基因編輯技術PPT課件

1、2021/3/91基因編輯技術產(chǎn)生背景定義及原理分類及比較CRISPR的優(yōu)點及在植物育種上的應用CRISPR基因編輯技術的一般操作程序2021/3/92全基因組測序技術的不斷發(fā)展和完善大型基因組注釋項目的實現(xiàn)基因革命（基礎科學與個性化醫(yī)療之間進行轉化）將大量數(shù)據(jù)轉化為功能和臨床相關知識解決這個問題最核心的是需要有高效、可靠的方法使研究者能夠知道基因型如何影響表型利用同源重組機制對基因進行定向失活是為基因功能評估提供信息的有力手段。但是這一技術的應用有幾個限制因素，包括遺傳工程組件插入目標位點的效率低、篩選過程費時費力、有可能產(chǎn)生不利的突變效應等。RNAi基因靶向敲除技術給研究者提供了快捷、廉價

2、而且可以開展高通量研究的新方法，但是， RNAi的基因敲除效果還不夠徹底，每次試驗以及每個實驗室的試驗結果都會有差異，另外還存在不可預知的脫靶情況，所以只能夠用于需要暫時抑制基因功能的試驗當中。基因編輯技術（近十年出現(xiàn)）:可以幫助科研人員對各種細胞和各種生物體內的幾乎任意基因進行人工操作ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering一、基因編輯技術的產(chǎn)生背景一、基因編輯技術的產(chǎn)生背景2021/3/932014年3月12日，賓夕法尼亞大學Pablo Tebas教授團隊在新英格蘭醫(yī)學雜志撰文稱，他們利用Sangamo

3、BioSciences開發(fā)的ZFNs基因編輯技術，顯著提高了艾滋病患者對艾滋病毒的抵抗能力。1、在不同人種之間，自由在不同人種之間，自由“切換切換”基因編輯技術首次應用于臨床。目前Sangamo BioSciences基于ZFNs技術治療艾滋病的方法已經(jīng)進入臨床II期試驗。免疫細胞表面的CCR5蛋白是HIV進入免疫細胞的“入口”。而少數(shù)北歐人由于CCR5基因“變異”（來源于原始高加索人），具備天然的HIV抵抗力?！耙话鸦颊叩腃CR5基因都改成高加索人種那種類型吧”！2021/3/942、“關閉關閉”一個基因，打開生命之門一個基因，打開生命之門2015年11月5日，Waseem Qasim對外

4、宣布，他們利用Cellectis公司經(jīng)TALENs基因編輯技術改造的UCART19細胞株，成功緩解了Layla的不治之癥-急性淋巴細胞性白血?。ˋLL），造就了世界首例嬰兒白血病治療奇跡，是基因編輯技術有史以來第二次被運用在人體上技術。修改捐贈細胞使其抗癌：修改捐贈細胞使其抗癌：蕾拉的生命獲救得益于基因工程修改過的血液細胞。捐贈的血液細胞來自美國，科學家總共對其進行了三次修改?？茖W家們首先在捐贈的血液細胞中添加抗白血病基因，這些基因可編碼靶向并殺死癌細胞的蛋白質，其次科學家使用TALENs技術關閉兩個基因，關閉第一個基因是為了確保捐贈的細胞不被蕾拉的身體排斥，關閉第二個基因是為了確保捐贈細胞不

5、被治療藥物殺死。http:/ Bosley在劍橋大學召開的EmTech大會上宣布，實驗室數(shù)據(jù)表明，CRISPR基因編輯技術可以用于治療Leber congenital amaurosis（LCA；利伯先天性黑朦病，一種遺傳性視力衰退疾病），Editas將在2017年開展CRISPR基因編輯人體實驗。Editas宣布的2017年人體實驗激動人心之處在于，這有可能是首次體內（in vivo）基因編輯試驗。這項研究成功的意義在于，將CRISPR基因編輯“工具”裝載到病毒體內，再把病毒注射到患處，CRISPR可以自行對患病部位進行基因改造。那么以后治療Layla那樣的白血病，不用分離T細胞了，直接將改

