細(xì)胞在離體培養(yǎng)下，重新恢復(fù)細(xì)胞分化能力，經(jīng)過細(xì)胞分化、組織分化和器官分化遞進(jìn)地進(jìn)行，最后再生完整植株。愈傷組織：指由外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的松散排列的薄壁細(xì)胞團(tuán)極性（polarity）：植物的器官、組織、甚至單個細(xì)胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。體細(xì)胞胚（胚狀體、體胚）指離體條件下沒有經(jīng)過受精過程，由組培中體細(xì)胞（表皮細(xì)胞、薄壁組織細(xì)、葉柄或

9、側(cè)根的韌皮部細(xì)胞）組織經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚的類似物。擬分生組織：愈傷組織在分裂期會出現(xiàn)導(dǎo)管細(xì)胞，篩管細(xì)，分泌細(xì)胞，毛狀體細(xì)胞及木栓細(xì)胞等，并出現(xiàn)由小而密集的分裂細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞團(tuán)。形態(tài)建成：外植體細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下發(fā)生脫分化、再分化，產(chǎn)生芽和根，或者形成胚狀體，發(fā)育成苗或完整植株。原生質(zhì)體(protoplast)指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說一個被質(zhì)膜所包圍的裸露球形細(xì)胞。亞原生質(zhì)體(subprotoplast)在原生質(zhì)體分離過程中，有時會引起細(xì)胞內(nèi)含物的斷裂而形成的一些較小的原生質(zhì)體。它可以具有細(xì)胞核，也可不具有細(xì)胞核。核質(zhì)體(nuclearplast)由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)包圍細(xì)胞核形

10、成的小原生質(zhì)體。也稱為微小原生質(zhì)體。胞質(zhì)體(cytoplast)不含細(xì)胞核，而僅含有細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。條件培養(yǎng)基（conditioned medium）：培養(yǎng)過程中，有些細(xì)胞可能會分泌活性物質(zhì)到培養(yǎng)液中，這種培養(yǎng)過某種細(xì)胞以后，含有細(xì)胞分泌物的培養(yǎng)液稱為條件培養(yǎng)基?；颍涸囵B(yǎng)過一段時間組織或細(xì)胞的培養(yǎng)基。次生代謝：建立在初生代謝基礎(chǔ)之上的、對于植物正常的生長發(fā)育非必需的代謝，其代謝產(chǎn)物即為次生代謝產(chǎn)物。次生代謝產(chǎn)物(secondary metabolites)：是由次生代謝產(chǎn)生的一類細(xì)胞生命活動或植物生長發(fā)育正常運(yùn)行的非必需的小分子有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發(fā)育時期

11、的特異性。體細(xì)胞雜交（somatic hybridization):在離體條件下通過兩個親本體細(xì)胞原生質(zhì)體的融合以及隨后將融合產(chǎn)物培養(yǎng)成雜種植株的過程。同核體（homokaryon）：基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞；異核體（heterokaryon）：來自不同基因型的雜交細(xì)胞多核體：含雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的細(xì)胞間融合，融合體以一個細(xì)胞的核物質(zhì)為主，加有另外一個細(xì)胞少量的遺傳物質(zhì)。異胞質(zhì)體：含雙親中一方的染色體和雙親細(xì)胞質(zhì)的融合體。人工種子：又稱合成種子或體細(xì)胞種子，是指將植物離體培養(yǎng)的胚狀體或芽包裹在含有養(yǎng)分和保護(hù)功能的人工胚乳和人工種皮中的類似種子的顆粒。植物無糖組培技

12、術(shù) (Sugar-free micropropagation):又稱為光自養(yǎng)微繁殖技術(shù)，是指在植物組織培養(yǎng)中改變碳源的種類，以CO2代替糖作為植物體的碳源，通過輸入CO2氣體作為碳源，并控制影響組培苗生長發(fā)育的環(huán)境因子，促進(jìn)植株光合作用，使組培苗由兼養(yǎng)型轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)型，進(jìn)而生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗的一種新的植物微繁殖技術(shù)。植物種質(zhì)離體保存：是指對離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)等材料，采用限制、延緩或停止其生長的處理使之保存，在需要時可重新恢復(fù)其生長，并再生植株的方法。（一）、培養(yǎng)基的種類1.根據(jù)培養(yǎng)基態(tài)相A、固體培養(yǎng)基 加凝固劑(多為瓊脂)外植體只是部分接觸培養(yǎng)基，會使培養(yǎng)基中的效應(yīng)物質(zhì)產(chǎn)生一定

13、的濃度梯度，有利于外植體的分化、生長。（通氣性較好，便于操作，但營養(yǎng)分布不均，生長發(fā)育不整齊。）B、液體培養(yǎng)基 不加凝固劑 ，外植體能夠與效應(yīng)物質(zhì)更好地接觸，生長速度比在固體培養(yǎng)基中更快。（營養(yǎng)分布均勻，生長整齊一致，但通氣性差。）2.根據(jù)作用分為 誘導(dǎo)培養(yǎng)基 增殖培養(yǎng)基 生根培養(yǎng)基3.根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程 A、初代培養(yǎng)基-第一次接種外植體的培養(yǎng)基。 B、繼代培養(yǎng)基-接種初代培養(yǎng)之后培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。4、根據(jù)其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為 基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。A、基本培養(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基） 主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller

