米曲霉的培養(yǎng)及蛋白質(zhì)的分析

1、整理課件米曲霉的培養(yǎng)及蛋白質(zhì)的分析米曲霉的培養(yǎng)及蛋白質(zhì)的分析 整理課件一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膎通過(guò)固態(tài)三角瓶培養(yǎng)曲霉，掌握固態(tài)培養(yǎng)微生物原理和技術(shù)，并掌握蛋白酶活性的分析方法整理課件二、實(shí)驗(yàn)原理、過(guò)程和方法二、實(shí)驗(yàn)原理、過(guò)程和方法 1、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)原理2、實(shí)驗(yàn)過(guò)程、實(shí)驗(yàn)過(guò)程3、實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)方法整理課件1、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)原理n固態(tài)培養(yǎng)微生物，是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)的特色之一，具有悠久的歷史。在黃酒、白酒、醬油、醬類(lèi)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。n固態(tài)培養(yǎng)方法：（Solid state cultivation）：主要有散曲法和塊曲法。部分黃酒用曲，紅曲及醬油米曲霉培養(yǎng)屬散曲法；而黃酒用曲及白酒用曲一般采用塊曲

2、法。n固態(tài)制曲設(shè)備：實(shí)驗(yàn)室主要采用三角瓶或茄子瓶培養(yǎng)；種子擴(kuò)大培養(yǎng)可將蒸熟的物料置于竹匾中，接種后在溫度和濕度都有控制的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；工業(yè)上目前主要是厚層通風(fēng)池制曲，轉(zhuǎn)式圓盤(pán)式固態(tài)培養(yǎng)裝置正在試驗(yàn)推廣之中；日本、臺(tái)灣已大規(guī)?；?，機(jī)械化。整理課件n固態(tài)培養(yǎng)微生物：主要用于霉菌的培養(yǎng)，但細(xì)菌和酵母菌也可采用此法。其主要優(yōu)點(diǎn)是節(jié)能，無(wú)廢水污染。單位體積的生產(chǎn)效率較高。我國(guó)廣泛使用的厚層通風(fēng)固態(tài)法培養(yǎng)法，空氣一般不經(jīng)過(guò)除菌處理，培養(yǎng)環(huán)境也無(wú)法做到嚴(yán)格無(wú)菌。故染菌問(wèn)題未得到根本解決。n本實(shí)驗(yàn)所用的米曲霉的生長(zhǎng)特性及菌落特征： 米曲霉（Aspergillus）屬曲霉菌（Aspergillus）。菌落初

3、為白色，黃色，繼而變?yōu)辄S褐色至淡綠褐色，反面無(wú)色。整理課件2、實(shí)驗(yàn)過(guò)程、實(shí)驗(yàn)過(guò)程n米曲霉菌種的純化（單菌落分離），制成斜面，將斜面菌種接入250ml三角瓶培養(yǎng)成種曲，再將種曲擴(kuò)大培養(yǎng)（500ml）三角瓶。米曲霉培養(yǎng)物經(jīng)水溶液萃取，制得粗酶制劑，取粗酶制劑進(jìn)行蛋白酶活力的測(cè)定。 整理課件3、實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)方法米曲霉的培養(yǎng)米曲霉的培養(yǎng)n本實(shí)驗(yàn)分為斜面種子培養(yǎng)及三角瓶培養(yǎng)兩個(gè)階段。三角瓶培養(yǎng)物在工廠常作為一級(jí)種子。n試管斜面培養(yǎng)基： 豆餅浸出汁：100克豆餅粉，加水500ml，浸泡4小時(shí)，煮沸3-4小時(shí)，紗布自然過(guò)濾，取液，調(diào)整至5波美度。每100 ml 豆汁中加入可溶性淀粉2克，磷酸二氫鉀0.1克

