醫(yī)學遺傳學試驗講義

1、醫(yī)學遺傳學實驗講義浙江大學醫(yī)學院醫(yī)學遺傳學課程組2012年9月3日實驗一人類外周血染色體標本制備一、實驗目的通過實驗了解和掌握人類外周血染色體標本培養(yǎng)和制備的基本方法。二、實驗原理正常情況下， 外周血中的小淋巴細胞， 幾乎都處在 G1 期或 G0 期，外周血細胞中是沒有分裂相的。 1960 年， Nowell 和 Morhead 證實，外周血中的小淋巴細胞可以在植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA ）或其它有絲分裂刺激劑的影響下，在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨湍讣毎?，在培養(yǎng)中進行有絲分裂。這樣經(jīng)過短期培養(yǎng)（colchicine ），秋水仙素的處理，低滲和固定，就可以迅速而又簡便地獲得

2、體外生長的細胞群體和有絲分裂相。本方法已為臨床醫(yī)學、病毒學、藥理學、遺傳毒理學等方面廣泛應用。三、實驗準備實驗材料人外周血（淋巴細胞）實驗器具離心機、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、培養(yǎng)瓶、刻度離心管、注射器和針頭（6 1/2 號）、吸管、量筒、火柴、酒精燈、pH 計、研缽、飯盒、超凈工作臺、鑷子、載玻片、玻片盒、燒杯、染缸、試管架、玻璃鉛筆或記號筆、顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙等。藥品和試劑1培養(yǎng)液的配制RPMI1640 培養(yǎng)基 ( 含 L- 谷氨酰胺和碳酸氫鈉)80%小牛血清 (56水浴滅活30 分鐘，滅活可破壞補體及一些污染的病毒)20%植物血凝素PHA ( 主要成分是粘多糖和蛋白質(zhì),可用培養(yǎng)基溶解)

3、4%青霉素終濃度100U/ml鏈霉素終濃度100U/ml用 3.5%NaHCO 3 調(diào) pH7.0 7.2，用玻璃濾器，抽濾滅菌。在超凈工作臺，分裝到培養(yǎng)瓶中（每瓶含培養(yǎng)基 5 ml ）。培養(yǎng)液置于 -20冰箱保存。 使用前從冰箱中取出， 溫育至 37。2肝素濃度為 0.2% ，作為抗凝劑使用。200 mg 肝素粉末溶于100 ml 生理鹽水中。高壓滅菌，-4冰箱保存?zhèn)溆谩? KCl濃度為 0.075 M ，0.559 g 氯化鉀溶于 100 ml 雙蒸水中。氯化鉀作為低滲液的優(yōu)點是染色體輪廓清楚，可染性增強，時間縮短。4秋水仙素10 g/ml ，作為有絲分裂的阻止劑，抑制細胞分裂時紡錘體形成

4、，使細胞分裂停止在中期。稱取10 mg 秋水仙素溶于100 ml 生理鹽水中，配成100g/ml 的原液，分裝小瓶，高壓滅菌， -20冰箱保存?zhèn)溆?。臨用時取上述原液用生理鹽水稀釋成10g/ml 。5甲醇6冰醋酸7吉姆沙 (Giemsa)染液吉姆沙原液：先將0.5g 吉姆沙粉末干研磨，時間越長越好；加33 ml 60 預熱的純甘油，在研缽中研磨，放在60恒溫水浴中保溫90 分鐘。冷卻后，再加入33 ml 甲醇，充分攪拌，用濾紙過濾，收集在棕色瓶中保存，作為原液。原液要提前半年配制。原液中按比例加入磷酸緩沖液即可染染色體標本。21 份 Giemsa 原液 9 份磷酸緩沖液8磷酸緩沖液 (pH 6.

5、8)溶液 A ：磷酸二氫鉀(KH 2 PO4.2H 2O) 9.078 g 溶于 1000ml 蒸餾水中。溶液 B ：磷酸氫二鈉(Na2HPO4.2H 2O) 11.876 g 溶于 1000ml 蒸餾水中。100ml 緩沖液：需溶液A50.8 ml ，溶液 B 49.2 ml 。四、實驗步驟1采血先在供血者肘部用酒精棉球消毒，取2 ml 干燥滅菌注射器，配上針頭（6 1/2 號）并吸取肝素液 0.2 ml 濕潤針筒，采靜脈血2 ml ，轉(zhuǎn)動針筒使血與肝素混勻。2培養(yǎng)采血完畢立即將針頭插入含RPMI 1640 培養(yǎng)瓶內(nèi)（瓶蓋預先用酒精棉球消毒），每瓶滴入 30 滴血，搖勻。 2 ml 血可分裝

