技術及應用不斷突破mRNA疫苗前景廣闊

1、總論：RNA 治療行業(yè)春風已至，將迎藥物革命新浪潮n 前言：新冠疫情在全球范圍內暴發(fā)，mRNA 疫苗在新冠疫苗的研發(fā)競賽中一枝獨秀，為防控疫情提供了有力的支持。mRNA 疫苗也逐漸走入大眾的視野，學術、產業(yè)與資本等多方對 RNA 治療領域表現(xiàn)出了極大的興趣和熱情。借此契機，國金證券醫(yī)藥團隊在對 RNA 治療行業(yè)的梳理與研究基礎上，撰寫了本篇 RNA 治療行業(yè)的深度報告，報告共分為上、下兩篇， 上篇重點介紹 mRNA 疫苗行業(yè)，下篇重點介紹小核酸藥物行業(yè)，旨在幫助各位投資者加深對 RNA 治療行業(yè)的理解。n RNA 療法主要分三類，可調控致病基因的表達。RNA 療法是指利用具有治療疾病功能的核酸

2、從根源上調控致病基因表達的療法。RNA 療法按作用機制分為三類：1）編碼治療性蛋白或抗原的 mRNA 療法；2）以核酸為靶向，抑制致病性 RNA 活性或激活基因活性的小核酸療法，包括反義寡核苷酸（ASO ）、小干擾 RNA（siRNA ）、微小 RNA（ miRNA）、小激活 RNA（saRNA）等療法；3）以蛋白質為靶向，調控蛋白質活性的核酸適配體（Aptamer）療法。圖表 1：RNA 療法分類n RNA 療法具備多重優(yōu)勢。1958 年，克里克提出中心法則：遺傳信息從DNA 傳遞到 RNA，再傳遞到蛋白質，即轉錄和翻譯。傳統(tǒng)小分子藥物與抗體藥作用靶點是蛋白質，通過調控已生成蛋白質的功能來發(fā)

3、揮疾病治療的作用；小核酸藥物的作用靶點是 RNA，可以調節(jié)蛋白質的生成；mRNA疫苗則可以在進入人體后直接表達目標蛋白。與基因療法相比，RNA 療法安全性更高，因為沒有進入細胞核插入基因組的風險；與以蛋白質為靶點的傳統(tǒng)藥物相比，RNA 療法具有設計簡便、研發(fā)周期短、候選靶點豐富等多種優(yōu)勢，因此成為科學研究和產業(yè)界關注的新型療法。n RNAi 機制曾獲諾獎。1978 年 ASO 的概念被首次提出；1998 年首款 ASO 藥物福米韋生（Fomivirsen）于美國獲批上市；20 世紀 90 年代至 21 世紀初，研究人員又相繼提出了 RNA 適配體、mRNA、siRNA 和 saRNA 等療法；

4、2006 年 RNA 干擾（RNAi）機制研究獲得了諾貝爾生理學或醫(yī)學獎；2018 年首款 siRNA 藥物成功獲得 FDA 批準；2020 年以 ASO 藥物Milasen 為代表的超個體化藥物技術，入選 MIT Technology Review 十大突破技術。n 關鍵技術取得突破，多款藥物獲批上市。由于體內穩(wěn)定性、靶向性、免疫原性等問題，RNA 療法早期應用受到限制。近年來，化學修飾及遞送系統(tǒng)取得一定突破，RNA 療法取得積極進展，已可應用于罕見病、腫瘤、感染性疾病、神經系統(tǒng)疾病、心血管疾病、代謝疾病、眼病等疾病的治療。自新冠暴發(fā)以來，目前已有多款新冠 mRNA 疫苗憑借著出色的保護率成

5、功獲批上市。此外，已有多款 RNA 療法產品獲批，RNA 療法將逐漸進入成果收獲期。- 4 -圖表 2：FDA 已獲批的 RNA 藥物FDA， 醫(yī)藥魔方，國金證券研究所圖表 3：小核酸藥物發(fā)展歷程來源：蘇州瑞博招股書，國金證券研究所- 5 -上篇：新冠疫情肆虐全球，mRNA 疫苗一枝獨秀n 前言：新冠肆虐，疫情防控對疫苗提出新要求。2019 年底，武漢報告首例不明原因肺炎，隨后這場突如其來的新冠疫情席卷全球。新冠肺炎病毒的快速傳播對疫情防控提出了極大的挑戰(zhàn)，我們需要在短時間內研制出相應疫苗，并且快速完成疫苗的大規(guī)模生產和接種。傳統(tǒng)疫苗研發(fā)周期長、成本高、生產難度大。例如，滅活苗和減毒苗從臨床階

6、段開始的平均研發(fā)周期長達 10 年，花費高達 5 億-7 億美元；且傳統(tǒng)疫苗多為生物制品，涉及病原體的培養(yǎng)與繁殖，生產的難度與對安全性的要求較高。在這次新冠疫苗的研發(fā)競賽中，mRNA 疫苗一枝獨秀，為防控疫情提供了有力的支持。mRNA 疫苗研發(fā)周期短、生產相對簡單。在掌握病毒基因序列后即可快速研發(fā)對應的 mRNA 疫苗，生產涉及化學合成核酸難度相對小，3 個月內即可完成 GMP 生產及 QC。n 綜上，本文在對 mRNA 疫苗的原理、優(yōu)勢分析的基礎上，進一步闡述mRNA 疫苗的關鍵技術與專利布局，最后介紹行業(yè)相關重點公司，希望可以幫助諸位讀者進一步了解 mRNA 疫苗行業(yè)。mRNA 疫苗技術介

7、紹技術原理：mRNA 是連接基因與蛋白質的橋梁n 蛋白質是生命活動的承擔者，mRNA 是連接基因與蛋白質的橋梁。1958 年，克里克提出中心法則：遺傳信息從 DNA 傳遞到 RNA，再傳遞到蛋白質，即轉錄和翻譯。mRNA（信使 RNA）是一類單鏈核糖核酸，它由DNA 的一條鏈作為模板轉錄而來的、攜帶遺傳信息并且能指導蛋白質的合成。與長度小于 60nt 的小核酸藥物相比，mRNA 的長度更長，一般約為500 至 5000nt。mRNA 作為疫苗或者藥物，可在人體內表達目標蛋白。因為 mRNA 在細胞內翻譯且不進入細胞核，所以無整合進人體 DNA 的風險。同時，它也可作用于傳統(tǒng)小分子藥物以及抗體藥