14、等。B、完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)等。植物離體無性繁殖(Propagation in vitro)：指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，對優(yōu)良植株的外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其在短期內(nèi)獲得遺傳性一致的大量再生植株的方法。這種離體無性繁殖方法由于繁殖速度快，又稱離體快速無性繁殖。植物快繁與傳統(tǒng)營養(yǎng)繁殖相比的優(yōu)點(diǎn)：A、繁殖效率高。生長速度快；B、培養(yǎng)條件可控制性強(qiáng)；C、占用空間??；D、管理方便，利于自動化控制；E、便于種質(zhì)交換和保存。植物的離體器官發(fā)生：培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)分化形成不定根、不定芽等器官的過程。植物快繁的器官再生主要分為五

15、種類型：短枝發(fā)生型：指外植體攜帶的帶葉莖段，在適宜的培養(yǎng)環(huán)境中萌發(fā)，形成完整植株，再將其剪成帶葉莖段，繼代再成苗的繁殖方法。叢生芽發(fā)生型：指外植體攜帶的頂芽或腋芽在適宜培養(yǎng)環(huán)境（含有外源細(xì)胞分裂素）中不斷發(fā)生腋芽而呈叢生狀芽，將單個芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根成苗的繁殖方法。不定芽發(fā)生型：指外植體在適宜培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，形成不定芽，后經(jīng)生根培養(yǎng)，獲得完整植株的繁殖方法。分為通過愈傷組織產(chǎn)生不定芽，和直接產(chǎn)生不定芽兩種方式。胚狀體發(fā)生型：指外植體在適宜培養(yǎng)環(huán)境中，經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚，從而形成小植株的繁殖方法。原球莖發(fā)生型：是蘭科植物特有的一種快繁方式。指莖尖或腋芽外植體經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生和種子萌發(fā)產(chǎn)生

16、原球莖的繁殖類型。原球莖可以增殖形成原球莖叢。與器官發(fā)生途徑相比，體細(xì)胞胚的特點(diǎn)體細(xì)胞胚最根本的特征是具有雙極性，即在發(fā)育的早期階段從方向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都是單極性的。體細(xì)胞胚的維管組織與外植體現(xiàn)存組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，而不定根或不定芽與外植體或愈傷組織的維管組織有聯(lián)系。體細(xì)胞胚胎的維管組織分布是獨(dú)立的Y字形結(jié)構(gòu)，不定芽維管組織無此結(jié)構(gòu)。合子胚胎發(fā)生：雙子葉植物：合子、原胚、球形胚、心型胚、魚雷胚和子葉胚單子葉植物：合子、原胚、球形胚、盾型胚和子葉胚體細(xì)胞胚胎發(fā)生：胚性愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚胎早期分化發(fā)育、體細(xì)胞胚胎成熟、體細(xì)胞胚胎萌發(fā)和成苗。雙子

17、葉植物：原胚、球形胚、心型胚、魚雷胚和子葉胚單子葉植物：與雙子葉誘導(dǎo)發(fā)生過程類似。形態(tài)上無魚雷型胚，成熟體胚上有燉盾片、胚芽鞘和胚根等結(jié)構(gòu)。細(xì)胞的不均等分裂是細(xì)胞極性建立的標(biāo)志（即細(xì)胞分化的標(biāo)志）胚狀體與合子胚的比較:植物快繁的程序包括四個階段：1、無菌（或初代）培養(yǎng)的建立 2、繁殖體增殖 3、芽苗生根 4、小植株的移栽馴化植物快繁的目的是以盡可能高的效率生產(chǎn)試管苗，獲得最大的經(jīng)濟(jì)效益。因此，在快繁時應(yīng)使各種影響因素處于最適合快繁的狀態(tài)。主要影響因素： 1、外植體2、培養(yǎng)基3、培養(yǎng)條件4、繼代培養(yǎng)5、移栽商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)注意的問題1.污染污染的來源：培養(yǎng)基及器具、器皿污染；外植體滅菌不徹底；操作原

18、因；環(huán)境原因等污染的控制：滅菌徹底；操作正確；保持操作區(qū)環(huán)境清潔無菌。2.遺傳穩(wěn)定性即保持原有良種特性問題。影響遺傳穩(wěn)定性的因素：基因型；繼代次數(shù)；器官發(fā)生方式。降低遺傳變異的措施：1、選用合適的基因型；2、減少繼代次數(shù)；3、采用合適的器官發(fā)生方式減少生長調(diào)節(jié)劑的使用濃度3.玻璃化：生理失調(diào)癥狀，表現(xiàn)為葉片、嫩梢呈水浸透明或半透明狀。葉片脆弱易碎，角質(zhì)層發(fā)育不全，沒有功能性氣孔。器官分化能力低，生根難，移栽后不易成活。玻璃化苗發(fā)生原因：瓊脂和蔗糖濃度偏低；培養(yǎng)溫度偏高；細(xì)胞分裂素濃度偏高；乙烯的影響；光照偏弱；培養(yǎng)基含量偏高等因素；通風(fēng)條件不好。防止玻璃化苗發(fā)生的措施：提高培養(yǎng)基硬度；降低培養(yǎng)

