植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與遺傳操作

1、第十章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與遺傳操作第一節(jié)原生質(zhì)體研究概況一、植物原生質(zhì)體的概念原生質(zhì)體(protoplast):指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說(shuō)一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。二、植物原生質(zhì)體研究進(jìn)展1880年，Hanstein首次使用原生質(zhì)體(protoplast) 一詞。I960年，Cocking首次應(yīng)用酶法制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功。1971年，Takebe et al. 首次獲得煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株。1985年，F(xiàn)ujimura et al.世界第一例禾谷類(lèi)作物水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株。1986年，Spangenberg et al.通過(guò)甘藍(lán)型油菜單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目

2、前已有 49個(gè)科，146個(gè)屬的320多種植物經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得再生植株 (1993)，其中主要以農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物為主。第二節(jié)植物原生質(zhì)體分離植物原生質(zhì)體是去除細(xì)胞壁的細(xì)胞或是一個(gè)被質(zhì)膜包被的“裸露細(xì)胞”(見(jiàn)圖7.1 )，分離具有活力的原生質(zhì)體是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。早期(19世紀(jì)末)植物原生質(zhì)體用機(jī)械法進(jìn)行分離，但易破碎，獲得率低，程序繁瑣，且應(yīng)用材料有很大局限性，僅限于液泡化程度較高 的細(xì)胞或長(zhǎng)形細(xì)胞組織，如葉片、果實(shí)的表皮等。1960年，英國(guó)植物生理學(xué)家 Cocking首次用纖維素酶降解番茄幼苗根尖細(xì)胞得到原生質(zhì)體，從而開(kāi)創(chuàng)了用酶解法分離植物原生質(zhì)體的新時(shí)期。目前用酶解法可從許多植物的任何一部分

3、組織獲得具有活力的原生質(zhì)體。圖7.1植物原生質(zhì)體產(chǎn)量高、質(zhì)量好、活性強(qiáng)、能進(jìn)行分裂并形成愈傷組織或胚狀體是原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的 基礎(chǔ)。影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和質(zhì)量的因素很多，主要是基因型、外植體、酶的種類(lèi)與組合、酶 液的滲透壓、原生質(zhì)膜的穩(wěn)定劑、酶解時(shí)間與溫度以及分離與純化方法等。一、基因型與外植體的選擇一般而言，植物的各個(gè)器官如根、莖、葉、果實(shí)、種子、子葉、下胚軸及愈傷組織和懸浮培養(yǎng) 細(xì)胞都可以作為分離原生質(zhì)體的起始材料。但若要通過(guò)原生質(zhì)體培養(yǎng)進(jìn)行植物品種改良，十分 重要的是基因型的選擇與確定，應(yīng)從主栽品種和將要推廣品系中選擇合適的基因型。其次是起 始材料的選擇應(yīng)著重于容易獲得、產(chǎn)量高、質(zhì)量好并易分

4、裂的原生質(zhì)體。紫花苜蓿原生質(zhì)體分 離純化研究表明，在同一種分離純化方法下，不同品種葉片原生質(zhì)體的產(chǎn)量明顯不同。Algonquin的原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯高于品種 N4,說(shuō)明基因型是獲取原生質(zhì)體產(chǎn)量高低的關(guān)鍵因素（見(jiàn)圖7.2 ）。此外，外植體生理年齡對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量也有很大影響。紫花苜蓿品種Oneida的不同苗齡葉片，在同一濃度酶液處理下原生質(zhì)體的產(chǎn)量表現(xiàn)不同，3周苗齡葉片原生質(zhì)體的產(chǎn)量要比4周苗齡葉片高（見(jiàn)圖7.3 ）。meth 3/enz A meth 2/e nz A meth 1/enz A純化方法圖7.2不同純化方法對(duì)紫花苜蓿不同基因型N4和Algonquin原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響（引自 Lev

5、 國(guó)，et al , 2003）苗齡圖7.3紫花苜蓿品種 Oneida不同苗齡葉片對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響二、分離植物原生質(zhì)體的酶構(gòu)成植物細(xì)胞壁的三個(gè)主要成分是：纖維素，占細(xì)胞壁成分的25%- 50% 半纖維素，占細(xì)胞壁成分的 53%左右； 果膠質(zhì)，占細(xì)胞壁成分的 5%左右。因此，分離植物 原生質(zhì)體的酶有三種，即纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。一般認(rèn)為原生質(zhì)體的分離，纖維素酶和果膠酶是必要的。但對(duì)有些植物材料，還要加入半纖維素酶。酶液的濃度（見(jiàn)圖7.3和圖7.4 ）和分離純化方法（見(jiàn)圖 7.4 ）對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量有明顯影響。酶液濃度較高時(shí)，處 理同一品種同一外植體獲得原生質(zhì)體的產(chǎn)量較高。12圖7.4酶