8、物等無法觸及的胞內靶點， 因此具有更廣闊的應用空間。n mRNA 疫苗主要分為兩類，均具有預防和治療疾病的作用。1） 病毒衍生的自我擴增型 mRNA 疫苗（SAM）：不僅可以編碼目標抗原，還可以編碼病毒的復制機制。因此自我擴增 mRNA 疫苗編碼的遺傳信息會被放大很多倍，從而使得相對低劑量的疫苗就可以產生較高水平的抗原表達；但缺點是 mRNA 體積較大，生產過程復雜，而且編碼蛋白可能會誘導非預期的免疫反應，如復制機制產生的復制酶，理論上會限制其技術平臺在同一人體中的重復使用。2） 非復制型 mRNA 疫苗（NRM）：優(yōu)勢在于結構簡單，mRNA 體積小，對插入開放閱讀框（ORF）中目標抗原轉錄本

9、的大小限制更少。目前，非復制 mRNA 疫苗的研發(fā)進展較快，已有多個品種處于臨床試驗中；而自擴增 mRNA 疫苗尚未在臨床研究中進行驗證。- 6 -圖表 4：兩類 mRNA 疫苗的結構構成CNKI，國金證券研究所n mRNA 疫苗發(fā)揮作用需要經過以下幾個步驟：1）mRNA 被各種遞送載體包裹；2）注射進入人體；3）包裹 mRNA 的脂質體胞吞進入細胞；4） mRNA 在細胞內釋放，利用人體的細胞器翻譯表達抗原蛋白，刺激人體產生免疫反應。圖表 5： mRNA 治療的作用機制CNKI，國金證券研究所發(fā)展歷程：關鍵技術的突破使得mRNA 疫苗未來可期n 早期技術缺陷使 mRNA 疫苗研究進展緩慢。1

10、961 年，首次發(fā)現(xiàn) mRNA； 1990 年，Wolff 等人發(fā)現(xiàn)在小鼠肌肉組織中注射含有特定基因的質粒 DNA 或 mRNA，小鼠組織局部會產生該基因編碼的蛋白產物，此后多項研究發(fā)現(xiàn)用核酸免疫動物，可以誘導機體產生針對該核酸編碼抗原的免疫力。起初，mRNA 因其高免疫原性、低穩(wěn)定性、在組織內易被降解、細胞吸收率低以及生產制備的局限，發(fā)展較為緩慢。n 新技術發(fā)展使得 mRNA 疫苗重新得到重視。近年來隨著 mRNA 合成、化- 7 -圖表 6：mRNA 發(fā)展歷程學修飾和遞送技術的發(fā)展，mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯效率大幅提高，免疫原性逐步可控，在腫瘤免疫治療領域和突發(fā)傳染病領域顯示出巨大的商業(yè)價

11、值，因此 mRNA 疫苗重新受到重視。Nature，國金證券研究所圖表 7：不同疫苗的特點對比獨特優(yōu)勢：mRNA 疫苗具備顯著優(yōu)勢，未來發(fā)展?jié)摿薮髇 mRNA 疫苗在研發(fā)和生產等方面具備顯著優(yōu)勢。1） 研發(fā)周期短、抗原選擇范圍廣。與傳統(tǒng)疫苗相比，mRNA 疫苗的研發(fā)只需要在成熟技術平臺上更換抗原序列即可，因此研發(fā)周期較短，在防控 突發(fā)傳染病等方面有巨大優(yōu)勢；在抗原序列方面，理論上任何可成蛋白的抗原序列均可被選擇（包括原先不可成藥的胞內靶點），因此可選范圍廣闊，應用范圍也更廣闊，如：蛋白替換療法、腫瘤免疫以及傳染病疫苗等，mRNA 疫苗發(fā)展?jié)摿薮蟆?） 安全性高。mRNA 能夠被正常的細胞自

12、然降解，半衰期與免疫原性等可通過修飾和遞送系統(tǒng)來人工調節(jié)，因此 mRNA 疫苗安全性較高；此外， 與 DNA 疫苗相比，mRNA 不存在感染或插入突變的風險。3） 有效性高且穩(wěn)定。多種修飾后的 mRNA 更穩(wěn)定，在細胞質中被高效攝取和表達；mRNA 疫苗具備自我佐劑特點，因此表現(xiàn)更強的免疫原性，有效性更高；此外，mRNA 是最小的遺傳載體，因此避免了抗載體免疫，可以重復接種 mRNA 疫苗。4） 生產難度低、速度快且安全。mRNA 疫苗不依賴細胞培養(yǎng)技術，現(xiàn)有的體外轉錄技術能夠非?？焖?、廉價地大規(guī)模生產 RNA 疫苗；相比于傳統(tǒng)疫苗的 5-6 個月的生產周期，mRNA 疫苗只要掌握了病毒基因序

13、列就可以在 40 天內完成疫苗樣品的生產制備；整個生產過程僅涉及生物化學合成，因此無病毒感染風險，難度低且更安全。此外，mRNA 作為疫苗可以同時激活體液免疫和細胞免疫，效果顯著。40天40天5-6個月5-6個月生產周期3-5年3-5年>8年>8年研發(fā)周期簡單簡單復雜，需佐劑簡單制備工藝明確明確明確不明確成分高低高低抗體特異性高低高低安全性高弱弱強免疫原性mRNA疫苗DNA疫苗亞單位疫苗減毒/滅活疫苗疫苗種類預防/治療型疫苗預防/治療型疫苗預防/治療型疫苗預防性疫苗適用范圍免疫應答特征細胞免疫、體液免疫細胞免疫或體液免疫，與佐劑有關細胞免疫、體液免疫細胞免疫、體液免疫CNKI，國金