4、，硫酸鎂0.05克，硫酸銨0.05克，瓊脂2克，自然pH。n或采用馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯200g 葡萄糖20g 瓊脂15-20g 加水至1000ml pH自然。整理課件米曲霉的培養(yǎng)基1：麩皮80g，面粉（或小麥粉）20g，水80ml；米曲霉的培養(yǎng)基2、豆粕粉10g，麩皮90g，水110ml；n裝料厚度：1cm左右；n滅菌：120，30-60min； 三角瓶培養(yǎng)基制備：三角瓶培養(yǎng)基制備：整理課件接種及米曲霉的培養(yǎng)條件：n米曲霉固態(tài)培養(yǎng)主要控制條件：溫度、濕度，裝料量，基質(zhì)水分含量。n固態(tài)培養(yǎng)前，原料的蒸熟及滅菌是同時(shí)進(jìn)行的。實(shí)驗(yàn)室一般是在高壓滅菌鍋中進(jìn)行；但在工廠，則原料的煮熟和滅菌與發(fā)酵分別在不

5、同的設(shè)備中進(jìn)行。這點(diǎn)與液態(tài)發(fā)酵是不同的。28-30，培養(yǎng)20小時(shí)后，菌絲應(yīng)布滿(mǎn)培養(yǎng)基，第一次搖瓶，使培養(yǎng)基松散，每隔8小時(shí)檢查一次，并搖瓶。培養(yǎng)時(shí)間一般為48-70小時(shí)。整理課件三、實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備和材料實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備和材料 n恒溫培養(yǎng)箱或固態(tài)培養(yǎng)室，負(fù)壓式超凈工作臺(tái)，顯微鏡，計(jì)數(shù)器，水浴鍋，分光光度計(jì)，試管，茄子瓶，平板及500ml三角瓶等。n米曲霉菌種（醬油生產(chǎn)用米曲霉）整理課件四、實(shí)驗(yàn)分析項(xiàng)目和方法四、實(shí)驗(yàn)分析項(xiàng)目和方法 1、 米曲霉培養(yǎng)效果測(cè)定：n米曲霉孢子計(jì)數(shù)（顯微鏡觀察）；通常每克曲（干基）孢子數(shù)可達(dá)100億以上； 整理課件2、干物質(zhì)失重的測(cè)定干重失重發(fā)酵前干重發(fā)酵后干重干重失重發(fā)酵

6、前干重發(fā)酵后干重整理課件3、米曲霉蛋白酶活力的測(cè)定3.1 3.1 原理原理（1 1）、福林試劑在）、福林試劑在堿性堿性情況下極不穩(wěn)定，可被情況下極不穩(wěn)定，可被酚類(lèi)酚類(lèi)化合物還化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)。原而呈藍(lán)色反應(yīng)。（2 2）、蛋白質(zhì)分子中含有具有酚基的氨基酸）、蛋白質(zhì)分子中含有具有酚基的氨基酸( (酪氨酸、色氨酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等酸及苯丙氦酸等) )。（3 3）、以）、以酪蛋白酪蛋白為底物，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一定時(shí)間后，加為底物，同酶液反應(yīng)，經(jīng)一定時(shí)間后，加三三氯醋酸氯醋酸，終止酶反應(yīng)，并使殘余的酪蛋白質(zhì)沉淀，同水解產(chǎn)，終止酶反應(yīng)，并使殘余的酪蛋白質(zhì)沉淀，同水解產(chǎn)物分開(kāi)，經(jīng)過(guò)濾后取物分開(kāi)，經(jīng)

7、過(guò)濾后取濾液濾液。用。用碳酸鈉堿化碳酸鈉堿化，再加入，再加入福林試劑福林試劑使之發(fā)色，用分光光度計(jì)測(cè)定。使之發(fā)色，用分光光度計(jì)測(cè)定。（4 4）、藍(lán)色反應(yīng)的強(qiáng)弱，同蛋白水解產(chǎn)物的多少成正比而水）、藍(lán)色反應(yīng)的強(qiáng)弱，同蛋白水解產(chǎn)物的多少成正比而水解產(chǎn)物的量又是同酶活力成正比例關(guān)系。因此，根據(jù)藍(lán)色反解產(chǎn)物的量又是同酶活力成正比例關(guān)系。因此，根據(jù)藍(lán)色反應(yīng)的強(qiáng)弱就可推測(cè)蛋白酶的活力。應(yīng)的強(qiáng)弱就可推測(cè)蛋白酶的活力。 3.2 3.2 試劑試劑（1 1）福林試劑）福林試劑 于于20002000mlml磨口回流裝置內(nèi)加入磨口回流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉鎢酸鈉( (NaNa2 2WOWO4 42H2H2 2O)100gO)