6、三至四瓶。置 37 0.5恒溫中培養(yǎng) 72小時，其間可搖動 23 次。3秋水仙素 (colchicine) 處理在終止培養(yǎng)前23 小時，加入秋水仙素，6 1/2 號針頭 3 滴（每 ml 約 60 滴），使細胞分裂終止在中期。 秋水仙素的濃度不宜過高和作用時間過長， 雖然這樣做可以得到較多的分裂相，但導致染色體過分縮短，不宜用于顯帶分析。4離心將培養(yǎng)物倒入刻度離心管內(nèi)，以 1000rpm 離心 10 分鐘，棄去上清液，留底層沉淀物并用吸管打勻。5低滲處理加 8 ml 預溫 (37) 的 0.075 M KCl 低滲液，用吸管打勻使細胞懸浮于低滲液中， 37水浴箱靜止 2530 分鐘， 使白細胞

7、膨脹， 染色體分散， 紅細胞解體。 低滲處理的效果與低滲的成分、 處理的時間和溫度有關。 這是比較關鍵的一步， 對任一組織和低滲液都要事先進行預實驗，以確定最合適的處理時間。6預固定在低滲 2530 分鐘后，加新配置的固定劑（甲醇:冰醋酸， 3:1 ） 1ml ，打勻。這樣有助于細胞的均勻懸浮而不團聚凝塊和防止細胞丟失。甲醇和冰醋酸要現(xiàn)配現(xiàn)用，如放置時間較長，即不宜再用，以免影響固定效果。7再離心1000 rpm 離心 10 分鐘，棄去上清液，留沉淀物。8固定沿離心管壁加入新配制的固定液 （甲醇 :冰醋酸， 3:1 ）至 5ml ，將沉淀物打勻， 固定 1525 分鐘。9再離心1000 rpm

8、 離心 10 分鐘，棄去上清液。10再固定：加入新配制的固定液（甲醇: 冰醋酸， 1:3）至 5 ml 打勻，固定1525 分鐘。11再離心1000 rpm 離心 10 分鐘，棄去上清液。12再固定加入新配制的固定液（甲醇 : 冰醋酸， 1:1）至 5 ml 打勻，固定 1525 分鐘，或冰箱中放置數(shù)小時，也可以過夜。13制片3經(jīng)上述固定后， 1000 rpm 離心留下約 0.3 ml 沉淀物，打勻。用吸管吸取細胞懸液，滴在已用冰水浸泡的潔凈載玻片上， 立即用嘴吹散， 在酒精燈焰上通過幾次， 使細胞平鋪于載玻片上，空氣干燥（或用電吹風吹干） 。14染色用 Giemsa 染液染色8 分鐘，玻片用

9、自來水沖洗，晾干。15鏡檢將染色后的玻片先用低倍鏡全面檢查，找到良好的分裂相，換用高倍鏡、 油鏡觀察分析。五、注意事項1在采血接種培養(yǎng)時，注意不要加入太多的肝素。肝素過多時可能引起溶血和抑制淋巴細胞的轉(zhuǎn)化和分裂；但肝素也不能過少，以免發(fā)生凝血現(xiàn)象。2培養(yǎng)基中不含L- 谷氨酰胺和碳酸氫鈉，則溶解有RPMI1640 培養(yǎng)基的液體可先用濃鹽酸調(diào)pH4.0，然后高壓滅菌（注意121， 0.15 MPa ，滅菌 15 分鐘）。冷卻后，再加入L- 谷氨酰胺、碳酸氫鈉、PHA 、滅活小牛血清和雙抗，再調(diào)pH7.0，分裝備用。 L- 谷氨酰胺和碳酸氫鈉用微孔濾膜過濾滅菌，不能高壓滅菌。3接種的血樣愈新鮮愈好，

10、最好在24 小時內(nèi)培養(yǎng)。如果不能立刻培養(yǎng)，應置于4冰箱，保存時間過久會影響細胞活力。4 溫度和培養(yǎng)液的酸堿度十分重要。人的外周 血中淋巴細胞培養(yǎng)最適 溫度為370.5，溫度過高過低都將影響細胞的生長，但細胞對低溫比對高溫耐受力強；若是中途停電，可相應延長培養(yǎng)時間。培養(yǎng)液的最適 pH7.27.4，偏酸，細胞發(fā)育不良；偏堿，細胞會出現(xiàn)輕度固縮。5 PHA 的質(zhì)量和濃度是培養(yǎng)成敗的關鍵問題。PHA 如果保存時間太長，效價會降低，應在培養(yǎng)基中多加一些。6培養(yǎng)過程中，如發(fā)現(xiàn)血樣凝集可輕輕震蕩，使凝集塊散開，繼續(xù)培養(yǎng)。7最好使用水平式離心機，離心速度不易過高，否則沉降在管底的細胞團不易打散；反之，離心速度