6、液濃度對(duì)紫花苜蓿品種N4葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響(引自 Lev 國(guó)，et al , 2003)3. 滲透壓的穩(wěn)定劑合適的滲透壓是保證原生質(zhì)體完整性的前提。細(xì)胞去壁后獲得的原生質(zhì)體只有質(zhì)膜包 被，所以，它的穩(wěn)定性必須通過(guò)調(diào)節(jié)滲透壓來(lái)維持，否則分離出的原生質(zhì)體容易破碎或萎縮。常用的穩(wěn)定劑有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖等，濃度一般為0.40.6 mol/L ,加入酶液、洗液和培養(yǎng)基中。為提高原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性，常加入CaCb (50100 mmol/L )、KHPQ、MES(2嗎啡啉乙基磺酸)、葡聚糖、硫酸鉀，從而提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。4. 原生質(zhì)體的游離(1)材料的預(yù)處理暗處理、預(yù)培養(yǎng)及低

7、溫處理可提高原生質(zhì)體的分裂率。研究表明，對(duì)于龍膽試管苗的葉片，只有用4 C低溫處理后得到的原生質(zhì)體才能分裂；甘蔗必須先在黑暗條件下培養(yǎng)12 h ,分離的原生質(zhì)體才能分裂；萬(wàn)苣只有在分離前于誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2周，分離的原生質(zhì)體才能分裂。(2 )材料的滅菌處理除試管苗、愈傷組織、培養(yǎng)細(xì)胞不用滅菌外，其他材料均需滅菌。如果以葉片和子葉為 游離原生質(zhì)體的起始材料，則需去上表皮，即葉片晾干后用解剖鑷子撕去上表皮。 應(yīng)將去表 皮的一面朝下放入酶液中，或用解剖刀切成小細(xì)條加入酶液中。(3 )酶解處理植物材料與酶液按一定的比例混合，一般每克材料加1020 mL酶液。葉片需要酶液較少，而懸浮細(xì)胞需要

8、酶液較多。加入酶液后，在25 C條件下，靜止于黑暗中酶解，并間隔輕搖。如果起始材料為懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或愈傷組織，則需在低速搖床上搖動(dòng)酶解。酶解過(guò)程中應(yīng)經(jīng)常觀察、檢查，并及時(shí)調(diào)節(jié)滲透壓，避免原生質(zhì)體破裂或萎縮。5. 原生質(zhì)體的收集和純化7.5 ),分離純化后獲得原生質(zhì)原生質(zhì)體純化最常用的方法是過(guò)濾和離心相結(jié)合(見(jiàn)圖 體。圖7.6為紫花苜蓿葉片分離純化的原生質(zhì)體。圖7.5原生質(zhì)體收集純化流程圖（引自 Lev 國(guó),et al , 2003）6. 原生質(zhì)體活力鑒定一般采用FDA染色法（熒光素雙醋酸酯） 鑒定原生質(zhì)體有無(wú)活力。取純化后的植物原生質(zhì)體懸浮液0.5 mL置于小試管中，加入含 2 mg/L FDA

9、的丙酮溶液，使最終濃度變?yōu)?.01%，混勻，放置5分鐘。用熒光顯微鏡觀察（激發(fā)光濾光片QB-24、壓制濾光片JB-8 ），有活力原生質(zhì)體發(fā)綠色熒光，不產(chǎn)生熒光為無(wú)活力。對(duì)于葉肉、子葉、下胚軸而言，由于葉綠素的 關(guān)系，原生質(zhì)體發(fā)黃綠色熒光的為有活力的，發(fā)紅色熒光的為無(wú)活力的。此外，還可用細(xì)胞壁染色法來(lái)鑒定活力（許智宏，衛(wèi)志明，1997）。第三節(jié)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)一、原生質(zhì)體培養(yǎng)基的選擇原生質(zhì)體培養(yǎng)基與細(xì)胞培養(yǎng)基相似，在細(xì)胞培養(yǎng)基上進(jìn)行改良。禾谷類(lèi)植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)基多以 MS N6等為基本培養(yǎng)基；十字花科和豆科則多為R、KM K8p、KM8p茄科的基本培養(yǎng)基為 MS NT K3 （許智宏，衛(wèi)志明，