8、100g，鉬酸鈉鉬酸鈉( (NaMoONaMoO4 42H2H2 2O)O)25g25g，水水700700mlml，85%85%磷酸磷酸5050m1m1，濃鹽酸濃鹽酸10001000mlml，文火回流文火回流1010h h加入加入硫酸鋰硫酸鋰( (LiLi2 2SOSO4 4)150g)150g，蒸溜水蒸溜水5050m1m1，混勻取去冷凝器，加入幾滴混勻取去冷凝器，加入幾滴液體溴液體溴，再煮沸，再煮沸l(wèi)5minl5min，以以驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色呈黃色而非綠色。若溶液仍有。若溶液仍有綠色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷卻后，定溶至綠色，需再滴加溴液

9、。再煮沸除去之。冷卻后，定溶至10001000mlml。過(guò)濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時(shí)加過(guò)濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時(shí)加2 2倍蒸餾倍蒸餾水稀釋水稀釋?zhuān)闯上♂尩母Ａ衷噭?。，即成稀釋的福林試劑?（2 2）0.4mol/L0.4mol/L三氯醋酸三氯醋酸( (TCA)TCA)溶液溶液 稱(chēng)取三氯醋酸稱(chēng)取三氯醋酸65.465.4g g，定容至定容至10001000mlml。（3 3）0.4mol/L0.4mol/L碳酸鈉溶液碳酸鈉溶液 稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉( (NaNa2 2COCO3 3)42.4g)42.4g，定容至定容至10001000m1m1。（4 4）0.05mol/

10、L pH2.5 0.05mol/L pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸鈉緩沖液乳酸鈉緩沖液 A A液：液：稱(chēng)取稱(chēng)取10.610.6g80-90%g80-90%乳酸加蒸餾水定容至乳酸加蒸餾水定容至10001000mlml。 B B液：液：稱(chēng)取稱(chēng)取1616克克70%70%乳酸鈉加蒸餾水定容至乳酸鈉加蒸餾水定容至10001000mlml。 取取A A液液1616mlml與與B B液液1 1mlml稀釋稀釋1 1倍即成倍即成0.050.05mol/L pH2.5 mol/L pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸鈉緩沖液。乳酸鈉緩沖液。（5 5）2%2%酪蛋白溶液酪蛋白溶液 稱(chēng)取干酪素稱(chēng)取干酪素2 2g g加入加

11、入0.10.1mol/Lmol/L氫氧化鈉氫氧化鈉2020mlml在水浴中加在水浴中加熱使溶解熱使溶解( (必要時(shí)用小火加熱煮沸必要時(shí)用小火加熱煮沸) )，然后用，然后用pH2.5pH2.5乳酸乳酸- -乳乳酸鈉緩沖液定容至酸鈉緩沖液定容至10001000mlml即成。即成。 配制后應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存。否則極易繁殖配制后應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存。否則極易繁殖細(xì)菌，引起變質(zhì)。細(xì)菌，引起變質(zhì)。 配制酪蛋白溶液定容時(shí)，若泡沫過(guò)多，則可加配制酪蛋白溶液定容時(shí)，若泡沫過(guò)多，則可加1212滴酒滴酒精消泡。精消泡。33503350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，應(yīng)加弄乳酸酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，應(yīng)

12、加弄乳酸2323滴濕潤(rùn)。滴濕潤(rùn)。（6 6）100100g/m1g/m1酪氨酸溶液酪氨酸溶液 精確稱(chēng)取在精確稱(chēng)取在l05烘箱中烘至恒重的酪氨酸烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步逐步加入加入0.1mol/L鹽酸鹽酸(HCl)使溶解，加蒸溜水定容至使溶解，加蒸溜水定容至100m1，其濃度為其濃度為1000g/m1。 再吸取此液再吸取此液10ml以蒸餾水定容至以蒸餾水定容至100ml即配成即配成100g/m1酪氨酸镕液酪氨酸镕液 此溶液配成后也應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存，以免繁此溶液配成后也應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存，以免繁殖細(xì)菌而變質(zhì)。殖細(xì)菌而變質(zhì)。 3 3.3 .3 操作步驟操作步驟3.3.1