6、造好的病毒注射到骨髓，就直接將基因異常的骨髓修復了，或者是直接整合目標基因加強其戰(zhàn)斗力。這樣一來，很多大手術就會變成微創(chuàng)手術，帶來的好處是難以估量的。Editas的CEO Katrine Bosley2021/3/96二、二、什么是基因組編輯技術什么是基因組編輯技術 所謂基因編輯技術，是指對DNA核苷酸序列進行刪除和插入等操作，換句話說，基因編輯技術使得人們可以依靠自己的意愿改寫DNA這本由脫氧核苷酸書寫而成的生命之書。2021/3/97基因編輯技術的原理基因編輯技術的原理 構建一個人工內切酶，在預定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細胞內的DNA修復系統(tǒng)修復系統(tǒng)修復過程中會產(chǎn)生突變，從

7、而達到定點改造基因組的目的。 DNA修復系統(tǒng)主要通過兩種途徑修復DNA雙鏈斷裂（double-strand break, DSB）,即非同源末端連接（Nonhomologous end joining, NHEJ）和同源重組（homologous recombination, HR）。通過這兩種修復途徑，基因組編輯技術可以實現(xiàn)三種基因組改造的目的，即基因敲除，特異突變的引入和定點轉基因2021/3/981）基因敲除）基因敲除：如果想使某個基因的功能喪失，可以在這個基因上產(chǎn)生DSB，NHEJ修復的過程中往往會產(chǎn)生DNA的插入或刪除（indel），造成移碼突變，從而實現(xiàn)基因敲除。2）特異突變引入：

8、）特異突變引入：如果想把某個特異的突變引入到基因組上，需要通過同源重組來實現(xiàn)，這時候要提供一個含有特異突變同源模版。正常情況下同源重組效率非常低，而在這個位點產(chǎn)生DSB會極大的提高重組效率，從而實現(xiàn)特異突變的引入。3）定點轉基因）定點轉基因：與特異突變引入的原理一樣，在同源模版中間加入一個轉基因，這個轉基因在DSB修復過程中會被拷貝到基因組中，從而實現(xiàn)定點轉基因。2021/3/99三、基因編輯技術的分類三、基因編輯技術的分類第一代人工核酸內切酶：鋅指核酸內切酶（zinc finger endonuclease, ZFN )，鋅指是一類能夠結合DNA的蛋白質，人類細胞的轉錄因子中大約有一半含有鋅

9、指結構，ZFN是將鋅指蛋白與核酸內切酶Fok I融合形成的核酸內切酶，利用它可以在各種復雜基因組的特定位置制造DNA的雙鏈切口。第二代人工核酸內切酶：類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease, TALEN)的出現(xiàn)在很大程度上替代了ZFN。 TALEN可以和ZFN一樣對復雜的基因組進行精細的修飾，同時其構建較為簡單，特異性更高，因此受到了科研工作者的青睞。2012年，TALEN被科學雜志評為十大科學突破之一。第三代人工核酸內切酶：規(guī)律間隔成簇短回文重復序列-Cas蛋白（clustered regularly inte

10、rspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9)，主要是基于細菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成，其特點是制作簡單、成本低、作用高效。2021/3/910圖B：鋅指核酸酶二聚體與 DNA結合示意圖。鋅指核酸酶的靶序列含有兩個鋅指蛋白結合位點，不過這兩個位點之間還有一段57bp的間隔序列，鋅指核酸酶里的Fok I酶切結構域就能夠切割這段間隔序列。當然，我們也可以設計出只能夠識別左側或者右側結合位點的鋅指蛋白。ZFN： Cys2His2鋅指蛋白 圖A：一個鋅指大約由30個氨基酸組成，形成了一種保守的結構。在鋅指螺旋結

11、構表面的那幾個氨基酸能夠與DNA大溝上的3個堿基結合，不過這種結合的選擇性會有所差異。 因為有了高度保守的鏈接序列，我們就可以設計出能夠識別918個堿基長度的DNA序列。在一段 680億個堿基組成的DNA序列里，18個堿基組成的序列就足以成為一段特異性的序列，所以如果能夠設計出含有3種以上的鋅指蛋白DNA識別結構域的蛋白，那么就意味著科學家們能夠利用鋅指蛋白識別出人類基因組里的任意一段DNA序列。2021/3/911 TALE蛋白中的DNA結合結構域是由一連串3335個氨基酸組成的重復結構域組成的，其中每一個結構域都能夠識別一對堿基。TALE核酸酶的DNA結合特異性主要由兩個高度可變的氨基酸決