19、基水勢；提高蔗糖含量；增加培養(yǎng)瓶氣體交降低濕度；增加光照，降低溫度等；降低細(xì)胞分裂素含量；加入活性炭、多效唑或CCC等物質(zhì)。4.褐化：定義是由于培養(yǎng)材料中的酚類物質(zhì)被氧化形成。產(chǎn)生原因：植物種類和品種（如木本比草本更易褐化）；外植體年齡和取材料時間；外植體損傷程度；光溫因素；培養(yǎng)基成分。防止措施選擇合適外植體、合適的培養(yǎng)條件、使用抗氧化劑、連續(xù)轉(zhuǎn)移。愈傷組織的分化從外植體脫分化形成愈傷組織大致可分為三個時期：誘導(dǎo)期、分裂期、分化期。愈傷組織形態(tài)建成：不定芽方式和胚狀體方式器官分化的植物激素控制理論(激素配比模式)生長素與細(xì)胞分裂素的比值是根和芽形成的控制條件，決定著發(fā)育的方向:是愈傷組織、長根

20、還是長芽。高利于根的形成生長素/細(xì)胞分裂素適中利于愈傷組織的形成低利于芽的形成原生質(zhì)體的分離方法：1）、機(jī)械法：將細(xì)胞放在高滲糖溶液中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形后，再用機(jī)械法磨碎組織，從傷口處可釋放出完整的原生質(zhì)體。2）、酶解法：指將材料放入能降解細(xì)胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時間，在酶液的作用下，細(xì)胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質(zhì)體的方法。常用的酶種類：纖維素酶類（纖維素酶、半纖維素酶、崩潰酶Driselase）、果膠酶類（果膠酶和離析酶Macerozyme）、蝸牛酶和胼胝質(zhì)酶。原生質(zhì)體的收集和純化：1) 沉降法：利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進(jìn)行過

21、濾然后低速離心，使純凈完整的原生質(zhì)體沉積于試管底部。2) 飄浮法：采用比原生質(zhì)體密度大的高滲溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生質(zhì)體漂浮在液體表層的純化方法。3) 沉淀法和飄浮法結(jié)合：先沉淀后漂浮，重復(fù)操作，純化后可用于培養(yǎng)或細(xì)胞融合。4) 界面法：采用兩種比重不同的溶液，使原生質(zhì)體處于兩液相的界面之中，從而純化原生質(zhì)體的方法原生質(zhì)體鑒定目的：檢驗獲得的原生質(zhì)體是否真正的原生質(zhì)體鑒定方法(針對有無細(xì)胞壁)：1、低滲爆破法：原生質(zhì)體在低滲溶液中吸水脹破，觀察有無細(xì)胞壁碎片；2、熒光染色法：通過熒光增白劑染色后離心去除多余染料，在熒光顯微鏡下觀察（波長3600-4400Å）

22、，綠光顯示有纖維素，紅光示真正的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體活力檢測1、染色法 FDA法：FDA（二乙酸熒光素）本身不發(fā)熒光也不具有極性，能自由穿過細(xì)胞質(zhì)膜。活細(xì)胞內(nèi)FDA可以被酯酶裂解，將能發(fā)熒光的極性部分釋放出來。熒光素則不能自由穿越質(zhì)膜，在完整的活細(xì)胞內(nèi)積累。伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)不能穿過質(zhì)膜，有活力但受損傷的細(xì)胞和死細(xì)胞能夠攝取這種染料，活細(xì)胞不攝取。2、胞質(zhì)環(huán)流法：是否存在胞質(zhì)環(huán)流判斷原生質(zhì)體活力；3、滲透壓變化法：活原生質(zhì)體會隨外界滲透壓的變化體積變化4、氧電極法：活原生質(zhì)體在光照下光合放氧，無光呼吸耗氧原生質(zhì)體培養(yǎng)方法： 1、液體淺層培養(yǎng) 2、固體培養(yǎng) 3、液體固體雙層培養(yǎng) 4、瓊脂糖珠培養(yǎng)原生

23、質(zhì)體再生過程定義：指分離、純化的原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方法和良好的培養(yǎng)條件下，很快恢復(fù)細(xì)胞壁，再生細(xì)胞持續(xù)分裂形成細(xì)胞團(tuán)，最后或通過愈傷組織或通過胚狀體分化出完整植株的過程。1、細(xì)胞壁再生2、細(xì)胞分裂和愈傷組織或胚狀體形成3、植株再生植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的應(yīng)用1、利用原生質(zhì)體融合獲得融合細(xì)胞2、利用原生質(zhì)體進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)化3、利用原生質(zhì)體再生植株4、利用固定化原生質(zhì)體培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物 較多的分泌產(chǎn)物5、利用原生質(zhì)體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化通過原生質(zhì)體中存在的酶或酶系的催化作用，將酶作用的底物轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)物，提高轉(zhuǎn)化效率單細(xì)胞的分離機(jī)械法：將葉片輕輕研碎，經(jīng)過濾和離心，收集和凈化細(xì)胞。酶法：利用果膠酶、纖

