生化試驗基本技術(shù)

1、第二章生化實驗根本技術(shù)第一節(jié)離心別離技術(shù)離心是蛋白質(zhì)、酶、核酸及細胞亞組分別離的最常用的方法之一，也是生化實驗室中常用的別離、純化的方法。尤其是超速冷凍離心已經(jīng)成為研究生物大分 子實驗室中的常用技術(shù)方法。離心機(cen trifuge) 是實施離心技術(shù)的裝置。離心 機的種類很多，按照使用目的，可分為兩類，即制備型離心機和分析型離心機。 前者主要用于別離生物材料，每次別離樣品的容量比擬大，后者那么主要用于研究 純品大分子物質(zhì)，包括某些顆粒體如核蛋白體等物質(zhì)的性質(zhì)，每次分析的樣品容 量很小，根據(jù)待測物質(zhì)在離心場中的行為(可用離心機中的光學系統(tǒng)連續(xù)地監(jiān) 測)，能推斷其純度、形狀和相對分子質(zhì)量等性質(zhì)。

2、這兩類離心機由于用途不同， 故其主要結(jié)構(gòu)也有差異。一、離心原理離心技術(shù)的主要原理就是將樣品放入離心機轉(zhuǎn)頭的離心管內(nèi)，離心機驅(qū)動時，樣品液就隨離心管做勻速圓周運動，于是就產(chǎn)生了一個向外的離心力。由于不同顆粒的質(zhì)量、密度、大小及形狀等彼此各不相同，在同一固定大小的離心場 中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互間的別離。(一)離心力和相對離心力離心力的單位為g,即重力加速度(980.6cm/S2)，離心力的大小可根據(jù)離心 時的旋轉(zhuǎn)速度 V(r/min 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，revolution per minute) 和物體離旋轉(zhuǎn)軸 中心的距離r(cm)按下式計算：g=r x V2X 1.118 x 10或

3、按下式計算所需的轉(zhuǎn)速：V g 89445/ r。離心技術(shù)是根據(jù)微小顆粒物質(zhì)在離心場中的行為建立并開展起來的。離心機的轉(zhuǎn)頭能夠以穩(wěn)定的角速度做圓周運動， 從而產(chǎn)生一個強大的輻射向外的離心力 場，它賦予處于其中的任何物體一個離心加速度，使之受到一個外向的離心力， 其定義為：F = m 3 2r式中：F為離心力的強度；m為沉降顆粒的有效質(zhì)量；3為離心轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動的 角速度，其單位為rad/s ; r為離心半徑(cm)，即轉(zhuǎn)子中心軸到沉降顆粒之間的距離。很顯然，離心力隨著轉(zhuǎn)速和顆粒質(zhì)量的提高而加大，而隨著離心半徑的減小而降低。通常離心力常用地球引力的倍數(shù)來表示，因而稱為相對離心力“ RCF?；?者用數(shù)字乘

4、“ g來表示，例如25000X g,那么表示相對離心力為25000。相對離 心力是指在離心場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數(shù)，單位是重力 加速度“ g980cm/S2，此時“ RCF相對離心力可用下式計算：RCF = 1.119 X 10-5X rpm2 Xrrpm revoluti ons per mi nute 每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min 由上式可見，只要給出旋轉(zhuǎn)半徑r，那么RCF和rpm之間可以相互換算。但是 由于轉(zhuǎn)頭的形狀及結(jié)構(gòu)的差異，使每臺離心機的離心管，從管口至管底的各點與 旋轉(zhuǎn)軸之間的距離是不一樣的，所以在計算是規(guī)定旋轉(zhuǎn)半徑均用平均半徑“rav 代替：rav= r min

5、+ rmax/2一般情況下，低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm來表示，高速離心時那么以“ g表 示。計算顆粒的相對離心力時，應注意離心管與旋轉(zhuǎn)軸中心的距離“r 不同，即沉降顆粒在離心管中所處位置不同，那么所受離心力也不同。因此在報告超離心 條件時，通常總是用地心引力的倍數(shù)“X g代替每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)“ rpm，因為它可 以真實地反映顆粒在離心管內(nèi)不同位置的離心力及其動態(tài)變化?？萍嘉墨I中離心力的數(shù)據(jù)通常是指其平均值RCFa v，即離心管中點的離心力。為便于進行轉(zhuǎn)速和相對離心力之間的換算，Dole和Cotzias利用RCF的計算公式，制作了轉(zhuǎn)速“rpm、相對離心力“ RCF和旋轉(zhuǎn)半徑“ r 三者關(guān)系的列 線圖，

