應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方法檢測正常核型急性白血病患者的易位相關(guān)

1、    應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方法檢測正常核型急性白血病患者的易位相關(guān)融合基因(1)    】 為了探討逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方法在檢測具有正常核型的急性白血?。ˋL）患者的易位相關(guān)融合基因中的價(jià)值，應(yīng)用包括19種染色體易位特異性引物對(duì)的逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方法對(duì)37例經(jīng)常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法揭示為正常核型的AL患者進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明： 有8例（21.6%）AL患者分別檢測出有PML/RARA、AML1/ETO、CBF/MYH11和BCR/ABL等4種融合基因的存在。 結(jié)論：逆轉(zhuǎn)錄多重PCR可在核型正常的AL患者中檢出隱匿的染色

2、體易位，故凡常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)顯示為核型正常的AL患者，均應(yīng)對(duì)其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測。 【關(guān)鍵詞】 急性白血病Detection of Fusion Genes Associated with Specific Translocations in Acute Leukemia Patients with Normal Karyotypes by Using Multiplex RT-PCRAbstract    This study was aimed to explore the usefulness of multiplex reverse tran

3、scription-polymerase chain reaction（multiplex RT-PCR）in detection of fusion genes associated with specific translocations in acute leukemia (AL) patients with normal karyotypes.37 AL patients with normal karyotypes were analyzed by multiplex RT-PCR.The results showed that 4 types of fusion genes suc

4、h as PML/RARA，AML1/ETO，CBF/MYH11，BCR/ABL were detected in 8 (21.6%) patients by multiplex RT-PCR.In conclusion，multiplex RT-PCR is useful in detection of fusion genes associated with specific translocations in acute leukemia (AL) with normal karyotypes and it would refine the karyotype analysis. Whe

5、n the normal karyotypes were detected in acute leukemia patients by conventional cytogenetic method，the multiplex RT-PCR should be performed for them.Key words    Multiplex RT-PCR; Acute leukemia; Normal karyotype研究表明，細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)在急性白血?。ˋL）的診斷分型，判斷預(yù)后和指導(dǎo)治療中占有重地位，但是仍有一些AL患者經(jīng)常規(guī)核型分析未能

6、檢出異常染色體改變，例如正常核型檢出率在B-細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)、T-細(xì)胞ALL(T-ALL)和急性髓細(xì)胞白血病(AML)中分別達(dá)到10%-25%、30%-40% 和40%-47% 1-3。這是由于常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)對(duì)小于1條帶的微小染色體改變不敏感的緣故。近年來，國內(nèi)外已有若干報(bào)道應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多重PCR技術(shù)（multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction） 可以篩選具有隱匿性染色體易位的AL患者。為了評(píng)估所謂正常核型的AL患者中隱匿性染色體易位的頻率和逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測隱匿性染色體易位的價(jià)值，我們應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多重P

7、CR對(duì)一組37例常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)證實(shí)為核型正常的AL患者進(jìn)行了研究。材料和方法病例選擇2004年3月至2004年10月來蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的急性白血病患者共37例，其中男19例，女18例，年齡11-80歲，中位年齡43.6歲。所有病例均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)染色和免疫表型確診，分別為M1 9例，M2 7例，M3 5例，M4 3例，M5 9例，M6 1例，T-ALL 2例，混合性急性白血?。˙淋系，髓系）1例。所有病例在初診時(shí)均做了染色體核型分析，同時(shí)抽取患者骨髓1-5 ml，肝素抗凝后置-80冰箱保存，備做逆轉(zhuǎn)錄多重PCR。常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法采用骨髓短期培養(yǎng)法，按常規(guī)制備染色體。應(yīng)用R

8、顯帶方法進(jìn)行核型分析，核型異常按人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN）19954加以描述。每例至少分析20個(gè)中期細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方法主試劑與儀器 RNA提取試劑TRIZOL reagent 購自美國Gibco/BRL公司。Moloney鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、Taq DNA聚合酶購自美國Amersham Pharmacia Biotech公司。PCR引物由上海生工生物工程方法服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增儀為美國Perkin-Elmer公司產(chǎn)品。RNA提取 TRIZOL Reagent產(chǎn)品說明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品說明，采用6-隨機(jī)引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDN

9、A。多重巢式聚合酶鏈反應(yīng)（multiplex nested PCR） 設(shè)立8組平行PCR反應(yīng)，分別使用1-8組多重PCR引物，引物參照文獻(xiàn)5。采用廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)子結(jié)合因子基因（E2A）mRNA作為陽性內(nèi)對(duì)照。每組檢測的融合基因包括：    組： inv(16)(p13q22)的CBF/MYH11；t(6;11)(q27;q23) 的MLL/AF6；t(11;19)q23;p13.1) 的MLL/ELL    組： t(1;11)(p32;q23) 的MLL/AF1p；t(10;11)(p12;q23) 的

10、MLL/AF10 ； dupMLL(11q23) 的MLL(11q23)    組： t(1;19)(q23;p13) 的E2A/PBX1；t(12;21)(p13;q22) 的TEL/AML1    組： t(3;21)(q26;q22) 的AML1/MDS1；t(8;21)(q22;q22)AML1/ETO；t(16;21)(p11;q22) 的TLS/ERG    組： t(1;11)(q21;q23) 的 MLL/AF1q ；t(4;11)(q21;q23) 的MLL

11、/AF4；t(9;11)(p22;q23) 的MLL/AF9；t(11;19)(q23;p13.3) 的MLL/ENL    組： t(9;22)(q34;q11) 的BCR/ABL    組： t(6;9)(p23;q34) 的DEK/CAN    組： t(11;17)(q23;q21) 的PLZF/RARA；t(15;17)(q21;q22) 的PML/RARA    巢式第1輪PCR： 25 l體系中，含有10×緩沖液

