腺病毒介導(dǎo)的人GM-CSF基因轉(zhuǎn)染瘤苗增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的實(shí)驗(yàn)研究

1、    腺病毒介導(dǎo)的人GM-CSF基因轉(zhuǎn)染瘤苗增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的實(shí)驗(yàn)研究        摘要：目的研究腺病毒介導(dǎo)的人GM-CSF基因轉(zhuǎn)染瘤苗體內(nèi)抗腫瘤 免疫作用極其機(jī)理。方法應(yīng)用GM-CSF基因轉(zhuǎn)染、輻照的瘤苗對 小鼠肝癌模型進(jìn)行免疫基因治療，觀察該療法對荷瘤小鼠脾細(xì)胞NK、LAK、CTL活性的影響、 脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響以及荷瘤小鼠的生存期。結(jié)果經(jīng)GM-CSF基因 轉(zhuǎn)染瘤苗治療后，脾細(xì)胞CTL活性顯著升高，而NK、LAK細(xì)胞活性未見明顯增強(qiáng)、脾淋巴細(xì)胞 轉(zhuǎn)化反應(yīng)顯著增強(qiáng)

2、、生存期顯著延長。結(jié)論GM-CSF基因轉(zhuǎn)染瘤苗能誘導(dǎo)出有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，揭示了應(yīng)用該療法進(jìn)行腫瘤 基因治療的可行性。關(guān)鍵詞：粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子；腺病毒；疫苗；基因療法中分類號：R730.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-7431(2000)04- 0266-03 AUGMENT OF ANTO-TUMOR IMMUNITY IN VIVO WITH ADENOVIRUS-MEDIATED HUMAN GM-CSF GENE THERAPYLIU Qing-hong(Department of Carcinoma Surger y, Subei Hospital, Medical

3、College of Yangzhou University, Yangzhou 225001,China)QIAN Hai-xin(Department of Carcinoma Surger y, Subei Hospital, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001,China)GAN Jian-he,et al.(Department of Carcinoma Surger y, Subei Hospital, Medical College of Yangzhou University, Yangzhou 225

4、001,China)Abstract：Objective To study the antitumor effect of cancer vaccine transfected with human GM-CSF gene in vivo and its mechanism. Methods The NK, LAK, CTL act ivity and the lymphocyte transformation test (LTT) of splenocytes from tumor-be aring mice after treated with GM-CSF-transfected and

5、 irradiated cancer cells w ere measured. The survival time was also observed. ResultsTreated with GM-CSF-transfected and irradiated cancer cells not only significantly augmented LTT and CTL activity (but not NK or LAK activity) of splenocytes, and also significantly prolonged the survival time of tu

6、mor-bearing mice. ConclusionIrradiated an d GM-CSF-transfected tumor cells induced effective anti-tumor immunity. The e xpression of GM-CSF gene in tumor cells seems to be feasible for cancer gene th erapy.Key words：GM-CSF;Adenovirus;Vaccines;Gene therapy重組腺病毒載體能成功地介導(dǎo)GM-CSF基因轉(zhuǎn)染H22細(xì)胞并能有效表達(dá)、GM-CSF基因 轉(zhuǎn)

7、染瘤苗體內(nèi)致瘤性顯著降低1。本文進(jìn)一步研究該療法體內(nèi)應(yīng)用后對荷瘤小鼠 免疫功能的影響，以期為該療法應(yīng)用于臨床腫瘤治療提供理論依據(jù)。材料與方法1、主要試劑攜帶人GM-CSF基因的重組腺病毒載體(Ad5亞型)以及未攜帶人GM-CSF基因 的假腺病毒顆粒由美國貝勒醫(yī)學(xué)院黃漢賢博士研制并提供。3H-TDR購于上海原子能 研究所?；蛑亟M人IL-2購于上海生物化學(xué)研究所。PHA購于廣州醫(yī)學(xué)工業(yè)研究所。RPMI- 1640購自日本制藥株式會社。胰酶及DNA酶為Difco公司產(chǎn)品。2、動物及細(xì)胞株BALB/c近交系小鼠，雄性，68周齡，1618 g，購自中科院上海實(shí)驗(yàn) 動物中心。小鼠肝癌細(xì)胞株(H22)購自