14、證券研究所- 8 -應用領域：應用范圍廣闊，傳染病、腫瘤、蛋白代替療法n mRNA 作為疫苗，可以被廣泛應用于傳染病、腫瘤以及蛋白替換療法等領域，應用范圍較為廣闊。1） 傳染病領域。針對傳染性病原體開發(fā)預防性疫苗是控制和阻止傳染性疾病大規(guī)模流行的關鍵。mRNA 疫苗能夠靶定病毒的保守區(qū)域，直接在細胞中表達產生特定抗原，激活機體的免疫應答產生抗體，從而達到預防傳染性疾病的目的。目前開發(fā)的傳染病 mRNA 疫苗主要針對流感、呼吸道合胞病毒、HIV 等。2） 抗腫瘤領域。抗腫瘤 mRNA 疫苗根據(jù)作用機理一般分為兩類，基于樹突狀細胞（DC）給藥的 mRNA 疫苗和直接注射的 mRNA 疫苗。如： M

15、oderna 的針對實體瘤的 mRNA-4157 與 BioNTech 的針對轉移性黑色素瘤的 BNT122。3） 蛋白替代療法領域。通過將人體變成自身蛋白加工廠，從而可以用來治療一些罕見病。如 Moderna 公司用于治療甲基丙二酸血癥（MMA）的mRNA-3704 和治療丙酸血癥（Propionic Acidemia，PA）的 mRNA-3927 等。圖表 8：mRNA 的應用領域廣泛Nature，國金證券研究所研發(fā)生產：關鍵技術在于化學修飾與遞送系統(tǒng)n mRNA 疫苗的研發(fā)環(huán)節(jié)包括：抗原的選擇、基因測序、選定編碼目標抗原的基因序列并進行優(yōu)化、修飾核苷酸的篩選、遞送體系的優(yōu)化、免疫效果評價

16、、安全性評估等。n mRNA 疫苗的生產流程包括：1）mRNA 的合成修飾、遞送；2）在中試車間中進行疫苗生產、純化、制劑、檢測等；3）在 GMP 生產車間中進行放大生產。開發(fā)難點和關鍵技術點在于合成修（提高 mRNA 分子的穩(wěn)定性，- 9 -防降解）和遞送系統(tǒng)（提高進入人體細胞的效率，使得產生抗原刺激人體產生免疫反應）。mRNA 疫苗的工藝優(yōu)勢在于研發(fā)、生產速度快。因為mRNA 疫苗的研發(fā)過程較為類似，所以在研發(fā)過程中可進行高通量篩選， 從而提高研發(fā)速度，此外 mRNA 疫苗的生產工藝可直接放大，成藥快；而傳統(tǒng)疫苗生產過程中，每個蛋白表達都存在差異性，需要篩選優(yōu)化。專利布局：重點布局遞送和修

17、飾，新冠 mRNA 疫苗專利關系復雜n 自 2014 年開始，mRNA 疫苗的專利申請數(shù)量快速增加，其中適應癥為傳染病和癌癥的相關專利申請數(shù)量增加較為突出；而自 2017 年開始，適應癥為傳染病的專利申請數(shù)量超過了癌癥，可能與 MERS、Ebola 和新冠疫情的暴發(fā)有關。總體來看，目前專利重點布局遞送系統(tǒng)和化學修飾領域， Moderna、CureVac、BioNTech 和 GSK 共同擁有近一半的 mRNA 疫苗專利申請。圖表 9：mRNA 疫苗專利申請數(shù)量趨勢圖表 10：mRNA 疫苗專利布局情況Nature，國金證券研究所Nature，國金證券研究所圖表 11：Moderna 與 Bio

18、NTech 的 mRNA 疫苗專利布局- 10 -PUBLIC CITIZEN，國金證券研究所n 新冠 mRNA 疫苗的專利保護與許可交易關系錯綜復雜。相比于長度較小的小核酸，mRNA 的長度較長，同時還具備復雜的二級結構，因此 mRNA 對與遞送系統(tǒng)有著更高的要求，所以我們需要重點關注遞送系統(tǒng)以及其專利問題。以新冠 mRNA 疫苗的遞送系統(tǒng)為例，BioNTech 不得不將其原有的 LPX 遞送系統(tǒng)更換為 LNP，而 Moderna 則冒著被訴訟的風險直接啟用了專利屬于 Arbutus 公司的 LNP 遞送系統(tǒng)。事實上，目前 LNP 遞送系統(tǒng)幾乎都可以追溯到同一 IP 來源。在下方的專利保護與

19、許可交易的關系網絡圖中，大節(jié)點代表相關公司，小節(jié)點代表已確定的疫苗技術專利，線條代表兩個公司之間的協(xié)議或專利許可交易關系。圖表 12：新冠 mRNA 疫苗專利保護與許可交易關系網絡圖表 13：mRNA 疫苗專利關鍵詞分析Nature，國金證券研究所Nature，國金證券研究所n mRNA 分子修飾的關鍵專利壁壘較高。2005 年，Katalin 和 Drew 等人發(fā)現(xiàn)用假尿苷去替換 mRNA 中的尿苷，不但能夠讓合成的 mRNA 免受免疫系統(tǒng)的攻擊，而且顯著增強了 mRNA 表達蛋白的能力。這一突破性的發(fā)現(xiàn)結果發(fā)表在 Immunity 雜志上，解決了 mRNA 臨床應用的最大難題，從此揭開了

20、mRNA 臨床應用的序幕。目前，mRNA 分子修飾的專利壁壘較高， 專利的源頭 Katalin、Drew 以及美國賓夕法尼亞大學獨家授權給 mRNA Ribo Therapeautics ，該公司隨后將專利二次授權給 Cellscript。隨后，- 11 -Cellscript 又將專利二次授權給 Moderna 和 BioNTech 。Moderna 與BioNTech 的新冠 mRNA 疫苗使用 N1-methylpseudouridine (1m)取代尿苷(U)進行核苷修飾，顯著降低了 mRNA 的先天免疫應答。相比之下，作為 mRNA 三巨頭之一的 CureVac 或許因為在 mRNA