11、太低，細胞會丟失。8培養(yǎng)失敗的可能原因（ 1） 培養(yǎng)瓶等器材洗滌不合要求。（ 2） 配制培養(yǎng)液使用的二或三蒸水不合要求。（ 3） PHA 和培養(yǎng)基存放時間過長。（ 4） 無菌操作不符合要求，發(fā)生細菌污染。9標本質(zhì)量不佳的原因（ 1） 秋水仙素處理不當。 秋水仙素的濃度、處理時間不夠，結果分裂相少；如果秋水仙素的濃度過高、處理時間過長，則使染色體過于縮短，難以進行分析。工作時，需要摸索處理時間和濃度。（ 2） 低滲處理不當。低滲時間過長時，細胞膜往往過早破裂，導致分裂細胞丟失或染色體丟失；低滲處理時間不足時， 細胞膨脹不夠，染色體分散不佳， 難以進行染色體計數(shù)和分析。低滲時間的掌握與氣溫有關。（

12、 3） 離心速度不合適。如果從培養(yǎng)瓶收集細胞進行離心時的速度太低，細胞丟失；如低滲后離心速度過高，則往往分裂細胞過早破裂，分散良好的分裂相多被丟失。（ 4） 固定不充分。如固定液不新鮮，染色體形象模糊，呈毛刷狀，染色體周圍有胞漿背景。因此，固定液純度要高，臨用時新鮮配制。六、作業(yè)選擇觀察10 個較好的細胞分裂相，計數(shù)染色體數(shù)目。4附染色體培養(yǎng)實驗器材的準備細胞培養(yǎng)和染色體制片過程中所用的培養(yǎng)瓶等玻璃器材和橡皮塞等在使用前，都要經(jīng)過嚴格的洗刷、浸泡、蒸餾水洗和滅菌等過程，以保證清潔無菌。一、器材的清洗1清洗液的配制重鉻酸鉀120g濃硫酸160ml蒸餾水1000ml先將重鉻酸鉀倒入蒸餾水中，然后慢

13、慢加入濃硫酸，邊加入邊用玻璃棒攪拌。由于加入濃硫酸時會產(chǎn)生高溫，所以不能用玻璃容器，而可用塑料桶或陶瓷缸。配制好的清潔液，應儲存在有蓋的容器內(nèi)。 如清潔液已呈綠黑色時， 表明已經(jīng)失效， 不能再用。 硫酸的腐蝕性強，操作時要戴防護手套，不能用金屬鑷子去夾玻璃瓶等。2一般玻璃器皿的處理玻璃器皿先用自來水洗去贓物，用肥皂液煮沸30 分鐘后，趁熱刷洗干凈，用自來水沖洗去掉肥皂殘跡，空氣干燥。放入清潔液中浸泡1 天，然后取出，自來水充分沖洗，在蒸餾水中浸泡一天，再換一次蒸餾水，浸泡一天。置80 烤箱中烘干。用牛皮紙包扎瓶口，干熱滅菌 150 2 小時。3玻璃細菌濾器的處理新購濾器用自來水刷洗后，裝上新配

14、洗滌液（化學純濃硫酸6ml ，化學純硝酸鈉2g，蒸餾水 100 ml ），讓其自然濾過，然后用自來水、蒸餾水反復濾過，接著用1M 的 NaOH 溶液過濾至液體呈中性。空氣干燥，用牛皮紙或玻璃紙包好，高壓滅菌。用過的濾器必須立即進行清洗，先在清潔液中浸泡一天，然后自來水沖洗，蒸餾水浸泡一天，蒸餾水抽濾多次，使堵塞濾孔的物質(zhì)完全除去。4橡膠類制品的處理新橡膠類制品用水刷洗后，用2%的 NaOH 溶液煮沸20 分鐘，然后用自來水沖洗，用2%的 HCl 溶液煮沸20 分鐘，自來水洗，蒸餾水中浸泡24 小時，晾干，牛皮紙包扎，高壓滅菌。用過的橡膠類制品立即泡于清水中，用肥皂液刷洗后，用自來水沖洗，蒸餾水

15、中浸泡24 小時，晾干，牛皮紙或玻璃紙包扎，高壓滅菌。5載玻片的處理將載玻片一片一片放入肥皂溶液煮沸 20 分鐘，刷洗干凈后，用自來水沖洗，蒸餾水中浸泡 24 小時，放入裝有蒸餾水的飯盒中，置冰箱中冷凍待用。二、滅菌1干熱滅菌（ dry heat sterilization ）一般采用電熱鼓風干燥箱進行干熱滅菌。一般玻璃和金屬器材都可使用干熱滅菌，較為方便。布類、橡皮類、液體不能用干熱滅菌。滅菌時的溫度和時間是：150干烤 2 小時。必須注意以下事項：（ 1） 放置入烤箱的物品，要間隔一定距離，以免影響滅菌效果。特別不要將包扎紙直接與烤箱箱壁或箱底接觸，以免在高溫下烤焦、起火。（ 2） 烤箱電