8、中科院上海藥物研究所。K562、P81 5細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。3、GM-CSF基因轉(zhuǎn)染瘤苗的獲得參照文獻(xiàn)1，命名為H22-GM。同法 獲得未攜帶人GM-CSF基因的假腺病毒顆粒的肝癌細(xì)胞，命名為H22-GM。4、瘤苗的輻照處理見參考文獻(xiàn)1。5、小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備參照文獻(xiàn)2，用RPMI-1640配成2×106/ml， 等用。6、小鼠脾細(xì)胞LAK、CTL活性的誘導(dǎo)取脾淋巴細(xì)胞懸液置于含10 % FCS的培養(yǎng)液中，加入r IL-2至終濃度為1000 /ml，培養(yǎng)3天，檢測LAK活性。將脾淋巴細(xì)胞懸液與輻照滅活的H 22細(xì)胞以201比例置于含10 % FCS的培養(yǎng)液中

9、，置于5 % CO2、37溫箱中溫育6 天后檢測CTL殺傷活性。7、NK、LAK、CTL活性的檢測均采用3H-TDR摻入法。檢測NK選用K562為靶細(xì) 胞，檢測LAK時選用P815為靶細(xì)胞，檢測CTL時選用野生型H22為靶細(xì)胞。用 計數(shù)儀測定cpm值。8、小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)采用3H-TDR摻入法。用計數(shù)儀測定cpm值，結(jié)果以 刺激指數(shù)(SI)表示：9、荷瘤小鼠的制備及治療觀察取體內(nèi)傳代H22肝癌細(xì)胞第57天的BALB/c小鼠，抽 取癌性腹水，用Hanks液洗2遍，配成1×106/ml，給BALB/c小鼠皮下接種0.1 ml，當(dāng)皮下 長 出腫瘤結(jié)節(jié)達(dá)2 mm時隨機(jī)分為4組，每組10

10、只，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，下述治療每周1次，連續(xù)2周 ， 其中5只用于免疫學(xué)指標(biāo)的檢測，于荷瘤后第15天處死小鼠送檢，5只用于觀察生存期。分組 如下：A組：對照組，腹腔內(nèi)注射Hanks液0.1 ml/次，每天3次，連續(xù)3天；B組：H22 瘤苗治療組，腹腔內(nèi)注射1×108/ml用野生型H22細(xì)胞制成的瘤苗0.1 ml。C組：H 22-GM瘤苗治療組，腹腔內(nèi)注射1×108/ml H22-GM瘤苗0.1 ml。 D組：H22-GM瘤苗治療組，腹腔內(nèi)注射1×108/ml H22-GM瘤苗0. 1 ml。10、統(tǒng)計學(xué)分析采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)。結(jié)果1、對荷瘤小鼠脾

11、細(xì)胞NK、LAK、CTL活性的影響H22-GM瘤苗應(yīng)用后對荷瘤小鼠 脾細(xì) 胞NK、LAK活性影響不大，各組間無顯著差異(P0.05)，對于CTL活性的影響比較明顯 。B、C組與對照組間差異不明顯(P0.05)，而D組與對照組間存在顯著差異(P0 .005)。表明H22-GM瘤苗應(yīng)用后使CTL活性顯著升高(見表1)。表1荷瘤小鼠經(jīng)不同治療脾細(xì)胞NK、LAK、CTL殺傷活性分組(n=5)殺傷活性(%)(±s)NKLAKCTLA(Hanks)18.68±2.6816.76±3.0726.09±3.08B(野生型H22)20.64±3.4217.92&

12、#177;3.7128.10±3.00C(H22-GM)16.94±1.4517.62±3.9726.76±2.77D(H22-GM)14.65±2.3315.88±3.5246.54±5.51*注：與Hanks對照組相比*P0.005 2、對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響不同治療對荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響不 同，與Hanks液對照組相比，野生型H22瘤苗和H22-GM瘤苗對荷瘤小鼠脾 淋巴 細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)無明顯增強(qiáng)作用(P0.05)，而H22-GM瘤苗應(yīng)用后則可使脾 淋巴 細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)顯著升高(P0.01)，提示H22

13、-GM瘤苗應(yīng)用后，機(jī)體細(xì)胞免 疫功能有所增強(qiáng)(見表2)。表2不同治療對荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響分組(n=5)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)(%)(±s)A(Hanks)35.87±5.02B(野生型H22)37.20±6.33C(H22-GM)37.43±4.35D(H22-GM)63.46±9.52*注：與Hanks對照組相比*P0.01 3、對荷瘤小鼠存活期的影響本實(shí)驗(yàn)以皮下接種H22肝癌細(xì)胞為荷瘤模型，觀察了各 種不同治療對荷瘤小鼠存活期的影響，結(jié)果：A組(Hanks)：23.0±2.25；B組(野生型H 22)：26.6±