21、 分子修飾方面存在專利問題，所以采用了未經修飾的尿苷，通過序列優(yōu)化和選擇非翻譯區(qū)（UTRs）來增強 mRNA 的翻譯，因此導致免疫原性較高、劑量較小、效果較差。圖表 14： mRNA 分子修飾的關鍵專利授權情況University of Pennsylvania，公司官網，n LNP 遞送技術原本用于遞送 RNAi 藥物。Arbutus 是 LNP 遞送技術的開山鼻祖，是一家專注于乙肝的小型生物制藥公司，發(fā)明 LNP 遞送技術的目的主要是用于遞送乙肝 RNAi 藥物。該公司在取得專利后將 LNP 遞送技術授權給 Alnylam，Alnylam 利用 LNP 遞送技術成功上市了第一個治療 ATT

22、R的 RNAi 藥物。然而，Alnylam 后來開發(fā)了帶有葡萄糖乙酰胺靶向配體、靶向肝臟的 RNAi 技術，該技術安全性更好、給藥周期更長、更方便。隨后，Arrowhead 公司馬上跟進該技術，研發(fā)了首個治愈乙肝潛力的 RNAi 藥物，并授權給強生開發(fā)。此時，乙肝 RNAi 藥物的遞送技術已經從 LNP 轉到靶向配體，Arbutus 的乙肝 RNAi 藥物的開發(fā)進度已經有所落后。但后來，LNP 遞送技術被多家開發(fā) mRNA 的公司所青睞，如：Moderna、Curevac、BioNtech 等。他們通過間接授權獲得 LNP 遞送技術，但目前產生了一定的專利糾紛。n LNP 遞送技術壁壘高，專利

23、問題尚存糾紛。Arbutus 將 LNP 遞送技術（專利號：US8058069）部分轉移給加拿大公司 Acuitas，并規(guī)定 Acuitas 只在“antisense”和“基因治療”兩個領域擁有 LNP 技術的使用和二次授權權利。2016 年， Acuitas 卻違規(guī)地將 LNP 全部技術二次授權給Moderna 以及 CureVac。但 Arbutus 并不認可此次的二次授權并向法院提起訴訟。根據(jù)法院判決，Moderna 只被允許在 4 種病毒疫苗的研發(fā)上繼續(xù)應用 Arbutus 的 LNP 遞送系統(tǒng)，其余的應用授權都無效。2017 年， Arbutus 終止了 Acuitas 繼續(xù)使用和二

24、次授權 LNP 遞送技術的權益。2018 年，Arbutus 與 Riovant 公司共同成立了Genevant，并將 LNP 遞送技術的 權益轉移給 Genevant。Genevant 擁有 LNP 遞送系統(tǒng)專利，包括納米顆粒制備專利和陽離子脂質（MC3）專利，其中 MC3 專利預計 2030 年到期。BioNTech 從 Genevant 得到 Arbutus 的專利授權，使用 Arbutus 的 LNP 遞送系統(tǒng)是因為已經有使用該技術的藥物被 FDA 審批通過，遞送系統(tǒng)的安全性有保證，并能夠加速審批時間。此外，Moderna 從 2018 年開始挑戰(zhàn)Arbutus 的 LNP 專利，包括

25、當年授權給 Acuitas 的 US8058069，但是該專利挑戰(zhàn)失敗。此外，Moderna 也開始自主研發(fā) LNP 遞送技術。但 Arbutus 指出，根據(jù) Moderna 所發(fā)表的文獻、報告和專利分析，Moderna 很難在- 12 -圖表 15： LNP 遞送技術的專利授權情況不依靠 Arbutus 專利的情況下開發(fā)出有效的脂質體遞送技術。目前， Moderna 之前獲得授權的 4 個產品仍然保留了 LNP 遞送技術的使用權， 其他授權目前已終止。Moderna 新冠疫苗 mRNA-1273 采用自研的 LNP 遞送系統(tǒng)。BioNTech 目前共有三種遞送系統(tǒng)：Genevant 授權的

26、LNP、自研的 RNA-LPX、自研的多聚體 納米粒， 其中新冠疫苗 BNT162 采用Genevant 授權的 LNP。CureVac 目前的 LNP 專利情況不清晰，或需要向Genevant 申請 LNP 技術適用權限。公司官網，現(xiàn)存挑戰(zhàn)：重點關注 mRNA 疫苗的安全性、有效性與穩(wěn)定性n mRNA 疫苗或藥物創(chuàng)新程度較高，應重點關注 mRNA 疫苗的安全性、有效性與穩(wěn)定性。1） 安全性：mRNA 疫苗成分復雜、生產及制劑工藝難度高，所以對安全性有較高的要求。安全性風險主要來自于 mRNA 和遞送系統(tǒng)兩個方面，應重點關注與脂質相關的毒性問題，如：陽性聚合物材料自身的毒性或安全性、制劑及貯存

27、期間產生的降解產物以及各類雜質累積的安全性風險等；2） 有效性：mRNA 疫苗的有效性主要由遞送效率、翻譯效率以及免疫原性等因素決定；3） 穩(wěn)定性：mRNA 穩(wěn)定性較弱，在人體內極易被酶降解，半衰期僅有 7 小時；此外，作為遞送系統(tǒng)的脂質也應保證一定的穩(wěn)定性，從而保證高效穩(wěn)定的遞送效率。n 從 mRNA 疫苗的研發(fā)生產流程來看，應重點關注下列問題：1） 序列選擇：應重點關注目標抗原的選擇、序列的優(yōu)化、核苷酸的化學修飾、表達效率、免疫原性、二級結構、穩(wěn)定性等。2） mRNA：應重點關注 mRNA 的修飾比例、加帽/尾效率、去磷酸化程度、mRNA 降解片段、mRNA 的完整性及序列的準確性、dsR