16、源打開后，門上應掛一個標示牌，以免他人誤開箱門，使冷空氣突然進入烤箱，造成玻璃器皿破裂。（3） 先加熱至 80左右，使箱內(nèi)空氣完全排空后，再關閉氣門， 150烤 2 小時后自然冷卻。（4） 干熱滅菌過程中，應有專人負責照看。52高壓滅菌(autoclaving sterilization)一般用手提式電熱高壓蒸汽滅菌鍋，既經(jīng)濟又省時， 效果也好， 是實驗室經(jīng)常采用的方法。一般玻璃器材、玻璃濾器、橡膠類制品、布類和一些溶液都可用高壓滅菌。滅菌時不要裝的太滿，液體不要裝瓶過滿，瓶塞上插上一個注射針頭，以免高壓過程中容器炸裂或瓶塞掉出。擰緊鍋蓋后，打開電源，打開排氣孔，待升溫至排氣孔排出氣流呈直線，

17、冷空氣已基本排出時，關上排氣孔。直至氣壓達0.15 MPa 后，繼續(xù)滅菌20 分鐘。滅菌完畢后，關上電源，待壓力自然下降，溫度降低后再打開鍋蓋，取出物品。趁熱放入 80烘箱內(nèi)烘干待用。3過濾除菌( filter sterilization )細胞培養(yǎng)中的常用的生物性物質(zhì)，如培養(yǎng)液、血清、酶溶液等不能用高熱或高壓滅菌，只能用過濾法除菌。此外，NaHCO3 等類物質(zhì)遇高熱時會發(fā)生分解，故需要用過濾法除菌。（ 1）玻璃濾器有六個型號，其中G6 型濾器可以有效的除菌。玻璃濾器在高壓滅菌之后，板上將析出少量堿性物質(zhì)，所以，用它過濾后，液體的 pH 值將會有所增高，因此，在調(diào)配液體時應考慮這一情況。 用玻

18、璃濾器抽濾時， 抽濾不要過快， 以濾液分滴濾下較為合適。注意避免液體抽干后仍在繼續(xù)抽濾。（ 2） 微孔濾器濾膜常用醋酸纖維薄膜，具有靈敏度高、方便、經(jīng)濟省時的優(yōu)點。濾器的后方接一個5ml 的注射器。濾膜可以耐高壓滅菌， 0.2 m 孔徑的內(nèi)膜的除菌效果即與 G6 型玻璃濾器相當。6實驗二人類染色體核型分析一、實驗目的通過實驗掌握染色體核型分析的常用方法以及 G 帶的帶型特征和識別技巧，初步學會識別 G 帶染色體。二、實驗原理將一個細胞內(nèi)的染色體按照一定的順序排列起來構成的圖像就稱之為該細胞的核型(karyotype) ，這通常是用顯微攝影得到的染色體相片剪貼而成（目前可通過相關軟件在電腦中自動

19、排列）。在顯帶技術問世以前，人們主要根據(jù)染色體的大小、著絲粒的位置，將人類染色體順次由 1 編到 22 號，并分為七組。但要想精確、有把握地鑒別每條染色體是比較困難的。 70 年代初出現(xiàn)了染色體顯帶技術，不僅解決了染色體識別困難的問題，而且為深入研究染色體異常及基因定位創(chuàng)造了條件。將染色體標本用顯帶方法處理后，再用Giemsa 染色，這類技術就稱為G 分帶，通過顯微攝影，就可得到G 帶染色體的顯微相片。三、實驗準備實驗材料：顯微相片1份2張。實驗器材：鑷子、剪刀、膠水、實驗報告紙。四、實驗步驟1先貼一張相片于報告紙上方。2將另一相片上的染色體逐個剪下，按丹佛和人類染色體遺傳學命名的國際體制（I

20、SCN ）排列編號。粘貼時短臂向上，長臂向下。3在分析結果中，寫出該細胞的核型式，注明性染色體。五、作業(yè)剪貼正常男性或女性染色體顯微相片一張。附人類染色體 G 分帶特征描述1 號染色體最突出的特征是在長臂近著絲粒處有一塊濃染的塊狀物質(zhì)。長臂有5 條深帶，中央一條最寬最深。短臂近著絲粒端1/2 處有 2 條寬闊的深帶，遠端有34 條較窄的淡帶。2 號染色體與 1 號染色體相比為亞中著絲粒并缺乏明顯的界標。長臂有4 5 條分布均勻的深帶，中央2 個常融合為1 個帶。3 號染色體中央著絲粒染色體，帶型近乎對稱。 兩臂的近端和遠端染色甚深，而中心部位染色較淺。4 號染色體與 5 染色體相比著色均勻。長