12、定，科學家們將這兩個關鍵的氨基酸稱作重復可變雙氨基酸殘基位點（repeat-variable di-residues, RVD）。 與鋅指結構域一樣，這種TALE重復模塊也能夠串聯(lián)起來，識別一長串的DNA序列。 TALEN分子比ZFN大得多，因此很難高效導入，科學家們也想出了不少的辦法，如金門分子克隆技術（Golden Gatemolecular cloning） 。 TALEN2021/3/912CRISPR/Cas系統(tǒng)系統(tǒng)CRISPR/Cas 系統(tǒng)的作用特性與限制性核酸內切酶相似，它對序列的特異性切割主要依賴于crRNA 與Cas 蛋白形成的核糖核蛋白復合物識別靶序列上的PAM 以及pro

13、tospacer 根據(jù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)這一特性，將其用于設計人工的核酸內切酶(engineered endonuclease，EEN)，用來對我們感興趣的基因位點進行修飾 三類CRISPR/Cas 系統(tǒng)中Type型系統(tǒng)的核糖核蛋白復合物相對簡單，除crRNA 和tracrRNA 外，只有Cas9 一個蛋白目前，產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes SF370)的Type型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸內切酶。2021/3/913其基因座結構可分為三部分三部分：5 端為tracrRNA 基因，中間為一系列Cas蛋白編碼基因，包括Cas9、Cas1、Cas2 和Csn

14、2，3 端為CRISPR 基因座，由啟動子區(qū)域和眾多的間隔序列(spacers)和重復序列(direct repeats)順序排列組成。CRISPR/Cas的基因座結構的基因座結構2021/3/914CRISPR/Cas的作用機理的作用機理（分為三個階段來理解）：PhasePhasePhase2021/3/915噬菌體或是質粒上與間隔序列對應的序列被稱為protospacer，通常protospacer 的5 或是3 端延伸幾個堿基序列很保守，被稱為PAM(protospacer adjacent motifs)，它的長度一般為25堿基，一般與protospacer 相隔14 堿基新間隔序列的

15、獲得可能分為三步：首先識別入侵的核酸和掃描外源DNA 潛在的PAM，將臨近PAM 的序列作為候選protospacer；然后在CRISPR 基因座的5端合成重復序列；最后新的間隔序列整合到兩個重復序列之間(圖2)。目前只有第一個步驟被證實。第一，CRISPR的高度可變間隔區(qū)的獲得2021/3/916第二，CRIPSR 基因座的表達（包括轉錄和轉錄后的成熟加工）：多個研究表明CRISPR基因座首先被轉錄成前體CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在Cas 蛋白或是核酸內切酶的作用下被剪切成一些小的RNA 單元，這些小RNA 即為成熟crRNA，由一個間隔序列和部分重復序列組成， Typ

16、e型CRISPR/Cas系統(tǒng)crRNA 的成熟除了需要Cas9 和RNase參與以外，還需要tracrRNA的指導 ；2021/3/917第三，是CRISPR/Cas系統(tǒng)活性的發(fā)揮或者是對外源遺傳物質的干擾：成熟的crRNA 與特異的Cas 蛋白形成核糖核蛋白復合物，再與外源DNA結合并掃描到外源DNA，尋找其上的靶序列，crRNA 的間隔序列與靶序列互補配對，外源DNA 在配對的特定位置被核糖核蛋白復合物切割早期研究認為crRNA的間隔序列(spacer)與外源DNA 的靶位點完全互補配對對于切割是必需的，但是后來的研究證明spacer 與protospacer 部分互補配對時切割也可以發(fā)生

17、。2021/3/9182013年Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, Carlos F. Barbas. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 09 May 2013; DOI: 10.1016/j.tibtech.2013.04.0042021/3/919CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs的比較功能結構功能結構： ZFNs、TALENs人工核酸酶的原理是一樣的，都是由DNA結合蛋白與核酸內切酶Fok I融合而成，