28、NA、mRNA 含量等。3） 遞送系統(tǒng)：應重點關注遞送系統(tǒng)的組成成分、配比、來源、生產工藝、質量控制、穩(wěn)定性、雜質。以脂質納米顆粒為例，應重點關注電荷、粒徑 分布、pH 值、納米顆粒對 mRNA 的包封率、包封后 mRNA 的完整性、功- 13 -能性及含量、mRNA 釋放效率等問題，電荷會影響納米粒的穩(wěn)定性、入胞效率、內體逃逸及不良反應等；pH 值會影響遞送材料與 mRNA 復合的效率。4） 雜質：應重點關注聚正電荷材料相關雜質，包括材料合成產生的雜質 及 mRNA 復合過程中可能產生的雜質；不飽和脂質的氧化及相關降解產物； 納米顆粒聚集產生的顆粒物也是潛在雜質；未組裝的脂質分子、陽離子物

29、質、游離 mRNA。其中，未組裝的脂質分子會影響 LNP 的穩(wěn)定性；游離mRNA 易降解，同時也可能引起非特異免疫刺激，影響產品的安全有效性。5） 生產工藝及質量研究工藝：臨床樣品制備工藝應具備一定規(guī)模、生產連續(xù)性和放大可行性； mRNA 原液生產工藝應關注 mRNA 序列完整性、加帽率、去磷酸化、PolyA 尾長度、純度、mRNA 序列生物活性表達、工藝相關雜質的去除、產品相關雜質殘留等；納米顆粒生產工藝應關注現(xiàn)有制劑規(guī)模、放大能力、耗材使用次數(shù)、GMP 符合情況等；納米顆粒質量研究應關注包封率、粒徑分布、納米粒的穩(wěn)定性、純度、不完整 LNP、納米顆粒各成分含量、工藝相關雜質的去除、免疫原性

30、等。mRNA 疫苗技術難點圖表 16：mRNA 的結構示意圖序列選擇：正確的序列選擇是成功的一半n 正確選擇病毒的抗原序列非常重要。宿主可根據(jù) mRNA 攜帶的編碼信息來合成任何蛋白質，所以 mRNA 疫苗在選擇抗原方面異常靈活。但在選擇特定病毒的正確抗原時必須非常謹慎，要保證疫苗包含 RNA 所編碼的蛋白既安全又有效。由于不同的蛋白質是由不同的 RNA 序列編碼，因此找到最佳蛋白質抗原是確定 mRNA 疫苗研發(fā)方向的關鍵。嚴重急性呼吸綜合征（SARS）和中東呼吸綜合征（MERS）暴發(fā)多年后仍未研發(fā)出疫苗的原因之一就是尚未就哪種抗原既安全又有效達成廣泛共識。n mRNA 序列的優(yōu)化也十分重要。

31、Moderna 等公司與 Amazon 等合作解決序列優(yōu)化的問題；斯微生物通過與全球公司合作并借助“AI+云計算”技術， 開發(fā)獨特算法技術（proprietary），以實驗數(shù)據(jù)矯正數(shù)字模型，并改善預測 和序列設計的準確性和效率。與傳動的序列優(yōu)化平臺相比，該技術可以把mRNA 的表達效率提高 3-4 倍，并降低 mRNA 的降解比例?；瘜W修飾：多種方法可調節(jié)mRNA 穩(wěn)定性、翻譯效率及免疫原性n mRNA 的結構組成含有幾個必要的元件，依次包括帽子結構（Cap）、5 UTR 區(qū)、編碼抗原蛋白的開放閱讀框（ORF）、3UTR 區(qū)和 Poly（A） 尾結構。通過對 mRNA 的元件進行設計，可以提高

32、 mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯效率。除了不穩(wěn)定性和翻譯效率外，mRNA 的另一個缺點是免疫原性過高。目前的策略是在 mRNA 分子中摻入化學修飾過的核苷酸，可顯著提高其翻譯效率，延長其半衰期，同時達到降低其免疫原性的目的。（注：圖中 標注為 CDS，CDS 與 ORF 略有不同。ORF 直接由 DNA 決定，在理論上可以編碼相應蛋白，但并未在實際中被驗證；而 CDS 直接由 cDNA 決定， 是已在實際中被驗證可以編碼相應蛋白。）CNKI，國金證券研究所n Cap 結構- 14 -Cap 結構與 mRNA 的穩(wěn)定性和免疫原性密切相關，還會影響 mRNA 的翻譯效率。主要功能有：1）作為翻譯起始的必

33、要結構，為核糖體對 mRNA 的識別提供了信號；2）增加 mRNA 的穩(wěn)定性，保護 mRNA 免遭 53 核酸外切酶的降解；3）作為自身識別信號，避免激活 Rig-I 及 IFIT 而導致的免疫抑制。通過引入抗-反轉帽子類似物（ARCA），可以提高 mRNA 的 翻譯效率；此外，在 ARCA 基礎上修飾 Cap 結構，還可以提高 mRNA 的 穩(wěn)定性。n 5UTR 區(qū)5UTR 區(qū)的結構特征是影響 mRNA 翻譯效率的主要因素之一。在真核細胞中，翻譯開始前 mRNA 需要招募核糖體亞基結合到其 5m7G cap 上，但起始密碼子又常常在 5m7G cap 下游較遠的地方，所以核糖體亞基需要經過

34、5UTR 到達起始密碼子 AUG 處,從而開始翻譯。因此, 5UTR 的長度和結構對翻譯的起始具有重要影響。此外，緊密的二級結構會阻止核糖體的結合, 所以在設計 mRNA 時, 5UTR 不能太長或太緊密。在設計 mRNA 時,應該避免在 5UTR 區(qū)域引入上游開放閱讀框序列和起始密碼子 AUG。上游開放閱讀框序列是存在 5UTR 的一段包含起始密碼子和終止密碼子的連續(xù)堿基序列，它可能會抑制 ORF 區(qū)基因的表達，也可能導致 mRNA 的降解，因此對蛋白表達具有負面影響。最后,在 5UTR 區(qū)域引入強的 Kozak 序列可以加強起始密碼子的識別,讓 mRNA 更容易被翻譯，避免避免錯誤啟動（在