14、2.25；C組(H22-GM)：24.8±2.71；D組(H22-GM )：52.2±6.61，統(tǒng)計學(xué)處理：B、C組與對照組相比無顯著差異(P0.05)，而D組 與對照組差異非常顯著(P0.005)。以上說明：H22-GM瘤苗體內(nèi)應(yīng)用后發(fā) 揮了一定的抗腫瘤效應(yīng)，使荷瘤小鼠存活期明顯延長。討論細(xì)胞因子基因療法是目前腫瘤基因治療研究中的熱門課題。人們設(shè)法將具有免疫調(diào)節(jié)作用和 抗腫瘤作用的細(xì)胞因子基因?qū)胨拗黧w內(nèi)，并使之穩(wěn)定有效地表達(dá)，使其體內(nèi)持續(xù)存在一定 水平的內(nèi)源性細(xì)胞因子，已取了初步療效，它比直接注射細(xì)胞因子治療的毒副作用輕、療效 佳。GM-CSF作為一種具有多種潛能的造血

15、生長因子，目前正被用于惡性腫瘤的臨床和實(shí)驗(yàn)研究 。Dranoff3等實(shí)驗(yàn)證實(shí)：分泌GM-CSF的黑色素瘤細(xì)胞在體內(nèi)激發(fā)的強(qiáng)烈、長期 、特異的抗腫瘤免疫效應(yīng)需CD4、CD8 T細(xì)胞參與。Armstrong4將分 泌GM-CSF的黑素瘤細(xì)胞接種小鼠皮下，局部組織切片示大量的CD4、CD8T細(xì)胞 的浸潤。章衛(wèi)平等5應(yīng)用GM-CSF基因工程瘤苗免疫治療小鼠，免疫功能檢測發(fā)現(xiàn) 脾臟CTL活性顯著升高。作者在以前的研究中證實(shí)：GM-CSF基因轉(zhuǎn)染瘤苗體內(nèi)致瘤性降低 、瘤苗的輻照處理抑制了腫瘤細(xì)胞的增生，但并不影響細(xì)胞因子的表達(dá)1，在此 基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了其對機(jī)體免疫功能的影響。本實(shí)驗(yàn)觀察到：GM-CSF基

16、因轉(zhuǎn)染H22 細(xì)胞在體內(nèi)對于NK、LAK細(xì)胞活性的影響與對照組相比無顯著差異，說明該療法對機(jī)體NK、L AK細(xì)胞活性沒有增強(qiáng)作用，而與對照組相比CTL殺傷活性明顯升高，這可能是GM-CSF基因 轉(zhuǎn)染瘤苗應(yīng)用后發(fā)揮了一定抗腫瘤效應(yīng)，使荷瘤小鼠存活期明顯延長的最主要原因。由于野 生型H22瘤苗和H22-GM瘤苗組CTL殺傷活性未見明顯升高，因此CTL殺傷活 性 升高與GM-CSF基因?qū)爰氨磉_(dá)分泌有關(guān)。而脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)顯著升高則進(jìn)一步表明， 該療法使機(jī)體細(xì)胞免疫功能明顯增強(qiáng)。研究表明，GM-CSF基因轉(zhuǎn)染瘤苗體內(nèi)接種后，局部持續(xù)存在的GM-CSF，一方面通過一 系列機(jī)制使其致瘤性降低、免疫原性

17、增強(qiáng)，為激活免疫功能打下基礎(chǔ)；另一方面，則招引多 種免疫效應(yīng)細(xì)胞(主要是CTL細(xì)胞)大量浸潤，并激活其功能，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行排斥和殺傷。 GM-CSF基因轉(zhuǎn)染瘤苗這一抗腫瘤機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)，也為最終 將其運(yùn)用于臨床治療惡性腫瘤提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。(本文編輯：戴峰)作者簡介：劉慶宏，男，碩士，主治醫(yī)師。作者單位：劉慶宏（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇北醫(yī)院腫瘤外科 揚(yáng)州 225001）錢海鑫（蘇州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院）甘健和（蘇州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院）許期年（蘇州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院）陳易人（蘇州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院）參考文獻(xiàn)1錢海鑫，劉慶宏，甘建和，等. 人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因

18、轉(zhuǎn)染 瘤苗的抗腫瘤研究J. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1998，15(2)：1412Awwar M, North KJ. Cyclophosphamide-induced immunologically mediated of a cyclosphamide-resistent murine tumor: A consequence of eliminating precursor L 3T4 suppressor T-sellsJ. Res, 1989, 49:16493Dranoff G, Jaffee F, Lazenby A, et al. Vaccination with irradiated tumor ce lls engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating fac tor stimulate potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunityJ. Pro c Natl Acad Sci USA, 19