24、維素酶處理植物葉片或其他外植體，使細(xì)胞分離?；瘜W(xué)法：利用一些化學(xué)藥劑游離細(xì)胞，如草酸鈣，秋水仙素等。單細(xì)胞的培養(yǎng)方法平板培養(yǎng)：將一定量細(xì)胞接種到或混合到裝有一薄層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)的方法?？醋o(hù)培養(yǎng)：是指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護(hù)單個細(xì)胞，使其持續(xù)分裂和增殖的一種培養(yǎng)方法；液體淺層培養(yǎng)：先將細(xì)胞制成一定密度的細(xì)胞懸浮液，用吸管將懸浮液移到培養(yǎng)皿中形成淺層，一般1mm左右，石蠟?zāi)し饪?，靜置培養(yǎng)。微室培養(yǎng)（微滴培養(yǎng)）：在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)：將植物游離細(xì)胞或細(xì)小的細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)的基本形式分批培

25、養(yǎng)(batch culture)：一個容器的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，細(xì)胞被分散到新的容器中繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)(continuous culture)：在一個容器（或者系統(tǒng)）中連續(xù)不斷的培養(yǎng)植物細(xì)胞。意義：植物細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)的研究某種生長限制因子對細(xì)胞生長的影響次生物質(zhì)的大量生產(chǎn)細(xì)胞生長曲線 在整個培養(yǎng)過程中，細(xì)胞數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，最后增長停止的細(xì)胞周期。 細(xì)胞的生長呈S形曲線1、滯后期 (lag phase) 2、指數(shù)生長期(exponential phase 3、直線生長期(linear phase) 4、減慢期(progressive deceleration phas

26、e 5、靜止期(stationary phase)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的同步化同步培養(yǎng)：指培養(yǎng)體系中大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞生長周期是一致的，即體系中大多數(shù)細(xì)胞都能同時通過每一個細(xì)胞生長周期階段。（1）物理方法A 按細(xì)胞團(tuán)的大小通過對細(xì)胞物理特性（細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)的大?。┑目刂疲詫崿F(xiàn)高度的同步化B 低溫休克法通過對生長環(huán)境條件（光照、溫度等）的控制，以實現(xiàn)高度的同步化（2）化學(xué)方法A 饑餓法使懸浮培養(yǎng)體系缺少一種細(xì)胞生長必須物質(zhì)，而使細(xì)胞穩(wěn)定地處于某一生長期，當(dāng)重新向培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)入到一新鮮營養(yǎng)完全的培養(yǎng)基時，細(xì)胞又恢復(fù)生長并實現(xiàn)細(xì)胞生長的同步化。B 抑制法使用DNA合成抑制劑，如5-氨基尿嘧啶、羥基尿和胸腺嘧啶

27、脫氧核苷，可阻止細(xì)胞周期進(jìn)程而使細(xì)胞集中在某一特定的生長周期。C 秋水仙素法秋水仙素是最有效的紡錘體形成抑制劑之一，可把細(xì)胞集中于細(xì)胞分裂期的中期。獲得次生代謝物的方法1、 從植物中提?。嚎煽?，但受到資源的限制，會破壞野生資源；人工栽培則占用土地、受病蟲害、自然災(zāi)害等因素的限制。2. 化學(xué)合成：產(chǎn)量高、成本低，但污染環(huán)境，而且有些物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以人工合成，如海南粗榧內(nèi)酯；有些雖然可以人工合成，但成本太高，如紫杉醇等。3. 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)：植物細(xì)胞不僅具有形態(tài)全能性，而且也有化學(xué)全能性（在離體條件下可以合成整株植物能合成的物質(zhì)）。體細(xì)胞雜交步驟：1、原生質(zhì)體的制備2 、原生質(zhì)體的融合3、雜

28、種細(xì)胞選4 、雜種細(xì)胞培養(yǎng)5 、由愈傷組織再生植株6 、雜種植株的鑒定原生質(zhì)體融合1、自發(fā)融合同種細(xì)胞在培養(yǎng)時2個靠在一起的細(xì)胞自發(fā)合并；2、誘發(fā)融合異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。物理法：顯微操作，電場刺激等化學(xué)法：硝酸鈉誘導(dǎo)、PEG結(jié)合高pH，高鈣離子法生物法：仙臺病毒法雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)：外觀選擇 遺傳互補(bǔ)篩選法 抗性互補(bǔ)篩選 生長特性篩選法 物理特性篩選法 其它方法：如采用顯微操作技術(shù)也能把單個異核體分離出來進(jìn)行培養(yǎng)。體細(xì)胞雜種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用1 對無性繁殖植物或性不育植物進(jìn)行遺傳重組對2個不能進(jìn)行有性繁殖的物種之間實現(xiàn)遺傳重組，體細(xì)胞融合目前看來是唯一途徑。性不育植物（單倍體

29、、三倍體和非整倍體），融合后產(chǎn)生可育的二倍體或多倍體。2 克服有性不親和性障礙由于存在不親和障礙，種間或?qū)匍g有性雜交雖能進(jìn)行，但難以產(chǎn)生雜種，而通過體細(xì)胞融合，有可能突破有性雜交的這種局限性。3 細(xì)胞質(zhì)遺傳性狀的轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cms）性狀的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移由細(xì)胞質(zhì)基因控制的重要農(nóng)藝性狀，如光和速率、對高溫和低溫的耐性，以及抗病性和抗除草劑特性等。1、花藥是花的雄性器官，花藥培養(yǎng)屬器官培養(yǎng)；2、花粉是單倍體細(xì)胞，花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)。3、花藥和花粉都可以在培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)單倍體細(xì)胞系和單倍體植株。4、單倍體植株經(jīng)過染色體加倍就成為純合二倍體植株，這樣可縮短育種周期，獲得純系?；ㄅ嘁殉蔀橹参镉N的一種