35、哺乳動物中 Kozak 序列是 GCCRCCAUGG， 其中 R 代表嘌呤）。n 開放閱讀框（ORF）在 mRNA 的開放閱讀框（ORF）中，將常用的密碼子去替換不常用的密碼子，即密碼子優(yōu)化，這一過程可以提高 mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯效率。在開放閱讀框（ORF）中，每相鄰的 3 個核苷酸組成密碼子，在翻譯時代表某一種氨基酸。密碼子的組成對 mRNA 的翻譯效率和穩(wěn)定性都有顯著影響。同義密碼子是指序列不同但是對應相同氨基酸的密碼子,而不同生物常用的密碼子組成都不相同。故將 mRNA 注射到人體內, 原宿主的 mRNA 包含的密碼子雖然對應相同的氨基酸，但是并不常用，導致 mRNA 進入人體后不穩(wěn)

36、定并且翻譯效率低，所以需要進行密碼子優(yōu)化。此外，通過增加嘌呤和胞嘧啶（GC）含量也有一定正面效果。n 3UTR 區(qū)3UTR 區(qū)是 mRNA 不穩(wěn)定因素的集中區(qū)域，其中 AU 富集序列（AREs）、 AUUUA 重復序列和 GU 富集序列（GREs）是 3'UTR 引起 mRNA 不穩(wěn)定的最常見因素。因此，在合成的 mRNA 中應避免這些序列。3UTR 內的AU 富集序列（AREs）是激活 mRNA 快速衰變的順式作用序列, AREs 上的 AUUUA 重復序列數(shù)量和位臵對 Poly（A）尾的縮短和 RNA 降解有關鍵的影響。而該區(qū)域上的另一 GU 富集序列（GREs）, 在哺乳動物細胞

37、中能與 CELF1 蛋白結合從而加快 mRNA 的衰變。此外，通過引入穩(wěn)定元件， 可以顯著提高 mRNA 的穩(wěn)定性，延長其半衰期。例如，BioNTech 公司專利中使用了 2 個球蛋白（-globin）串聯(lián)的 3'UTR，這大大地增強了mRNA 的穩(wěn)定性。此外，人類和球蛋白的 3' UTR 可增強 mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯效率，頭尾排列的人類 2 個-球蛋白的 3'UTR 可增加 mRNA 的穩(wěn)定性。n Poly（A）尾Poly（A）尾是影響 mRNA 翻譯效率和穩(wěn)定性的重要因素。在翻譯效率方面，Poly（A）尾和 5帽的協(xié)同作用可以增加翻譯效率；在穩(wěn)定性方面， Pol

38、y（A）尾的去除是大多數(shù)真核 mRNA 降解的第一步和限速步驟，且Poly（A）尾的存在可以抑制 mRNA 的降解和脫帽。Poly（A）尾的重要作用決定了實驗中對 mRNA 進行加尾處理的必要性。在體外為 mRNA 加尾有兩種方式：第一種是先進行體外轉錄，再通過酶促多聚腺苷酸化將Poly（A）尾加到 mRNA 上；第二種是將 Poly（A）尾序列加在模板上， 直接通過體外轉錄合成帶 Poly（A）尾的 mRNA。通過酶促反應進行加尾- 15 -時，需要注意 Poly（A）尾后若有其他堿基可能會影響其功效，因此應避免在體系中混入其他核苷酸。與此同時，最好將 Poly（A）尾的長度保持在最佳的 1

39、00 至 120 個核苷酸。例如，在 BioNTech 公司公開的專利中， 長度為 120 個核苷酸的 Poly（A）尾有最高的穩(wěn)定性和翻譯效率。但由于酶促反應進行加尾受到溫度、酶質量等反應條件的影響較大，導致 Poly（A）尾長度無法保證完全一致，故在大多臨床試驗中只能保證加尾長度 最少為多少，如果需要保證精準的 Poly（A）尾長度則需采用第二種方法。n 核苷酸類似物通過使用核苷酸類似物可以提高 mRNA 的穩(wěn)定性、降低免疫原性并且增加翻譯效率。如：假尿苷（）、5-甲基胞苷（m5C）、N6-甲基腺苷（m6A）、 5-甲基尿苷（m5U）和 2-硫尿苷（s2U）等，其中尿嘧啶類似物在核苷酸修飾

40、中較為常見。遞送系統(tǒng)：遞送方法多元，LNPs 最為常用n 三大難點是胞外屏障、內體逃逸與胞內免疫。目前，mRNA 疫苗發(fā)展受限的一大原因是遞送系統(tǒng)。如何特異性地將mRNA 遞送進入靶細胞需要解決三大難點：胞外屏障、內體逃逸與胞內免疫。mRNA 疫苗只有經過這三重考驗后才到達細胞內靶部位，最終發(fā)揮功能。1） 胞外屏障：第一個胞外屏障是 mRNA 分子在全身給藥時易受胞外血清中 RNA 水解酶（RNAse）的降解。因此需要在遞送 mRNA 時要將其包裹在密封載體內而避免被酶水解，從而保證 mRNA 可以順利到達靶細胞。第二個胞外屏障是單核吞噬系統(tǒng)（MPS）可以識別并消除外來的納米顆粒（NPs），而

41、參與吞噬過程的主要有肝和脾中的巨噬細胞，這就導致 NPs在這兩種組織中聚集，使得 mRNA 在其他組織中的轉染變得困難。2） 內體逃逸：當?shù)竭_靶細胞時，攜帶 mRNA 的載體通過內吞的方式進入細胞質，這也是最常見的載體進入細胞內的方式。內體逃逸是指 mRNA 需要從內體小泡中釋放出來，進而跟宿主細胞核糖體結合被翻譯成抗原蛋白， 抗原蛋白經過修飾后被分泌出細胞從而發(fā)揮作用。在內體小泡中，mRNA能夠被 Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）檢測到并被送去降解，因此內體逃逸對于 mRNA 到達核糖體至關重要。3） 胞內免疫： 當外來 mRNA 被遞送到細胞質中時，能夠

42、被 TLR3 和TLR7/8 識別，或者通過激活細胞質中的維甲酸誘導基因 I 樣受體（RIG-I- like receptors，RLRs）從而激活天然免疫系統(tǒng)。同時，外來的 mRNA 還可以通過激活 TLRs 誘導干擾素（IFN）-和 IFN-等 I 型干擾素等促炎細胞因子的表達。所以，合成的 mRNA 疫苗可以通過激活不同的細胞因子來促進 mRNA 免疫后的細胞或者體液反應，從而作為良好的自佐劑。但是胞內免疫也會限制 mRNA 發(fā)揮作用， TLR 家族中的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）、RLRs 和 NOD 樣受體（NOD- like