21、臂上有4 5 條很均勻的深帶，短臂中央有12 條深帶。5 號染色體長臂中部有一寬的中央帶，遠端有2 個深帶。短臂可見1 2 條深帶，遠端的深帶寬且色濃。6 號染色體長臂有 4 條均勻的帶， 短臂中部有一明顯而寬闊的淺帶，其近、 遠端各有一深帶， 近端深帶緊貼著絲粒。7 號染色體長臂有 3 條帶，遠端一條較淺。 短臂上有3 條深帶，遠端一條較寬且色深，有如“瓶蓋”。8 號染色體長臂中部有一寬帶，短臂有2 條分布均勻的深帶，中部有一較明顯的淺帶。79 號染色體長臂有 2 條均勻隔開的明顯深帶，短臂有特別的心形外貌，近端和中部各有一深帶。10 號染色體長臂有 3 條明顯的深帶，其中近端一條帶最深，短

22、臂近端和近中部有一寬帶。11長臂緊貼著絲粒有一深帶， 遠端可見一明顯的較寬的深帶， 這條深帶與近端的深帶之間的 1 條寬闊的淺帶。短臂近中部有一深帶。12 號染色體長臂緊貼著絲粒有一深帶，中部有一寬的深帶， 這條深帶與近端深帶之間有一明顯淺帶。但與 11 號染色體比較，這條淺帶較窄，是區(qū)別11、 12 號染色體的主要特征。13 號染色體長臂可見 4 條深帶。14 號染色體長臂近端有一深帶，其遠端也有一明顯的深帶。15 號染色體長臂近中部有一明顯的深帶，遠端著色淺，有時可見2 條淺帶。16 號染色體長臂中和遠端各有一深帶，有時遠端不明顯。短臂染色淺，可有1 2 條帶。17 號染色體長臂遠端有一深

23、帶， 這條帶與著絲粒之間為一明顯而寬的淺帶。 短臂上的一條窄帶緊貼著絲粒。18 號染色體長臂有 2 條寬帶，近端一條較遠端的寬些，短臂上有一窄帶。19 號染色體著絲粒及周圍為深帶，其余均為淺帶。20 號染色體兩臂的遠端著色，短臂著色較長臂深些。21 號染色體長臂近端有一寬闊深帶，遠端淺染。22 號染色體長臂上有 2 條深帶， 近端的一條著色深，緊貼著絲粒。近中部的一條著色淺，有時不顯現(xiàn)。X 染色體長臂可見 4 5 條深帶，近中央有一與短臂相似的深帶，似“竹節(jié)”狀。短臂中部有明顯中央深帶。Y 染色體長臂有 2 條遠端帶，有時整個長臂被染成深帶。帶型識別口訣一禿二蛇三蝶飄四象鞭炮五黑腰六號 1、

24、4 小白臉七上八下九苗條十號 q 肩帶好十一低來十二高十三、十四、十五號（3.2.1）十六 q 縊痕大十七 q 帶腳鐐十八人小大肚泡十九是黑腰二十頭重腳底淺二十一象個葫蘆瓢二十二頭小，身子大X 扁擔，兩頭挑8人類染色體核型分析實驗報告班級 -姓名 -標本編號：分析結果：12345AB 6789101112C 1314151617181920D E F 2122 G性染色體9實驗三人類染色體 G 帶標本制備及觀察一、實驗目的通過實驗掌握G 帶標本制備的基本方法，學會在顯微鏡下直接觀察G 帶分裂相。二、實驗原理有許多顯示G 帶的方法，最常用的是將已經(jīng)過老化的染色體制片放到37胰酶中進行處理， 然后

25、用 Giemsa 染色。通過胰酶處理使G 帶區(qū)的疏水蛋白被除去或使它們構型變?yōu)楦杷疇顟B(tài)，由此可見在G 帶區(qū)中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。Giemsa 染料是由天青和伊紅組成的，染色首先取決于二個天青分子同DNA 結合，在此基礎上結合一個伊紅分子，其次取決于一個有助于染料沉淀物積累的疏水環(huán)境。關于顯帶機理有多種論點，總的來說， 還不能完全解釋顯帶的機理問題。三、實驗準備實驗材料常規(guī)的人類體外周血染色體制片。實驗器材恒溫水浴箱、燒杯、染缸、顯微鏡附油鏡頭、香柏油、擦鏡紙、恒溫培養(yǎng)箱、鑷子、記號筆或鉛筆等。藥品和試劑1 Hanks 液NaCI2.0 gKCI0.1 gNa2HPO4.12H 2O0.

26、0375 gK 2HPO40.015 g葡萄糖0.25 g加雙蒸水250 ml 及 1%酚紅 0.5 ml ，成 Hanks 液。2胰酶液稱取胰酶0.2 g 溶于 100 ml Hanks 液中，攪拌半小時，用1N NaOH 調(diào) pH7.07.2，冷凍保存。（最好現(xiàn)配現(xiàn)用）3磷酸緩沖液( pH6.8 )4 Giemsa 染液5生理鹽水四、實驗步驟1先將胰酶液水浴加熱到37。2將染色體標本浸入胰酶液中，作用時間幾秒到幾十秒不等，依樣本存放時間長短而定。 (標本需預先經(jīng) 60 70烤 2 小時，或 37恒溫老化 57 天。標本太新鮮，染色體有些毛 )3取出玻片標本，在生理鹽水中過一下，再經(jīng)過蒸餾水