30、重要手段。 花粉和花藥培養(yǎng)的研究意義· 誘導(dǎo)形成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期· 有利于篩選隱性突變體，提高選擇效率· 獲得無病毒個體· 有利于隱性基因控制性狀的選擇· 快速獲得自交系的超雄株花藥培養(yǎng)一般選擇花粉的單核期進(jìn)行接種。單倍體植物天然發(fā)生的途徑：1、 孤雌生殖 也稱單性生殖，即卵不經(jīng)過受精也能發(fā)育成正常的新個體，如黃瓜。2、 無配子生殖 是指配子體可以配子的結(jié)合而直接產(chǎn)生孢子體的，如蕨類植物3、 孤雄生殖 是指由雄性配子直接進(jìn)行胚胎發(fā)育成新個體。通常由雜交或?qū)嶒炋幚砗螳@得的，自然界中很少發(fā)生單倍體植株染色體加倍的方法·

31、1、自然加倍· 2、人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、處理愈傷組織和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹單倍體植株的頂芽、腋芽，可得到能結(jié)實的二倍體植株。· 3、愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)，可得到二倍體植株脫毒方法1、 莖尖培養(yǎng)脫毒 2、熱處理脫毒 3、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒 4、愈傷組織培養(yǎng)脫毒5、珠心胚培養(yǎng)脫毒 6、微尖嫁接脫毒植物種質(zhì)離體保存：常用的離體保存方法有緩慢生長保存(slow growth conservation)和超低溫保存(cryopreservation)。前者適合中短期保存，后者用于長期保存。緩慢生長保存1降低培養(yǎng)溫度2 培養(yǎng)基中添加生長延緩劑或生長抑制劑來抑制

32、保存材料的生長，延長其繼代周期。3 提高培養(yǎng)基滲透壓4適宜的光照強(qiáng)度5合適的包扎物6培養(yǎng)基的營養(yǎng)控制，降低培養(yǎng)基中的養(yǎng)分水平7 降低培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣濃度超低溫冷凍保存為什么沒有把細(xì)胞凍死？細(xì)胞冰凍結(jié)冰保護(hù)性脫水理論溶液的玻璃化理論人工種子的組成、功能   1 體細(xì)胞胚n 為了使人工種子在一定條件下萌發(fā)生長，并形成完整植株，人工種子首先應(yīng)該具備一個能夠很好地發(fā)育成完整植株能力的胚，它具有胚根和胚芽的雙極性，經(jīng)原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉形胚等不同階段發(fā)育而成。 2、人工胚乳n 人工胚乳為體細(xì)胞胚萌發(fā)提供營養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)使用者的目的，可向人工胚乳內(nèi)自由添加有利于胚狀體正常萌發(fā)所需的各

33、種營養(yǎng)成分、防病蟲物質(zhì)、植物激素等，也是人工種子優(yōu)越于天然種子之處。3、人工種皮包裹在人工種子的最外層，對人工種子起到保護(hù)作用，保護(hù)人工種子內(nèi)部的水分和營養(yǎng)不致喪失和防止外部物理沖擊，還要保證通氣。三、基因工程基因是生物遺傳信息的載體，它是由核苷酸序列(通常為DNA)組成的生物大分子，決定著生物的所有性狀、行為和疾病的發(fā)生?；蛟诮Y(jié)構(gòu)上并不是不可分割的最小單位，一個基因還可以劃分為若干個小單位：突變單位（突變子 muton）：發(fā)生突變的最小單位。最小的突變子是一個核苷酸對。 重組單位（重組子 recon）：可交換的最小單位。最小的重組單位也可以只是一個核苷酸對。功能單位（順反子cis

34、tron，又叫作用子）：順反子是一個遺傳功能單位，一個順反子決定一條多肽鏈基因組:一個生物體的全部DNA序列。半保留復(fù)制1957年Crick又提出了遺傳信息傳遞的“中心法則” (central dogma)，揭示了遺傳信息的流向和表達(dá)問題?；蚬こ萄芯康睦碚撘罁?jù)（特點(diǎn)）1)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。(2)基因是可切割的(3)基因是可以轉(zhuǎn)移的(4)多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系(5)遺傳密碼是通用的(6)基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代基因工程一般操作步驟（1）分離帶有目的基因DNA片段；（2）通過體外重組將基因插入載體；（3）將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞并與之一起增殖；（4）擴(kuò)增克

35、隆的基因；（5）篩選重組體克隆。 （6）對克隆的基因進(jìn)行鑒定或測序；（7）控制外源基因的表達(dá)（8）得到基因產(chǎn)物或轉(zhuǎn)基因動物、植物?；蚬こ趟拇笠兀?供體基因 載體工具 受體細(xì)胞（細(xì)菌、植物和動物）l DNA的變性：在物理或化學(xué)因素的作用下，DNA互補(bǔ)堿基對之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋的兩條互補(bǔ)鏈松散而分開成為單鏈，從而導(dǎo)致DNA的理化性質(zhì)及生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變。l DNA的變性溫度：加熱DNA溶液，使其對260nm紫外光的吸收度突然增加，達(dá)到其最大值一半時的溫度，就是DNA的變性溫度（融解溫度，Tm）。Tm的高低與DNA分子中G+C的含量有關(guān)，G+C的含量越高，則Tm越高。l 核酸分子雜交：