18、以二聚體形式發(fā)揮功能且只需要蛋白質元件。序列特異性由每條多肽的DNA結合域決定，剪切由FokI酶結構域決定。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)由一個單體蛋白和一個嵌合的RNA構成，序列特異性由gRNA中20個堿基序列決定，剪切由Cas9蛋白執(zhí)行。設計難度：設計難度：由于鋅指蛋白與DNA互作的復雜性以及序列特異性的進一步限制，一般認為ZFNs的設計比較困難， 成本昂貴，而且其專利被少數(shù)幾家商業(yè)公司控制。商業(yè)化的ZFNs較使用公共資源設計的ZFNs效果好，但是貴得多(比如美國的Sangamo Biosciences（Richmond, CA, USA）公司和美國SigmaAldrich（St. Loui

19、s, MO, USA）公司合作，開發(fā)出的一套名為CompoZr的鋅指蛋白構建系統(tǒng)）。 TALENs要更容易設計一些，因為在蛋白質重復與DNA序列間有一對一的識別規(guī)則，而且高效的DNA組裝技術，如Golden Gate克隆，簡化了TALENs元件的組裝，然而TALENs基于的高度重復序列會促使體內發(fā)生同源重組。目前也出現(xiàn)了商業(yè)化的人工TALEN文庫，比如法國巴黎的Cellectis Bioresearch公司（一個未經(jīng)驗證的定制TALEN的價格是3360美元，驗證過的是5000美元）、美國的Transposagen Biopharmaceuticals公司（Lexington, KY, USA）

20、和生命科技公司（Life Technologies, Grand Island,NY, USA）都提供這類服務。相較而言， gRNA引導的剪切只依賴于與目標DNA序列進行簡單的Watson-Crick堿基配對，因此不需要對每個目標位點進行復雜的蛋白質工程改造，而僅需修改gRNA中20個堿基序列來識別不同的目標位點。2021/3/920靶標：靶標： ZFNs理論上可以靶定任何序列，但實際上，目標的選擇受限于模塊的可行性（基于序列依賴的組裝平臺合成）。利用公共數(shù)據(jù)庫，基因組DNA序列上平均每100bp就可制備1個功能性ZFNs。 TALENs靶標受限于需要第一個堿基是胸腺嘧啶，另外，不是所有的TA

21、LENs都能在體外有效工作，而且一些還不能產(chǎn)生預期的突變，這就意味著每個TALEN對都需要進行實驗驗證。比較而言， CRISPR/Cas9系統(tǒng)理論上僅需在目標位點上游含有NGG（或NAG）PAM模體，但是，不能完好匹配的間隔序列可能會引起脫靶剪切，因此gRNA的序列必須仔細設計，以避免脫靶發(fā)生，因此實際上能剪切的目標位點會有所減少。 Xie et al.利用哺乳動物的 CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行計算機模擬分析表明，在8個代表性植物（擬南芥、蒺藜狀苜蓿、大豆、番茄、短柄草、水稻、高粱、玉米）的基因組中，每100bp可鑒定到5-12個NGG-PAM，PAMs的數(shù)量與基因組大小相關，相同基因組大

22、小的單子葉植物較雙子葉植物含有更多的特異gRNA。除玉米外，可以設計特異gRNA編輯85%-99%的已注釋轉錄單元，其中68%-96%的轉錄單元含有至少10個不同的可定位NGG-PAM位點；玉米是8個物種中基因組最大、被注釋的基因數(shù)最多的物種，僅30%的轉錄單元可以設計特異的gRNA進行編輯，這與基因組的復雜性和序列結構相關?？梢灶A測，小麥、大麥等基因組比玉米更大的物種可能會面臨相同的問題。但是，將來通過使用與有不同PAM要求的Cas9同源蛋白，可以拓展CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物基因組中的應用范圍。CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs的比較2021/3/921 剪切特點剪切特點：

23、 ZFNs和TALENs均攜帶限制性內切酶FokI的活性域，能夠產(chǎn)生帶有粘性末端的一個DSB，其依據(jù)連接子和間隔子的差異而有不同的長度。Cas9有兩個剪切域RuvC和HNH，在目標DNA序列PAM上游3個堿基處進行剪切，產(chǎn)生平齊末端（在體外， Cas9偶爾也能產(chǎn)生1-2個堿基的粘性末端）。特定的粘性末端對于DNA分子的精細插入十分有益，它由NHEJ介導相容末端連接完成。利用好雙切口酶方法， CRISPR/Cas9系統(tǒng)也能產(chǎn)生這樣的結構。 效率效率： CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中可實現(xiàn)高突變率，效率與ZFNs和TALENs相當或更高。突變的效率受目標序列差異、gRNA的序列或結構、Cas9