27、洗。4 Giemsa 染液染色8 分鐘。5自來水洗、晾干。6鏡檢。選擇分散及顯帶良好的分裂相，在油鏡下觀察。如觀察到染色體變粗并顯得毛糙邊緣，有時甚至呈糊狀，是處理過度了。觀察細胞的標準：（ 1） 細胞完整，輪廓清晰，染色體在同一平面上均勻分布。（ 2） 染色體形態(tài)和分散良好，最好無重疊現(xiàn)象，即使染色體個別重疊，也要能明顯10辨別。（ 3） 所觀察的染色體長短大致一樣，處于同一有絲分裂時期。（ 4） 在所觀察的染色體周圍沒有多個或單個散在的染色體。五、注意事項1帶效果的好壞，主要決定于染色體的標本質(zhì)量。標本染色體要長，染色體分散合適，背景無胞漿，標本未老化即保存時間過長。2要注意胰酶處理的溫度

28、和時間，穩(wěn)定顯帶的條件，才能保證顯帶效果。3磷酸緩沖液的pH 值不要過堿，偏酸為宜，否則著色不鮮明。4 G 帶制備有許多種方法，各個實驗室在細節(jié)處理上均不同，最好總結出適合自己實驗室采用的方法。如果使用效果良好，不要輕易更換新方法。六、作業(yè)畫出顯微鏡下你所觀察的分裂相，要求標明染色體號數(shù)，請實驗指導老師復核。11實驗四Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥（ DMD ）基因檢測一、實驗目的掌握 Duchenne 型肌營養(yǎng)不良癥基因（ DMD ）檢測的簡便方法。二、實驗原理1985 年， Kary Mullis創(chuàng)建了聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction ，PCR）技術，簡稱

29、PCR 技術。 PCR 技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時，對待檢原始材料質(zhì)量要求低等特點。PCR 反應是由變性（denaturation）、模板與引物結合（復性annealing）及延伸（ extension）三個步驟為一個周期的不斷重復過程，經(jīng)過25 30 次循環(huán)之后，理論上可擴增 109 倍。PCR 反應中通常只有一對寡核苷酸引物，而多重PCR（ multiplex PCR ）則是用幾對引物在同一個 PCR 反應體系中進行擴增，這樣可以同時擴增出幾個不同專一靶區(qū)域的片段。Duchenne 型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy ， DMD) 是一原

30、發(fā)于肌肉組織的遺傳病，特點是進行性加重的肌肉萎縮和無力，臨床表現(xiàn)腿的假性肥大，血清酶學明顯升高。本病呈 X 連鎖隱性遺傳，一般男性兒童發(fā)病。DMD 基因定位于Xq21.2-21.3 之間，全長2300kb 左右，由79 個外顯子組成，編碼含3 685 個氨基酸的蛋白質(zhì)抗肌營養(yǎng)不良蛋白( dystrophin) ，這種蛋白具有穩(wěn)定細胞膜和細胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)的功能。DMD 基因有多種突變形式，60%是外顯子缺失突變， 5%是重復突變， 35%可能是很小的 DNA 片段缺失或點突變。通常選擇 DMD 基因中 9 個缺失熱點的外顯子擴增， 可檢出缺失突變中的 90%。為節(jié)省經(jīng)費， 本實驗設計為擴增 DMD

31、基因中 4 個外顯子，其中外顯子 45 和 48 在中國患者中的檢出率分別為 26%和 48% 。DMD 基因 4 個外顯子的引物順序外顯子PCR 產(chǎn)物大小引物 F引物 R8360gtcctttacacactttacctgttgagggcctcattctcatgttctaattag19459ttctaccacatcccattttcttccagatggcaaaagtgttgagaaaaagtc45547aaacatggaacatccttgtggggaccattcctattagatctgtcgccctac48506ttgaatacattggttaaatcccaacatgcctgaataaagtct

32、tccttaccacac三、實驗準備實驗材料正常對照 DNA 樣本、 DMD 患者 DNA 樣本?；蚪MDNA稀釋至100ng/l ，備用。實驗器材微量加樣器、槍頭（10 l ， 100 l ）、 Eppendorf 管、 PCR 儀、臺式高速離心機、電泳儀、水平電泳槽、紫外透射反射儀。藥品和試劑PCR 試劑盒、dNTPs 、Primer R + F混合液 : 包括外顯子8、 19、 45 和 48，終濃度各 25pmol/l 、石蠟油、瓊脂糖、6×載樣緩沖液、溴化乙錠、pUC19/Msp 、 1 ×TBE電泳緩沖液。四、實驗步驟1正常對照DNA 樣本、 DMD 患者 DN