6、圖式法比公式計算法方便。換算時，先在r標尺上取的半徑和在rpm標尺上取的離心機轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點間劃一條直線，與圖中RCF標尺上的 交叉點即為相應的相對離心力數(shù)值。注意，假設的轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標尺的右邊， 那么應讀取RCF標尺右邊的數(shù)值，轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標尺左邊，那么應讀取RCF標尺左 邊的數(shù)值。Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對應的離心力的轉(zhuǎn)換列 線圖，在用圖將離心機轉(zhuǎn)數(shù)換成相對離心力時，先在離心機半徑標尺上取的 離心機半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標尺上取的 離心機轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點間劃一條直線，2 cm-w oo2 m)sooiuifl-4 (DO4在圖中間RCF標尺上的交叉點，即為相應的

7、離心力數(shù)值。例 離心機轉(zhuǎn)數(shù)為 2500rpm,離心機的半徑為7.7cm,將兩點連接起來交于 RCF標尺，此交點500Xg 即是RCF值。將左側(cè)r點與右側(cè)n點連 成一條直線，與中間RCF相交 的點即為相對離心力x gRCF=1.118< 102x r x n2-IS二沉降速度與沉降系數(shù) 一個顆粒要沉降，它必須 置換出位于它下方等體積的溶 液，這只有當顆粒的質(zhì)量大于 被置換出的液體的質(zhì)量時才能 通過離心的手段到達，否那么， 在離心過程中顆粒將 發(fā)生向上 漂浮，而不是下沉。當顆粒在 運動時，不管方向如何，它都 要穿過溶劑分子，所產(chǎn)生的摩 擦力總是與顆粒運動的方向 相 反。摩擦力的大小與顆粒的運

8、動速度成正比，并且受顆粒的大小、形狀及介質(zhì)性質(zhì)的影響，顆粒沉降速度與三方面的因素有關(guān)：1. 顆粒本身的性質(zhì)沉降速度與顆粒直徑和密度成正比。密度相同時大顆粒比小顆粒沉降快； 大小相同時，密度大的顆粒比密度小的沉降快。2. 介質(zhì)的性質(zhì)沉降速度與介質(zhì)的粘度、密度成反比，介質(zhì)粘度、密度大，那么 顆粒沉降慢。3. 離心條件顆粒沉降速度與離心時轉(zhuǎn)速和旋轉(zhuǎn)半徑成正比。如果其他的條件蕭心力的轉(zhuǎn)換列線圖不變，沉降速度隨著r的增大而增大，在進行速度區(qū)帶離心時，r對沉降速度的 這種影響不利于到達滿意的別離效果，所以需要在沿半徑方向上相應地增加介質(zhì) 的密度和粘度以克服r的增加造成的影響。沉降系數(shù)sedimentati

9、on coefficient:為沉降速度與離心力的比率或單位離心場中顆粒的沉降速度，它以 svedberg單位計算，1S= 1X 10-13 S。例如： 核糖核酸酶A的沉降系數(shù)為1. 85X10-13 S。即可記作1. 85S。當我們對某些 生物高分子和亞細胞器組分的化學結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量還不了解時，可以用沉降 系數(shù)對它們的物理特性進行初步描述，將它們區(qū)分開來。例如大腸桿菌核蛋白體是70S,它由兩個亞基組成，用超離心的方法測得其沉降系數(shù)分別為 30S和50S, 當我們還不清楚它們的結(jié)構(gòu)時就暫以 30S和50S命名以示區(qū)別。沉降系數(shù)S的值 與顆粒的大小、形狀和密度，以及離心所使用的介質(zhì)的密度和粘