24、的版本（不同物種的密碼子優(yōu)化）和gRNA的表達策略等影響。而且報道的突變率與分析方法的靈敏性有關，所以并不奇怪對于相同物種不同人報道的突變率差異較大。CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENs的比較2021/3/922四、四、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢系統(tǒng)的優(yōu)勢 簡單（Simplicity）、易獲取Accessibility 低成本（Cost）、用途廣（versatility）區(qū)別于ZFNs和TALENs，不需要蛋白質工程，因此針對每個目標基因可檢測多個gRNA，更加直接；不需要克隆，針對不同的目標特異性僅需改變gRNA的20個堿基；任意數(shù)量的gRNA都可以通過體外轉錄法，利用兩條互

25、補的退火寡核苷酸鏈制備而成；大型gRNA庫的組裝因此并不昂貴，從而使CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠應用于高通量功能基因組學研究，而且任何分子生物學實驗室都承擔得起基因組編輯的預算費用。2021/3/923區(qū)別于ZFNs和TALENs， CRISPR/Cas9系統(tǒng)能剪切人類細胞中的甲基化DNA，從而進行遺傳修飾，這是其它核酸酶無法實現(xiàn)的。 植物中，這一方面還沒有進行專門研究，但是有理由相信剪切甲基化DNA是 CRISPR/Cas9系統(tǒng)所特有的，并且與目標基因組無關。 植物中大約70%的CpG/CpNpG都是甲基化的，尤其是在啟動子區(qū)及第一個外顯子區(qū)的CpG島。因此，總體來說， CRISPR/Ca

26、s9系統(tǒng)對于植物的基因組編輯更具通用性，尤其適合于GC含量高的單子葉植物基因組，如水稻。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢2021/3/924CRISPR/Cas9系統(tǒng)較ZFNs和TALENs，最主要的應用優(yōu)勢是易于多位點編輯，即同時在多個位點引入DSBs，從而同時編輯多個基因。尤其有利于對冗余基因或代謝路徑進行敲除。 相同的策略還可用于在同一染色體的兩個相距較遠的剪切位點間引入大片段缺失或遺傳轉換。 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行多位點編輯僅需要單個Cas9蛋白和多個不同序列特異性的gRNA，相反，使用ZFNs或TALENs進行多位點編輯需要針對每個位點特異性的不同二聚體蛋白。CRISPR

27、/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢2021/3/925CRISPR研究界實施的開放獲取政策也促進了這一技術的快速傳播和應用。與ZFN平臺的所有權性質不同， CRISPR研究界提供開放性的質粒、網(wǎng)絡工具（用于篩選gRNA序列以及預測特異性），同時主持活躍的討論組。這些設施機構鼓勵更多人利用這一技術，進而促進了對其更深的了解與應用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢2021/3/926CRISPR/Cas9的特異性（relaxed specificity） CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的一個爭議是早期報道的相對較高的脫靶突變，隨后研發(fā)出了一些策略來減少脫靶編輯發(fā)生最重要的是謹慎設計gRNA（gRNA的脫靶效應可

28、以快速、便宜的檢測出來）優(yōu)化核酸酶的表達（高濃度的Cas9和gRNA可以提高脫靶效應）采用突變的Cas9蛋白版本，將其轉化為切口酶，使用兩個Cas9切口酶可以引入偏移的單鏈缺口，產(chǎn)生一個交錯的DSB，這個策略提高了識別堿基的特異性失活的Cas9與FOKI融合改變gRNA的長度 脫靶效應在相同物種的不同細胞類型中差異較大2021/3/9272021/3/928CRISPR-Cas9基因編輯技術的研究及應用歷史基因編輯技術的研究及應用歷史1987年，發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復序列（CRISPR）2005年，推測CRISPR的生物功能（與細菌抵抗外源遺傳物質入侵的免疫系統(tǒng)有關）2007年，證實CRISPR序列