12、2.2 l，25 mmol/L MgCl2 1.32 l，10 mmol/L dNTP 0.4 l。 第1-8組第1輪多重PCR引物 5 pmol/band共2.5 l，cDNA 2.5 l，Taq DNA聚合酶1.25 U。PCR條件為：95 5分鐘，95變性30秒，58退火30秒，72延伸1分鐘。共25個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物置4保存。    巢式第2輪PCR： 25 l體系中，含有10×緩沖液2.4 l，25 mmol/L MgCl2 1.44 l，10 mmol/L dNTP 0.48 l。第1-8組第2輪多重PCR引物6.25 pmol /ban

13、d共2.5 l，第1輪產(chǎn)物 2.5 l，Taq DNA 聚合酶1.25 U。PCR條件為：95 5分鐘，95變性30秒，58退火30秒，72延伸1分鐘。共25個(gè)循環(huán)，然后72延伸10分鐘，產(chǎn)物置4保存。        分離PCR：每組PCR中均包括數(shù)對(duì)引物，因此，可能出現(xiàn)的染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)目亦有數(shù)種，且這些畸變的陽性擴(kuò)增條帶的大小可能很接近。為此，設(shè)立分離PCR以分辨某一條帶究竟代表哪種染色體結(jié)構(gòu)畸變，即對(duì)出現(xiàn)陽性條帶的多重PCR組，按所含引物對(duì)數(shù)設(shè)立2-5個(gè)PCR，使用第2輪多重PCR引物（10 pmol）擴(kuò)增一

14、種畸變的一對(duì)引物，PCR反應(yīng)條件與第2輪PCR相同。            作者：馬力，薛永權(quán)，潘金蘭，何軍，吳亞芳，岑建農(nóng)，溫丙昭【摘】為了探討逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方法在檢測具有正常核型的         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。電泳和掃描

15、 采用1.5 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳后陽性擴(kuò)增條帶用凝膠電泳分析系統(tǒng)分析。結(jié) 果染色體核型分析37例均為正常核型。男性為46，XY，女性為46，XX。逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測經(jīng)2輪巢式PCR反應(yīng)，例1-4、例5、例6-7、例8分別出現(xiàn)R8、R4、R1 和R6陽性條帶（圖A），后經(jīng)分離PCR檢測分別存在R8C，R4A，R1A和R6A陽性條帶（圖B）。因此證實(shí)在37例AL患者中，8例（21.6%）分別被檢出存在PML/RARA，AML1/ETO，CBF/MYH11和BCR/ABL等4種融合基因異常，其中例1-5初診相同均為M3，但染色體核型分析卻是正常核型，未發(fā)現(xiàn)M3最常見的t(15;17)異

16、常。而經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測發(fā)現(xiàn)例1-4具有PML/RARA融合基因，但例5卻具有AML1/ETO融合基因。例6-7診斷為M4EO，染色體核型分析顯示為正常核型，而逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測顯示具有CBF/MYH11融合基因。例8診斷為M2，常規(guī)核型分析也是正常，但逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測顯示具有BCR / ABL (e1a2)融合基因。其余29例經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測結(jié)果均為陰性，未檢測出易位相關(guān)融合基因。37例患者的一般情況及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附表。Table. Karytype analysis and multiplex PT-PCR results of 37 patients with acute

17、leukemia（略）討 論近年來，應(yīng)用RT-PCR方法檢測AL融合基因的報(bào)道日益增多，因其具有較高的靈敏度和特異度，為科研及臨床廣泛應(yīng)用。但是該方法一次只能檢測出一種融合基因，逆轉(zhuǎn)錄多重PCR一次能檢測多種融合基因，由于擴(kuò)大了基因檢測覆蓋面，因而提高了隱匿性染色體易位的檢出率，受到臨床和研究人員的青睞。但是，針對(duì)具有正常核型的AL患者逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測，國內(nèi)目前還未見報(bào)道。    我們應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多重PCR方法對(duì)37例經(jīng)常規(guī)核型分析未檢出染色體異常的AL患者進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)8例（21.6%）存在特異性染色體易位相關(guān)的融合基因異常，其中例1-4具有PML/

18、RARA基因，例6-7具有CBF/MYH11基因，例5經(jīng)形態(tài)學(xué)，組織化學(xué)染色及免疫分型診斷為M3，經(jīng)亞砷酸治療效果差，1個(gè)療程治療后患者未能緩解，后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測發(fā)現(xiàn)存在AML1/ETO基因，從而糾正了最初的診斷。另外1例AL患者診斷為M2，經(jīng)2個(gè)療程化療患者未能緩解，確診4個(gè)月后死亡。該患者雖然核型正常，但經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測，發(fā)現(xiàn)存在BCR/ABL（e1a2）基因，即屬于PhAL，其所以預(yù)后不良也就得到了解釋。    國內(nèi)外大量研究認(rèn)為，存在特異性染色體改變或融合基因如t(8;21)或 AML1/ ETO，t(15;17) 或PML/RARA，inv(16)或 CBF/MYH11的AL患者預(yù)后較好，而具有正常核型的AL患者預(yù)后中等。實(shí)際上具有正常核型的AL患者在遺傳學(xué)上也是不均一的：有的在基因水平上存在著特異性染色體易位，有的存在著基因突變，例如Flt3突變，C-kit突變，AML1突變等6-8。真正不伴有基因改變的正常核型患者只占其中的