10、度有關(guān)，而與轉(zhuǎn)頭的速度和類型無關(guān)。二、離心機分類常見的離心機有超速離心機分析和制備用、高速冷凍離心機、大容量冷凍 離心機、連續(xù)離心機、一般用途低速離心機無冷凍以及臺式超速、高速、低 速、特殊用途離心機。在實際應用中，不同的離心機有不同的應用范圍。1低速離心機低速離心機的最大額定轉(zhuǎn)速一般為 4000r/min，且連續(xù)可調(diào)。根據(jù)處理樣品 的容量大小，低速離心機可分為臺式低速離心機、水平型桶式低速離心機和大容 量立式低速離心機。臺式低速離心機體積小，重量輕，能自動控制工作時間。操 作簡單。使用方便。適用于醫(yī)院化驗室、生物化學與分子生物學實驗室進行定性 分析；血漿、血清、尿素、疫苗制造等。大容量低速離

11、心機往往用于樣品的初級 別離制備，還可直接用于瓶裝、袋裝樣品的離心，為實驗室大量樣品的別離提供 了條件。2.高速離心機高速離心機的最大額定轉(zhuǎn)速為20000r/min左右，最大相對離心力可到達 45000g,由于運轉(zhuǎn)速度高，一般配備冷凍控溫裝置。高速離心機適用于各種生物 細胞、病毒、血清蛋白等有機物、無機物溶液，懸浮液及膠體溶液等樣品的別離、 濃縮、提取等制備工作，是細胞和分子水平研究的根本工具。高速離心機的速度 控制系統(tǒng)和溫度控制系統(tǒng)都優(yōu)于低速離心機。如某些全自動高速冷凍離心機的速度控制系統(tǒng)采用IC電路，結(jié)構(gòu)簡單，性能穩(wěn)定，且在IC速度自動控制電路內(nèi)， 專門設有超速保護電路，平安可靠，而溫度控

12、制系統(tǒng)那么用SCF元件，通過兩個熱 敏元件，檢測離心室溫度及環(huán)境溫度，對離心室溫度進行自動控制。由于高速離心機轉(zhuǎn)速較高，離心力較大， ，對離心轉(zhuǎn)頭的強度要求也較高， 多采用超硬鋁、 鍛鋁或不銹鋼加工制成， 且要經(jīng)過滿載超速爆炸試驗， 平安系數(shù) 很高。高速離心機的離心管通常以塑料及聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯等制成。實 際工作中可按照不同的要求選擇使用各種離心管。小容量臺式高速離心機，機型輕小，操作方便，樣品量小，離心力大，自動 平衡，速度可調(diào)，性能穩(wěn)定，平安可靠。可放在一般實驗臺、冷庫、低溫水箱中 使用，適用于實驗室小量樣品液沉淀濃縮， 是分子生物學實驗中使用的根本設備。3. 超速離心機 超速離心

13、機可分為分析用超速離心機和制備用超速離心機兩種。 制備用超速 離心機最高額定轉(zhuǎn)速在 55000-83000r/min之間，最大相對離心力在 6X 105g左 右。超速離心機是醫(yī)學、檢驗學、生物學、生物化學與分子生物學、化學、農(nóng)業(yè) 科學等研究領(lǐng)域的重要儀器之一。 利用超速離心轉(zhuǎn)頭高速旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的巨大離心 力可對細胞器、 病毒、生物大分子進行別離、 濃縮、精制，并可用于測定蛋白質(zhì)、 核酸的相對分子質(zhì)量等。 超速離心機的運轉(zhuǎn)速度高， 產(chǎn)生的離心力場極強， 對離 心機的材料及各項質(zhì)量要求極高。與制備用超速離心機相比，分析用超速離心機一般都裝備有特殊設計的轉(zhuǎn) 頭、控制系統(tǒng)和光學系統(tǒng)， 可以直接觀察了解和分析樣品的沉降情況， 能精確控 制離心力，并且可用照相方法或者電子技術(shù)記錄沉降粒子在離心過程中的行為。 對這些記錄進行分析，可以測定粒子的物理性質(zhì)，如沉降系數(shù)、分子量、擴散系 數(shù)、沉降物質(zhì)的不均一性等。三、離心機的使用方法欲使沉淀與母液分開， 過濾和離心都可到達目的， 但當沉淀粘稠， 或顆粒太 小能通過濾紙，總?cè)萘刻儆中瓒繙y定時，使用離心沉淀法比過濾要好。使用離心機前， 應先檢查離心機轉(zhuǎn)動狀態(tài)是否平穩(wěn)， 以確定離心機性能， 檢 查套管與離心管大小是否相配， 套管是否輔好軟墊