29、與Cas基因結合抵抗病毒入侵，由此揭開了研究CRISPR作用機制的序幕（2008-2011年）2012年， CRISPR/Cas系統(tǒng)開始由生物現(xiàn)象發(fā)展為基因組編輯工具-只要改變crRNA的20個核苷酸就可以簡單地對目標DNA序列進行重新編程，而且crRNA的定位特異性與tracrRNA的結構性能可以相結合組成一個嵌合的單條引導RNA（gRNA），從而將三元系統(tǒng)三元系統(tǒng)簡化為二元系統(tǒng)二元系統(tǒng)。五、五、CRISPR-Cas9基因編輯技術的應用基因編輯技術的應用2021/3/9292013年至今， CRISPR/Cas系統(tǒng)逐漸被廣泛應用：（ CRISPR/Cas熱潮）在植物中，2013年，5個獨立的

30、研究小組證實二元件系統(tǒng)在真核生物（人、鼠、斑馬魚）中具備功能性，而且攜帶不同序列的多個gRNA能夠同時在不同位點實現(xiàn)高效的多重基因組編輯-說明CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一個簡單、成本低、作用廣的基因編輯工具。2013年8月，5篇報道首次討論了CRISPR/Cas9基因編輯在擬南芥、煙草、水稻中的應用，隨后的研究（2013-2014年）也報道了其在大豆、小麥、玉米、西紅柿等植物中的應用。其中，4個獨立的小組發(fā)現(xiàn)， CRISPR/Cas9系統(tǒng)能在水稻和西紅柿轉化體的第一代就直接引入等位或同源突變，說明其在這兩個物種中尤其高效。此外，在擬南芥、水稻、西紅柿中， Cas9/ gRNA系統(tǒng)誘導的遺傳變

31、化出現(xiàn)在生殖細胞系，在隨后的世代中會正常分離而不會進一步被修飾。2021/3/9302021/3/9312021/3/932植物育種中的應用和建議 傳統(tǒng)的育種依賴于既有的自然遺傳變異，而且需要進一步的回交才能將選擇的目標性狀導入優(yōu)良背景里。因此，自然界中可用的有利變異限制了育種能達到的效果。新的變異可以通過隨機突變獲得，但是需要對大量群體，花費大量時間進行篩選才能鑒定出具有期望表型的突變。 基因編輯可以對優(yōu)良遺傳背景直接進行精準、可預期的修飾，從而加快育種程序，由于可以同時對多性狀進行修飾， CRISPR/Cas9系統(tǒng)尤其有效。2021/3/933NHEJ介導的基因敲除是定點修飾最簡單的應用。

32、如用于剔除降低糧食品質的基因、給予致病菌敏感性、轉換代謝流以獲得有價值的眾產(chǎn)品等.利用寡核苷酸供體序列進行特定核苷酸的精準替換能用于修飾調控農(nóng)藝性狀基因的DNA序列，進而提高作物產(chǎn)量有NHEJ或HR介導的大片段插入，能夠在特定位點引入提高轉錄水平的轉基因，而不影響內源基因的活性。植物育種中的應用和建議2021/3/934位點特異的核酸酶還可進行定向分子性狀疊加。實現(xiàn)將多個目標性狀導入作物中，同時分離的風險較低，這是傳統(tǒng)育種，甚至是轉基因育種都難以做到的。一旦疊加完成，整個的分子序列能通過雜交的方式轉移到其它種質中，因為它是以單位點方式遺傳的。雖然使用位點特異性重組（ site specific

33、 recombination ）也能達到這一目的，但是使用可編程的核酸酶結合精準的NHEJ或HR進行定向整合不會留下與整合方式相關的任何痕跡，如loxP或attB序列。植物育種中的應用和建議2021/3/935雖然歐洲管理機構判定轉基因作物的焦點是產(chǎn)生過程而非產(chǎn)品本身，由基因編輯技術如 CRISPR/Cas9系統(tǒng)，切除幾個核苷酸而產(chǎn)生變化的植物仍有希望和信心不被劃定為轉基因作物 使用可編程的核酸酶有幾種方法可以產(chǎn)生不含轉基因成分的突變植物。包括使用農(nóng)桿菌滲入法或病毒載體瞬時表達核酸酶組件以功能性gRNA和Cas9蛋白形式，或者將在不同染色體上的gRNA和Cas9基因合并在一起的形式，直接運送到目標位點，這樣就可以通過遺傳分離被移除。 雖然如 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性需要進一步研究，但是已經(jīng)確定其脫靶效應遠遠低于化學或物理誘導突變。 當然，位點特異性核酸酶的應用解決了轉基因的一個