33、A 樣本分別進行PCR 擴增。PCR 操作如下：每一個薄壁離心管中加入：（反應總體積為25l ）雙蒸水17.5l10×Buffer2.5lMgCl 22ldNTPs0.5l12Primer R+F ( 混合 )2lDNA 模板0.5lTaq-DNA聚合酶0.3l石蠟油1 滴放置在 PCR 循環(huán)儀上，循環(huán)參數(shù)設置為：Step 1(1 個循環(huán) )94 C5 分鐘Step 2(30 個循環(huán) )94 C30 秒56 C30 秒72 C30 秒Step 3( 1個循環(huán) )72 C7 分鐘2 PCR 擴增結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳。（ 1）配制 2%的瓊脂糖凝膠配制 1×TBE 電泳緩

34、沖液 70 ml 于三角燒瓶中，稱取1.4 g 的瓊脂糖粉放入后，沸水鍋或微波爐內(nèi)加熱熔化 , 冷卻至 60 C，加入溴化乙錠至終濃度為0.5 g/ml ，混勻凝膠， 倒入電泳槽中，插入梳子，待凝固。（ 2）向電泳槽中倒入 1×TBE ，其量以沒過膠面 2mm 為宜，小心移去梳子。（ 3）取 PCR 擴增樣品 10 l 加入 3 l 的 6×載樣緩沖液，混勻后，加入樣品孔內(nèi)。（ 4）接通電源， 一般紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動( 靠近加樣孔的一端為負極) 。電壓為15 V/cm ( 長度以兩個電極之間的距離計算) 。 140 V ，電泳2 小時左右

35、。根據(jù)指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳。（ 5）卸下凝膠，紫外儀上觀察電泳條帶，并與核酸分子量標準Marker pUC19/Msp 比較，判斷擴增產(chǎn)物的有無及片段大小。五、實驗結果可以觀察到正常對照樣本有4 條帶，從負極往正極分別為外顯子45 、 48、 19 和 8 。DMD 患者缺失不同的外顯子，如有缺失需3 次以上的重復實驗來證實泳道 1、 2、 5、 7 和 8 是正常對照；泳道3、4 和 9 是第 19 外顯子缺失的患者；泳道 6 是外顯子 48 缺失的患者；泳道 10 和 11 是外顯子 45 缺失的患者。 M ：pUC19/Msp 。六、注意事項1引物設計時長度15 30 個堿

36、基為宜， G + C 含量一般為40% 60% 。2退火溫度決定PCR 反應的特異性，退火溫度高，PCR 反應的特異性好；溫度低，有時會有非特異性條帶。3 Mg 2+ 濃度對擴增產(chǎn)物的特異性及產(chǎn)量有顯著影響，Mg 2+ 濃度低，擴增產(chǎn)物的特異性好，但有時產(chǎn)量低；Mg 2+濃度高，擴增產(chǎn)物的特異性差，有非特異性條帶。4 PCR 循環(huán)的次數(shù)主要取決于模板DNA 的濃度。理論上25 30 次循環(huán)后PCR 產(chǎn)物積累即可達到最大值。在滿足產(chǎn)物得率的前提下，應盡量減少循環(huán)次數(shù)。13實驗五遺傳病基因突變分析一、實驗目的通過實驗掌握DNA 的提取、聚合酶鏈反應（PCR ）以及DNA 單鏈構象多態(tài)性分析（ SS

37、CP）等幾種分子生物學實驗方法，并了解SSCP 分析法是檢測基因突變的一種基本方法。二、實驗原理1 DNA 抽提核基因DNA 可以從任何有核細胞中提出，人外周靜脈血的淋巴細胞是抽提核基因DNA 最方便的材料。EDTA 抗凝的外周靜脈血經(jīng)離心處理后，可分離得到大量淋巴細胞的細胞核。由于DNA在細胞核內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復合物的形式存在的，因此提取過程中必須將其中的蛋白質(zhì)除去， 蛋白酶 K 可用于消化細胞核膜及核內(nèi)蛋白質(zhì)， 消化的蛋白質(zhì)用飽和 NaCl 沉淀，核 DNA 最后用酒精析出。2聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction ， PCR ）是一種體外由引物介導的特定

38、DNA序列的酶擴增方法，由于此方法對樣本要求的微量性以及它特異、敏感、高速的特性，近年來得到廣泛應用。全過程是基于一套“三步曲”的若干輪次的循環(huán)組合而成的。依次為DNA模板熱變性，雙鏈DNA解鏈成單鏈；在低溫下與引物退火，引物與單鏈DNA 互補配對；在適宜溫度下Taq DNA聚合酶催化引物延伸。以上三步為一個循環(huán)，循環(huán)2535 次，模板DNA可擴增100 萬倍左右，整個反應在2 3 小時內(nèi)完成（見圖） 。143單鏈構象多態(tài)性分析單鏈構象多態(tài)性（single Strand Conformation Polymorphism， SSCP ）分析法是一種 DNA 單鏈凝膠電泳技術 , 該法具有快速、