43、receptors，NLRs）能夠特異性檢測雙鏈 mRNA（ssRNA）或者單鏈mRNA（dsRNA），并且能夠在它們轉化為有治療作用的蛋白質之前使其降解。- 16 -圖表 17：mRNA 疫苗遞送面臨的三大難點CNKI，國金證券研究所n 遞送方法較為多元，脂質體優(yōu)勢突出遞送 mRNA 疫苗的手段有物理方法、病毒載體方法和非病毒載體方法。1） 物理方法：電穿孔和基因槍是物理手段遞送 mRNA 的經典方法，但是臨床實驗證明物理方法通常對細胞有害，不適合在體內應用；2）病毒載體方法：雖然慢病毒、腺相關病毒與仙臺病毒等載體可以進行核酸遞送，但由于存在安全性、穩(wěn)定性以及有效性等諸多方面的問題，病毒載體

44、方法應用也受到一定限制；3）非病毒載體方法：非病毒載體主要包括脂質體、樹狀大分子、無機納米粒子、陽離子細胞穿膜肽等。脂質體已成為目前遞送 mRNA 最有效的非病毒載體。用于遞送 mRNA 疫苗的脂質載體主要分為以下幾種：脂質體復合物（LP），脂質體聚合物（LPR），脂質體納米粒（LNP），陽離子納米乳（CNE）。脂質體及其衍生物成為近年來備受關注的 mRNA 疫苗的新型遞送系統(tǒng)。- 17 -優(yōu)點有：1）脂質體作為球形囊泡可將 mRNA 包裹在內，包封率較高，保護 mRNA 免受酶降解；2）脂質體類似于細胞膜，易與受體細胞融合，遞送效率高；3）脂質體可遞送不同大小片段的 mRNA；4）脂質體作為

45、遞送載體不受宿主限制。缺點有：1）不穩(wěn)定，易水解；2）在水解過程中易受pH 值、溫度、表面電荷、類脂組成等影響；3）易發(fā)生自動氧化，導致膜的流動性降低、藥物滲流，聚集沉淀后產生毒性；4）此外，納米脂質體易 滲漏，滲漏的原因與脂質體粒徑、所載藥物性質和生物學穩(wěn)定（如血清成 分，MPS 的吞噬作用）有關，這在很大程度上限制其作為藥物載體的應用； 5）由于疫苗與載脂蛋白 E 的結合和被受體介導的肝細胞攝取，全身遞送的 mRNA-LNP 復合物主要靶向肝臟和脾臟。圖表 18：mRNA 疫苗遞送系統(tǒng)的發(fā)展Nature，國金證券研究所n 脂質納米粒（LNPs）是最為常用的遞送系統(tǒng)脂質納米粒（Lipid n

46、ano particles，LNPs）是最先進和主流的 mRNA 遞送系統(tǒng)，最初在 siRNA 的遞送中被證明是安全有效的。LNPs 通常由可電離的陽離子脂質、聚乙二醇（PEG ）、膽固醇和磷脂四種成分組成，其中可電離的陽離子脂質具有較高的專利壁壘。除了保護 mRNA 外，LNPs 還可以促進細胞攝取、提高內體逃逸，保護 mRNA 分子不被 TLRs 識別，避免- 18 -先天免疫系統(tǒng)的過度激活的作用。具體成分及功能是：1）可電離的陽離子脂質，可以結合帶負電 mRNA、增強內體逃逸。在生產原液時，將 mRNA 與可電離陽離子脂質在特定的 pH 環(huán)境下混合在一起，帶負電的 mRNA 會與陽離子脂

47、質產生靜電吸引從而融合在一起；2）與脂質相連的聚乙二醇（PEG）及其衍生物，可以增加制劑的半衰期、減少聚集和非特異性攝取， PEG 的含量可能會影響細胞吸收；3）膽固醇有利于確保 LNPs 的雙層結 構和脂質的流動性；4）天然的磷脂具有穩(wěn)定 LNPs 雙層結構的作用，因為脂質體的雙層結構并不穩(wěn)定。LNPs 的遞送機制主要是通過陽離子脂質體與帶負電荷的 mRNA 結合，形成粒徑小于 200nm 的復合物，然后通過內吞的方式進入細胞。在體外實驗中，多種商業(yè)的轉染試劑表現(xiàn)出良好的轉染效果。但大多數(shù)商業(yè)試劑在體內遞送效果不佳，且具有肝損傷等毒性，以及載體免疫原性等缺點而不能用于人體。商業(yè)試劑體內活性喪

48、失的一個根本原因在于陽離子脂質體mRNA 復合物帶有正電荷的特性，這種帶正電荷的復合物在全身循環(huán)時， 能被帶負電荷的血清蛋白包裹，使其被單核巨噬細胞清除。此外，LNPs 還存在過敏反應、易氧化降解、制備重現(xiàn)率差等問題，以 LNP 為載體制備的 mRNA 制劑會在肝臟及脾臟聚集，難以靶向其他部位。由于 LNPs 技術目前仍存在以上的缺點，因此應用受到一定限制，行業(yè)也正在探索脂質復合物、多聚體等新型遞送載體，未來載體技術仍有巨大提升空間。例如，Bio NTech 還開發(fā)了脂質體運載（lipoplexes，LPX）技術和聚合物運載技術（polyplexes）。其中，LPX 技術可很好地穩(wěn)定 RNA，

49、且制劑自身應有免疫佐劑的作用，該公司重要的產品均利用 LPX 平臺實現(xiàn)遞送；國內斯微生物開發(fā)的 LPP 納米遞送平臺是一種以聚合物包載 mRNA 為內核、磷脂包裹為外殼的雙層結構。與傳統(tǒng)的 LNP 相比，LPP 的雙層納米粒具有更好的包載、保護 mRNA 的效果，并能隨聚合物的降解逐步釋放mRNA 分子。n 新冠 mRNA 疫苗均采用 LNP 遞送系統(tǒng)，成分配方有所不同目前所有的新冠 mRNA 疫苗都以相同的 SARS-CoV-2 抗原為靶點，并包 含編碼全長跨膜錨定 S 蛋白的 mRNA。三種新冠 mRNA 疫苗都采用了LNP 遞送系統(tǒng)，其中 CureVac 處方中具體脂質成分未知，BioN