36、兩條來源不同的單鏈核酸（DNA或RNA），只要它們有大致相同的互補(bǔ)堿基順序，經(jīng)退火處理即可復(fù)性，形成新的雜種雙螺旋。l 核酸雜交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA雜交。探針技術(shù) 將一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或熒光染料對它的末端或全鏈進(jìn)行進(jìn)行標(biāo)記，稱為“探針”然后用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來。印漬技術(shù)的類別及應(yīng)用1. DNA印漬技術(shù)： 又稱為Southern雜交，即DNA-DNA雜交分析，檢測DNA。 。2. RNA印漬技術(shù)： 又稱為Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析，檢測RNA。3. 蛋白質(zhì)印漬技術(shù)： 又稱

37、為Western雜交，或免疫印漬技術(shù)，即利用抗原-抗體反應(yīng)，檢測轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的特異性蛋白質(zhì)。 Ø 核糖核酸酶(ribonuclease, RNase)Ø 降解RNA分子成核苷酸。用于清除DNA制備物中 的污染的RNA分子，如Rnase A,B; Rnase H等。Ø 脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase)Ø 降解DNA分子成核苷酸。Ø 核酸外切酶(exonuclease)從分子鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵而生成單核苷酸作用的酶Ø 核酸內(nèi)切酶(endonuclease)Ø 非限制性核酸內(nèi)切酶:在

38、DNA分子內(nèi)部、不識別特定的序列、任意位置、隨即切割。Ø 限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶)(Restriction Endonuclease)可以識別DNA的特異序列，并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶，2. 限制性內(nèi)切酶的命名 1.用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名。 大腸桿菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 2. 用一個右下標(biāo)的大寫字母表示菌株或型。如EcoK, EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoRI）。 3. 如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限

39、制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoR I，EcoR V。 4. 限制酶前面要帶上R（Restriction)，修飾酶前面要帶上M（Modification）(現(xiàn)已省略)。限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA，產(chǎn)生2種不同的切口： 粘性末端平末端(blunt terminus)同裂酶：來源不同，但具有相同的識別序列。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生不同或相同的末端。同尾酶：識別位點(diǎn)不同，但切割后產(chǎn)生相同末端。l PCR (polymerase chain reaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，是指利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過變性-復(fù)性-延伸的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬倍的一種操

40、作技術(shù)。PCR基本原理： PCR是在試管中進(jìn)行DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與體內(nèi)相似，在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶等存在的條件下，特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應(yīng)。l PCR反應(yīng)的基本步驟：1變性(denaturing)：通常采用加熱變性，即將模板DNA或延伸后的雙鏈DNA加熱到94-950C，使雙螺旋DNA解開成為單鏈。 2復(fù)性(退火，annealing)：通過降低反應(yīng)溫度至550C（通常37-550C），使兩種引物能與兩條解開的DNA互補(bǔ)鏈的3端粘合，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3-OH。3延伸(extension)：將反應(yīng)溫度提高到70-720C，在

41、耐熱DNA聚合酶的催化下，根據(jù)模板DNA提供的堿基順序，合成兩條互補(bǔ)鏈，從而使模板DNA擴(kuò)增一倍。DNA連接酶的種類 （一）T4噬菌體DNA連接酶 ：1) 粘性末端的連接 2) 平頭末端的相連 （二）E.coli DNA連接酶 ：只能催化雙鏈DNA片段互補(bǔ)粘性末端之間的連接?；パa(bǔ)黏性末端片段之間的連接： E.coli DNA連接酶、 T4 DNA連接酶平末端片段之間的連接： T4 DNA連接酶DNA片段末端修飾后連接：用外切核酸酶VII將粘性末端修飾成平末端用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶將平末端修飾成粘性末端DNA片段加連桿或銜接頭后連接（補(bǔ)充知識）基因的結(jié)構(gòu)1、 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)2、真核細(xì)胞的基因

42、結(jié)構(gòu)a 真核生物基因表達(dá)調(diào)控過程更復(fù)雜； b 基因及基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同，如真核生物基因具有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)等； c 轉(zhuǎn)錄與翻譯的間斷性，原核生物轉(zhuǎn)錄與翻譯同時進(jìn)行，而真核生物該兩過程發(fā)生在不同區(qū)域，具有間斷性； d 轉(zhuǎn)錄后加工過程； e 正負(fù)調(diào)控機(jī)制； f RNA聚合酶種類多載體：是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的DNA分子構(gòu)成的一種遺傳成分；基因工程中，攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具稱為載體。二）載體應(yīng)具備的特征條件1.能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立和穩(wěn)定的自我復(fù)制2.具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)3.長度盡可能小，以提高其載裝能力4.具