39、簡便、靈敏和適用于大樣本篩查的特點，可有效檢出堿基置換、缺失、插入等基因變異。目前，已廣泛用于癌基因、遺傳病基因診斷等領域。 SSCP 原理是在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中，單鏈 DNA 遷移率除與 DNA 長度有關外， 更主要取決于DNA 單鏈所形成的空間構象，相同長度的單鏈 DNA因其順序不同或單個堿基差異，所形成的構象就會不同。PCR 產(chǎn)物經(jīng)變性后進行單鏈DNA 凝膠電泳時，每條單鏈處于一定的位置，靶DNA中若發(fā)生堿基缺失、插入或單個堿基置換時,就會出現(xiàn)泳動變位，從而提示該片段有基因突變存在（見圖）。對于小于 300bp 單鏈 DNA 片段， SSCP 分析的檢測靈敏度可達 90%9

40、9% 。隨著 DNA 長度增加，其檢測靈敏度相對減弱。15三、實驗準備實驗材料人外周靜脈血實驗器材吸管、 Eppendorf管、薄壁離心管、PCR 儀、高速臺式離心機、電泳儀、電泳槽、紫外透射反射儀、注射器（2ml ）、針頭、 10ml 玻璃離心管、10ml 塑料離心管、各種微量加樣器、槍頭（ 10 l 、 100 l 、 1000 l ）、天平、各種試管架、燒杯、石蠟膜、量筒、恒溫水浴箱、記號筆、不銹鋼燒鍋、高壓滅菌鍋、搪瓷盤、玻璃紙、電磁爐等。藥品和試劑1用于DNA 提取藥品和試劑10mg/ml蛋白酶K (-20 冰箱保存)0.5 M EDTA（ pH8.0 ，滅菌保存）TE 緩沖液（pH

41、8.0 ，滅菌保存）緩沖液A （ buffer A ）：蔗糖109.536g2M Tris.HCI5mlTriton-X-10010ml2M MgCI22.5ml雙蒸水加至1000ml ，過濾，4 冰箱保存。2M Tris.HCI（ pH8.0 ）（滅菌保存）2M MgCI 2（滅菌保存）5M NaCl （滅菌保存）10% SDS瓊脂糖（進口分裝）5×TBE16核溶解緩沖液5M NaCl40 ml(nuclei lysis buffer)0.5M EDTA（ pH8.0 ）2 ml2M Tris.HCl（ pH8.0 ）2.5 ml雙蒸水455.5 ml高壓滅菌保存蛋白酶 K 工作液

42、1 份樣本為2 ml 血10 samples20 samples10mg/ml 蛋白酶 K100l200l10% SDS100l200l0.4M EDTA5 l10 ldd H 2 O794l1590ltotal volume1000l2000l1 g/ l EB （溴乙錠）6×加樣緩沖液2用于 PCR 反應10×Buffer 、 MgCl2、 dNTPs 、 Taq-DNA聚合酶由所購試劑公司統(tǒng)一提供。DNA 模板：正常對照來自實驗者的血液樣本，基因突變樣本來自1 例角膜營養(yǎng)不良癥患者。擴增片段為角膜營養(yǎng)不良癥基因BIGH3 第 11 外顯子，擴增產(chǎn)物長度為223bp 。

43、引物序列如下：Primer F ： CTCGTGGGAGTATAACCAGTPrimer R ： TGGGCAGAAGCTCCACCCGG3用于 SSCP雙甲基丙烯酰胺（Bis ）丙烯酰胺（ Acr ）TEMED30% 貯存液：Acr29 gBis1 g溶于 100ml 滅菌雙蒸水中10% APS （過硫酸胺）臨用時配1% HNO 30.2% AgNO 3顯影液10%乙酸10%乙醇Na 2CO 32.96 g雙蒸水加至 100ml，臨用時配，4 冷藏。甲醛臨用時加54l10% 硫代硫酸鈉臨用時加10l蔗糖載樣緩沖液（loading buffer）95%甲酰胺20 mMEDTA溴酚藍，少許二甲苯

44、氰，少許17四、實驗步驟1 DNA抽提（ 1 ）抽取人靜脈血 2ml ， EDTA 抗凝。（ 2 ）加 buffer A 至 5ml 刻度線 , 混勻后，冰箱中冷藏保存10 分鐘。（ 3 ） 7000rpm離心 10 分鐘，棄去上清液。重復上述操作兩次。（ 4 ）加核溶解緩沖液0.3ml ，震蕩20 秒。（ 5 ）加 10% SDS 0.02ml 和蛋白酶K 工作液 0.05ml ，混勻后，37 C 恒溫水浴箱中消化過夜。（ 6 ）消化結束后，加0.1ml 飽和 NaCl ，劇烈震蕩后，4000rpm離心30 分鐘。（ 7 ）將含有 DNA 的上清液吸入另一新玻璃離心管中。加兩倍體積的95% 酒精，緩慢晃動， DNA逐漸被析出來