50、Tech 和Moderna 的新冠 mRNA 疫苗使用的可電離脂質分別為 ALC-0315 和 SM- 102，其所用的 PEG 脂質分別為 ALC-0159 和 PEG2000-DMG。二者共同的輔助脂質為 DSPC、膽固醇。以上三種 mRNA-LNPs 的各脂質摩爾比為可電離脂質：磷脂：膽固醇：PEG- 脂質=50:10:38.5:1.5 ，mRNA- 脂質的質量比為 0.05。此外，由于脂質尾部引入酯鍵，ALC-0315 和 SM-102 的生物可降解性較好。研究表明在遞送 mRNA 時，SM-102 脂質的效果優(yōu)于Onpattro 的 MC3 LNPs，原因在于 SM-102 有更好的

51、耐受性和更高的內吞體逃逸效率。由此可見，脂質結構和組成的差異可能對 mRNA 的遞送效率等造成巨大的影響。PEG 脂質，可提高 LNP 在制備和儲存中的穩(wěn)定性， 而這些 PEG 脂質一般含有短?；?，有助于 PEG 脂質在注射后迅速從LNPs 中分離，促進 LNPs 與細胞的相互作用。目前，新冠 mRNA 疫苗需要嚴格的儲存條件，限制了它們在冷庫稀缺或不可用的地方的銷售。未來， 凍干或其他藥物處理方法可能有助于解決這一問題，甚至可以實現(xiàn)鼻腔、 口腔或呼吸道給藥。- 19 -圖表 19：新冠 mRNA 疫苗的成分對比International Journal of Pharmaceutics，圖

52、表 20：新冠 mRNA 疫苗使用的脂質International Journal of Pharmaceutics，生產工藝：瓶頸在于原材料與規(guī)?；an mRNA 的生產主要包括上游合成和下游純化。相比起傳統(tǒng)疫苗，mRNA 疫苗的優(yōu)勢之一就是相對簡單的生產過程。目前，暫無完善的 mRNA 疫苗生產制造平臺，mRNA 的制造主要分為上游 mRNA 的酶促反應合成和下游mRNA 產物的純化，隨后是 LNP 的包封，最后一步是制劑的灌裝。n 上游合成：體外轉錄酶促反應（in vitro transcription enzymatic reaction, IVT）是以 DNA 為模版，并依賴 RN

53、A 聚合酶催化生成目標 mRNA 的過程。DNA 模版需要提前制備，通常使用純化的質粒進行線性化或者使用 PCR 技術擴增目標片段。除了線性 DNA 模版外，IVT 成分還需要包含 RNA 聚合酶、NTPs 底物、聚合酶輔因子或 MgCl2 以及 pH 緩沖液。與復雜且耗時的傳統(tǒng)疫苗生產過程相比，IVT 酶促反應過程僅需幾個小時即可完成， 由于生產時間的大大縮減，相應生產過程中的污染風險也被降低。一般來說，該反應的每毫升可以收獲毫克級別的 mRNA。n mRNA 的加帽分為一步法和兩步法。一步法是指在 IVT 酶促反應過程中， 用帽子類似代替物 GTP 底物進行加帽，加帽效率約為 60-80%

54、；兩步法是指在 IVT 酶促反應生成 mRNA 后，利用 VCC 和甲基供體作為底物再對mRNA 進行加帽，加帽效率約為 100%。兩步法的加帽效率更高，但一步法由于不涉及第二步的酶促反應，因此速度更快。n 下游純化：mRNA 在由 IVT 生產出來之后，需要進行純化來去除雜質，從- 20 -而達到臨床純凈的標準。生產出來的產品中不僅包含目標 mRNA，還包含有很多雜質，如：酶、殘留的 NTP 和 DNA 模板以及在 IVT 過程中形成的異常 mRNA，因此需要進一步純化，在純化階段所使用的幾種方法都有一定缺陷，如不能有效去除 RNA 片段或 dsDNA 等。雜質的去除非常重要， 因為雜質會降

55、低翻譯效率以及改變免疫原性等。目前常見的純化的方法有SEC （Size Exclusion Chromatography），IPC （Ion Pair reverse-phase Chromatography），IEC （Ion Exchange Chromatography）等。圖表 21：mRNA 的生產工藝分為上游合成和下游純化Vaccine，國金證券研究所n 連續(xù)生產工藝是未來的發(fā)展方向。目前，IVT mRNA 的生產方法存在一定缺陷，因此需要被進一步改善以適應廣泛商業(yè)化的需求。由于連續(xù)生產工藝在降低成本方面具備獨特優(yōu)勢，因此我們認為連續(xù)生產工藝是未來mRNA 生產方法的主要發(fā)展方向。

56、連續(xù)生產工藝目前已經被廣泛用于化學與制藥工業(yè)，這種方法不僅能按需生產，而且靈活性和成本效益更高。此外，連續(xù)生產的過程還可以減少生產過程的操作時間，進一步利用自動化- 21 -圖表 22：連續(xù)生產工藝是未來發(fā)展方向和生產分析技術，從而提高產率和產品質量。Vaccine，國金證券研究所n 原材料的可及性受限以及成本高昂。IVT 反應的特殊成分必須從經認證的供應商處購買，來確保原材料均不含動物成分且符合 GMP 等級，因此原材料可及性受到一定限制；此外，在生產過程中所大量使用的原材會極大地增加生產成本，如帽子 cap 類似物等。n 規(guī)?；a存在難度。mRNA 與脂質的混合是 mRNA 疫苗生產工藝的難點，由于此前缺乏大規(guī)模生產經驗，因此原料供應和生產工藝的摸索與優(yōu)化均是目前限制全球 mRNA 疫苗產量的主要原因之一。Moderna 與BioNtech 作為兩家生物技術公司，