10、1997）。2. 滲透壓穩(wěn)定劑培養(yǎng)基中常加一定濃度的滲透壓穩(wěn)定劑來(lái)保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。常用的穩(wěn)定劑為甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖。研究表明，葡萄糖是原生質(zhì)體培養(yǎng)最理想的滲透壓穩(wěn) 定劑和碳源，有利于原生質(zhì)體的生長(zhǎng)、細(xì)胞壁的再生、再生細(xì)胞的分裂和細(xì)胞團(tuán)的增殖，并 維持細(xì)胞的持續(xù)分裂直至形成細(xì)胞團(tuán)，使用濃度為0.40.5 mol/L。但隨著細(xì)胞壁的再生和細(xì)胞的持續(xù)分裂，滲透劑的濃度需不斷降低才有利于培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。一般通過(guò)添加新鮮培養(yǎng)基的方法，每12周使?jié)B透劑的濃度降低0.050.1 mol/L 。3. 無(wú)機(jī)鹽用于原生質(zhì)體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，大量鹽濃度應(yīng)比細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基低。大量元素中鈣離子和N

11、H4,對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)影響最大，較高的鈣離子可提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。因此，在很多植物培養(yǎng)中用1/2 MS培氮源是植物生長(zhǎng)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)，但研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的NH4對(duì)原生質(zhì)體生長(zhǎng)發(fā)育不利。Upadhya （1975）首先報(bào)道，NH 4抑制馬鈴薯原生質(zhì)體的生長(zhǎng)。Von Arnold和Erikson（1977）證明，當(dāng)NH 4的濃度高于2 000 mg/L時(shí)，可使豌豆的原生質(zhì)體致死；Oka和Ohyana（1985）在構(gòu)樹(shù)原生質(zhì)體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，高濃度的NH4使原生質(zhì)體壞死，只有把MS培養(yǎng)基中的NH。和N°3-濃度降到200 mg/L時(shí)，原生質(zhì)體才能正常發(fā)育。因此，很多原生質(zhì)體培養(yǎng) 中常采用有機(jī)氮

12、氮源取代銨鹽。但在小麥原生質(zhì)體培養(yǎng)中，起始培養(yǎng)基中的NH4較低，在添加新鮮培養(yǎng)基時(shí)適當(dāng)增加NH4 N,可促進(jìn)細(xì)胞分裂和提高植板率。所以，培養(yǎng)基中氮源種類(lèi)和濃度應(yīng)依植物種類(lèi)和材料經(jīng)試驗(yàn)后確定。4. 有機(jī)物在原生質(zhì)體的培養(yǎng)基中添加一定量的ABA多胺類(lèi)、對(duì)甲氧基苯甲酸、小牛血清、活性炭、酵母提取物和椰乳等，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞分裂和胚狀體形成都有良好作用5.8。5激素植物激素是原生質(zhì)體培養(yǎng)的重要因素。激素種類(lèi)和濃度因培養(yǎng)物種而異。但總的而言， 生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是必需的，而且在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段（起始階段，細(xì)胞團(tuán)形成、愈傷組織形成以及器官發(fā)生、胚狀體發(fā)生及發(fā)育成苗階段），需不斷適時(shí)調(diào)整激素的種類(lèi)和濃度。培養(yǎng)基中

13、加2, 4-D可促進(jìn)細(xì)胞啟動(dòng)分裂、持續(xù)分裂和愈傷組織形成，有時(shí)需將2, 4-D與NAA或BA或ZT配合使用，才有利于原生質(zhì)體的發(fā)育（見(jiàn)圖 7.7 ）。隨著培養(yǎng)進(jìn)程，愈傷 組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)逐漸降低2, 4-D或去除2, 4-D，降低NAA或用IAA取代，并適量增加BA或 ZT濃度以促進(jìn)芽的分化。4.5周."0.38M glucose+Kao0.45M glucose+HbMix+Hb40.38M glucose+Hb5種不同碳源和0.4 M , 0.45 MMS基本培養(yǎng)基處理，碳源為葡萄糖（0.4M、蔗糖0.09M和甘露醇0.1M 混2種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的 和0.6 M )或葡萄糖

14、調(diào)節(jié)物質(zhì)為 Hb: 2 mg/L NAA 0.5 mg/L 2, 4-D, 0.5 mg/L zeatin ; Kao： 0.2 mg/L 2, 4-D, 0.5 mg/L BA( Kao, et al , 1975)。原生質(zhì)體最佳發(fā)育的組合為 glucose + Hb和0.38M glucose + Kao, 4周后20%以上原生質(zhì)體發(fā)育成細(xì)胞團(tuán)。.45M glucose+Kao1 mg/L NAA 0.45MMix+Kao圖7.7碳源和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)紫花苜蓿原生質(zhì)體發(fā)育的影響（引自 Lev 國(guó),et al , 2003）二、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法1. 固體培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法是指純化后懸浮在液體培養(yǎng)基