43、有多種單一的酶切位點(diǎn)5.具有合適的選擇性標(biāo)記 克隆載體（cloning vector）：主要是對目的基因克隆，建立DNA文庫和cDNA文庫，其上有復(fù)制子即可；表達(dá)載體（expression vector）：能使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一類載體。這類載體既有復(fù)制子，更要有強(qiáng)啟動子；穿梭載體（shuttle vector）：這類載體可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。能在兩種不同的生物中復(fù)制的?；蚩寺≥d體基因克隆載體：能夠承載外源基因，并將其帶人受體細(xì)胞得以穩(wěn)定維持的 DNA 分子稱為基因克隆載體(gene cloning vector)。 l 應(yīng)具備的條件： 含有克隆位點(diǎn)，并且

44、盡可能的多。 能攜帶外源 DNA 片段(基因)進(jìn)入受體細(xì)胞并隨其同步復(fù)制。 含有標(biāo)記基因。 克隆載體必須是安全的。質(zhì)粒:是存在于天然細(xì)菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA，具有獨(dú)立復(fù)制的能力，通常帶有細(xì)菌的抗藥基因。三種構(gòu)型 :cccDNA （共價閉合環(huán)形DNA ）ocDNA（開環(huán)DNA）LDNA同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同： SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。 根據(jù)拷貝數(shù)多少，將質(zhì)粒劃分為兩大復(fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（stringent plasmid）只在細(xì)胞 周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)染色體不復(fù)制時，它也不能復(fù)制(拷貝數(shù)少，為1-5個)松弛型復(fù)制控制的

45、質(zhì)粒（relaxed）在整個細(xì)胞周期中隨時可以復(fù)制，在每個細(xì)胞中有許多拷貝， (可達(dá)10-200個拷貝) 當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時會嚴(yán)重影響寄主菌的正常代謝活動，導(dǎo)致寄主菌的死亡時，就需要低拷貝的載體。所有的質(zhì)粒載體都有三個共同的特征：復(fù)制子、克隆位點(diǎn)和選擇性標(biāo)記復(fù)制子是含有DNA復(fù)制起始位點(diǎn)的一段DNA（ori），也包括表達(dá)由質(zhì)粒編碼的復(fù)制必需的RNA和蛋白質(zhì)的基因。克隆位點(diǎn)是限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，外源性DNA可由此插入質(zhì)粒內(nèi)，而且并不影響質(zhì)粒的復(fù)制能力，或為宿主提供選擇性表型。選擇性標(biāo)記對于質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存在時必不可少的。選擇性標(biāo)志：編碼抗生素抗性的基因?qū)|(zhì)粒載體來說是最普遍的

46、細(xì)菌選擇性標(biāo)志（如pBR322）；主要的抗生素選擇基因有：氨芐青霉素，氯霉素，四環(huán)素和卡那霉素四種。插入失活當(dāng)外源基因(或DNA片段)插入到某一基因內(nèi)的位點(diǎn)后, 使這個基因喪失了原有的功能叫插入失活標(biāo)記基因的種類 1. 抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） a.  抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金屬抗性基因: Cur ，Znr ，Cdr c. 代謝抗性基因: TK，抗除草劑基因 2. 營養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1

47、，URA3，LEU2，HIS4等。 3. 生化標(biāo)記基因其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ， GUS，CAT 4. 噬菌斑三、構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略（Slightly more exotic plasmid vectors）1 能在轉(zhuǎn)化的受體中進(jìn)行有效復(fù)制、有較多拷貝數(shù)（松弛型的質(zhì)粒ori）。2 克隆位點(diǎn)：盡可能多一些，至少有一個?？捎?MCS連桿，MCS是指含多種內(nèi)切酶識別序列的多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site），又稱多聚接頭（polylinker）。3 篩選標(biāo)記基因：選擇標(biāo)記區(qū)內(nèi)有合適的克隆位點(diǎn)，當(dāng)外源DNA插入時，標(biāo)記gene將失活而成為篩選的標(biāo)識。

48、4 構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體應(yīng)盡可能小。大于15kb的plasmid轉(zhuǎn)化效率明顯。5 根據(jù)需要，使構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體組裝各種“元件”（小DNA片段）。如插入啟動子，終止子。病毒克隆載體噬菌體是吃細(xì)菌的病毒顆粒（viruses, “eater of bacteria”）。病毒由DNA（or RNA）、外殼蛋白組成，經(jīng)包裝后成為病毒顆粒。進(jìn)入宿主細(xì)胞后，利用宿主細(xì)胞的合成系統(tǒng)進(jìn)行DNA（or RNA）復(fù)制和殼蛋白的合成。DNA和RNA不能共存于同一種病毒中。噬菌體有嚴(yán)格的宿主專一性，限制了其作為載體使用的范圍。溫和噬菌體（Temperate phages ）：插入宿主染色體DNA隨著宿主細(xì)胞的復(fù)制而復(fù)制

49、溶原階段（Lysogenic Cycle）烈性噬菌體（Virulent phages）：不插入宿主染色體DNA自主復(fù)制溶菌階段（Lytic Cycle）真核細(xì)胞應(yīng)用的載體 1 Ti 質(zhì)粒（ Ti：Tumor-induce腫瘤誘發(fā)）根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)與Ti質(zhì)粒的G-菌，可侵入90科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤(crown gall tumor)。目的基因：在基因工程設(shè)計和操作中，被用于基因重組、改變受體細(xì)胞性狀和獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物的基因。內(nèi)含子是阻斷基因線性表達(dá)的序列。DNA上的內(nèi)含子會被轉(zhuǎn)錄到前體RNA中，但RNA上的內(nèi)含子會在RNA離開細(xì)胞核進(jìn)行