15、中的原生質(zhì)體懸液與熱融并冷卻至45 C的含瓊脂糖的培養(yǎng)基等量混合，并迅速輕搖，混勻，冷卻后原生質(zhì)體被埋在固體培養(yǎng)基中。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是便于定位觀察、追蹤單個(gè)原生質(zhì)體再生細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程，避免細(xì)胞間有害代謝產(chǎn)物的影響。瓊脂糖是一個(gè)良好的培養(yǎng)基凝膠劑，可促進(jìn)原生質(zhì)體再生細(xì)胞的分裂。2. 液體培養(yǎng)法常用液體淺層培養(yǎng)法和懸滴培養(yǎng)法。液體淺層培養(yǎng)法是將原生質(zhì)體懸浮液23 mL于三角瓶或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，初期每天輕輕搖動(dòng)23次，以防止原生質(zhì)體沉積皿底。 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，對(duì)原生質(zhì)體傷害?。蝗秉c(diǎn)是不易定位觀察原生質(zhì)體，而且分布不均勻，易造成局部原生質(zhì)體密度過(guò)高或粘聚，影響再生細(xì)胞的分裂和進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育。懸

16、滴培養(yǎng)法指用刻度滴管取原生質(zhì)體培養(yǎng)液以50100的小滴分開(kāi)接種在無(wú)菌干燥的培養(yǎng)皿皿蓋“反面”上，且以滴間不相碰為準(zhǔn)，底皿加保濕液，將皿蓋蓋于底皿上，封口培養(yǎng)。 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是材料少，生長(zhǎng)快，不易污染，易加入培養(yǎng)基，有利于低密度培養(yǎng)；缺點(diǎn)與液 體淺層培養(yǎng)法相同（許智宏，衛(wèi)志明， 1997）。3. 固液結(jié)合培養(yǎng)法固液結(jié)合培養(yǎng)法即雙層培養(yǎng)法， 指在底皿先鋪一層固體培養(yǎng)基， 其上進(jìn)行原生質(zhì)體的液 體淺層培養(yǎng)。4. 念珠培養(yǎng)法念珠培養(yǎng)法是指將含有原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基切成塊，放在體積大的液體培養(yǎng)基中， 并在旋轉(zhuǎn)搖床上進(jìn)行振蕩的培養(yǎng)方法（ Shillit ，et al ，1983）。三、原生質(zhì)體再生植株

17、1. 通過(guò)器官形成途徑再生植株原生質(zhì)體培養(yǎng)植株再生多數(shù)是通過(guò)器官形成途徑再生植株。 特別是在雙子葉植物中， 茄 科、菊科和十字花科的大多數(shù)以及豆科的相當(dāng)一部分種的原生質(zhì)體培養(yǎng)， 都通過(guò)器官形成途 徑再生植株。 由原生質(zhì)體培養(yǎng)到器官分化直至形成完整植株， 每一培養(yǎng)階段所需培養(yǎng)基不同， 一般需要三種培養(yǎng)基，即原生質(zhì)體培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，而且培養(yǎng)基不同，激素成分和滲透壓也隨之改變。（1）原生質(zhì)體培養(yǎng)基 原生質(zhì)體培養(yǎng)基用來(lái)促進(jìn)原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁和單細(xì)胞分裂，形成細(xì)胞團(tuán)或小愈傷組 織。培養(yǎng)基內(nèi)通常含有植物激素、糖類(lèi)物質(zhì)、 無(wú)機(jī)鹽和維生素，還應(yīng)含有維持原生質(zhì)體穩(wěn)定 性的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)，如甘露醇

18、、山梨醇或葡萄糖等。（2）分化培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基主要用來(lái)誘導(dǎo)芽的形成， 不再含有滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)， 而且應(yīng)降低生長(zhǎng)素濃度， 同時(shí)加入較高濃度細(xì)胞分裂素。 如果原生質(zhì)體開(kāi)始階段在液體或軟瓊脂或瓊脂糖培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，則此時(shí)應(yīng)轉(zhuǎn)到用瓊脂、瓊脂糖或 Gelrite 固化的培養(yǎng)基上（許智宏，衛(wèi)志明，1997）。（ 3 ）生根培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基用以誘導(dǎo)再生苗生根，再生完整植株。對(duì)多數(shù)植物而言，培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)素（IAA、NAA或 IBA）濃度通常較低，不含細(xì)胞分裂素。對(duì)某些植物而言，根的誘導(dǎo)無(wú)需添加 任何植物激素。2. 通過(guò)胚胎發(fā)生途徑再生植株植物原生質(zhì)體培養(yǎng)通過(guò)胚胎發(fā)生途徑再生植株的植物種類(lèi)，主要集中在禾本科、傘形 花科、蕓香科、葫蘆科和豆科中的一部分（尤其是豆科牧草，如紫花苜蓿，見(jiàn)圖7.8 ）等。而茄科植物中絕大多數(shù)種原生質(zhì)體培養(yǎng)通過(guò)器官途徑再生植株，僅有少數(shù)種通過(guò)體細(xì)胞胚胎途徑再生植株。植物由原生質(zhì)體培養(yǎng)到誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生直至植株再