50、轉(zhuǎn)譯前被剪除。外顯子：在成熟mRNA被保留下來的基因部分被稱為外顯子。基因文庫：一個生物體的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶部分酶切后，將酶切片段克隆在載體DNA分子中，所有這些插入了基因組DNA片段的載體分子的集合體，將包含了這個生物體的整個基因組，也就是構(gòu)成了這個生物體的基因文庫。 基因組DNA文庫:將某一種基因DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱為基因組DNA文庫。含有外顯子和內(nèi)含子。cDNA文庫：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段分別與克隆載體重組，并將其引入到相應(yīng)的宿主細(xì)胞中繁殖和擴(kuò)增，理論上此群體就包含

51、有該物種的全部mRNA信息。受時空限制，不含內(nèi)含子?；蚪M文庫和部分基因文庫的比較2.基因文庫的構(gòu)建方法直接分離法多用于原核生物（真核生物）人工合成法、（1） 鳥槍法（2） 反轉(zhuǎn)錄法（3）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 反轉(zhuǎn)錄法以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，再反轉(zhuǎn)錄酶的催化下反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，即cDNA，從而獲得所需的基因。獲取目的基因的方法1、用限制性內(nèi)切核酸酶酶切法直接分離目的基因 2、從基因文庫中獲取 3、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增 4、利用化學(xué)方法人工合成1 受體細(xì)胞受體細(xì)胞選擇依據(jù)： 便于重組 DNA 分子的導(dǎo)入和篩選克隆子； 重組

52、DNA 分子在受體細(xì)胞內(nèi)能穩(wěn)定維持； 適于外源基因的高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的分泌或積累；具有較好的翻譯后加工機(jī)制，便于真核目的基因的高效表達(dá)； 遺傳性穩(wěn)定，對遺傳密碼的應(yīng)用上無明顯偏倚性； 易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵；在理論研究或生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值。 安全性高，不會對外界環(huán)境造成生物污染；受體細(xì)胞種類l 原核生物細(xì)胞 大多無細(xì)胞壁，易于外源DNA的導(dǎo)入 無核膜，染色體DNA無固定結(jié)合蛋白，易于DNA重組。 基因組小，易于分析外源基因。 多單細(xì)胞生物，培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，重復(fù)快。l 真核生物細(xì)胞 酵母 植物細(xì)胞 動物細(xì)胞2 重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化： 外源DNA轉(zhuǎn)化法目的基因進(jìn)入_受體細(xì)胞_

53、內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_穩(wěn)定_和_表達(dá)_的過程轉(zhuǎn)導(dǎo)是指通過噬菌體將一個宿主的DNA轉(zhuǎn)移到另一個宿主的細(xì)胞中而引起的基因重組現(xiàn)象 轉(zhuǎn)染（transfection）采用與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞相似的方法，即宿主菌先經(jīng)過CaCl2，電穿孔等處理成感受態(tài)細(xì)菌，再將重組噬菌體DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌的噬菌體DNA可以同樣復(fù)制和繁殖，這種方式稱為轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源DNA轉(zhuǎn)化法(1)化合物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(2)Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 (3)電穿孔轉(zhuǎn)化法(4)微彈轟擊轉(zhuǎn)化法 (5)激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法 (6)超聲波處理轉(zhuǎn)化法(7)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(8)體內(nèi)注射轉(zhuǎn)化

54、法(9)花粉管通道轉(zhuǎn)化法(10)精子介導(dǎo)法 (11)低能離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells): 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞(competent cells) 。重組 DNA ：將目的基因（外源 DNA 分子）用 DNA 連接酶在體外連接到適當(dāng)?shù)妮d體上，即 DNA 分子的體外重組，這種重新組合的 DNA 稱為重組 DNA 重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子：接納載體或重組分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換，把它組合到自己的基因組中，從而獲得供體菌部分遺傳

55、性狀的現(xiàn)象。重組子的篩選和鑒定一、載體表型選擇法 1.抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法 2. b-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法二、根據(jù)插入基因的表型選擇利用插入的外源基因的表達(dá)產(chǎn)物特性進(jìn)行直接選擇。（只在特定條件下）。 1.彌補(bǔ)缺陷：轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受體菌株的突變型缺陷 2. 增加新性狀：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等三、DNA電泳檢測法：直接電泳、酶切電泳、PCR擴(kuò)增四、核酸雜交檢測：Southern雜交、Northern雜交五、免疫化學(xué)檢測：Western雜交、酶聯(lián)免疫吸附測定。四 五 六 發(fā)酵 酶 蛋白 工程微生物工程：它是一門將微生物學(xué)、生物化學(xué)和化學(xué)工程學(xué)的基本原理有機(jī)地結(jié)合起來，利用微生物的生長和代謝活動來生產(chǎn)各種有用物質(zhì)的工程技術(shù)。由于它以培養(yǎng)微生物為主，所以又稱微生物工程。 發(fā)酵工程：指在最適發(fā)酵條件下,在發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的技術(shù)。  發(fā)酵工程包括代謝工程和發(fā)酵工藝兩個主要內(nèi)容。 微生物轉(zhuǎn)化是利用微