13、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 （1 1）按表配制各種不同濃度的酪氨酸溶液）按表配制各種不同濃度的酪氨酸溶液(2)(2)測(cè)定步驟測(cè)定步驟 另取另取6 6支試管按上表編號(hào)分別吸取不同濃度的酪氨支試管按上表編號(hào)分別吸取不同濃度的酪氨酸酸1 1mlml，各加入各加入0.40.4mo1/Lmo1/L碳酸鈉碳酸鈉5 5m1m1，再加入已稀釋的福再加入已稀釋的福林試劑林試劑1 1m1m1。 搖勻置于水浴鍋中，搖勻置于水浴鍋中，4040保溫發(fā)色保溫發(fā)色2020minmin，在波長(zhǎng)在波長(zhǎng)660660nmnm處測(cè)定吸光度。一般測(cè)處測(cè)定吸光度。一般測(cè)3 3次，取平均值次，取平均值 以吸光度為縱座標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫

14、座標(biāo)，繪制以吸光度為縱座標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫座標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 準(zhǔn)確稱(chēng)取蛋白酶固態(tài)發(fā)酵的濕曲準(zhǔn)確稱(chēng)取蛋白酶固態(tài)發(fā)酵的濕曲2 2g g，用用10102020mlml蒸蒸餾水，餾水，3030浸提浸提半小時(shí)，用濾紙半小時(shí)，用濾紙過(guò)濾過(guò)濾。將濾液稀釋一定。將濾液稀釋一定倍數(shù)倍數(shù)( (使其測(cè)定光密度在使其測(cè)定光密度在0.20.20.40.4范圍內(nèi)為宜范圍內(nèi)為宜) )。3.3.2 3.3.2 酶液的制備酶液的制備 取四支試管，分別加入取四支試管，分別加入1 1mlml稀釋酶液，其中一支為空白稀釋酶液，其中一支為空白管，三支為平行試驗(yàn)管，置入管，三支為平行試驗(yàn)管，置入4040水浴中預(yù)熱水浴中

15、預(yù)熱3 35 5minmin。 在三支平行試驗(yàn)管中分別加入在三支平行試驗(yàn)管中分別加入1 1ml 2% ml 2% 酪蛋白溶液，準(zhǔn)酪蛋白溶液，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)保溫確計(jì)時(shí)保溫1010minmin。立即加入立即加入2 2ml 0.4Mml 0.4M三氯乙酸溶液，三氯乙酸溶液，l5minl5min后用濾紙過(guò)濾。分別吸取后用濾紙過(guò)濾。分別吸取1 1mlml清液，加清液，加5 5ml 0.4Mml 0.4M碳酸碳酸鈉溶液，最后加入鈉溶液，最后加入1 1mlml福林福林- -酚試劑，搖勻，于酚試劑，搖勻，于4040水浴中水浴中顯色顯色2020minmin。 空白管中先加入空白管中先加入2 2ml 0.4Mml 0.

16、4M三氯乙酸溶液，再加三氯乙酸溶液，再加l ml 2%l ml 2%酪蛋白溶液，酪蛋白溶液，1515minmin后用濾紙過(guò)濾。以下操作與平行試驗(yàn)管后用濾紙過(guò)濾。以下操作與平行試驗(yàn)管相同。相同。 以空白管為對(duì)照，在以空白管為對(duì)照，在680納米納米波長(zhǎng)下測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)光密度光密度，取其平，取其平均值。均值。 3.3.3 3.3.3 測(cè)定測(cè)定 蛋白酶活力單位定義：蛋白酶活力單位定義：在在4040，pH2.5pH2.5下，每分鐘水解下，每分鐘水解酪蛋白釋放酪蛋白釋放1 1微克酪氨酸的酶量定義為微克酪氨酸的酶量定義為1 1個(gè)蛋白酶單位。個(gè)蛋白酶單位。 式中：式中： K K：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中ODOD值為值為1 1所相當(dāng)?shù)睦野彼岬奈⒖藬?shù)；所相當(dāng)?shù)睦野彼岬奈⒖藬?shù)； OD OD：平行試驗(yàn)管的平均光密度；平行試驗(yàn)管的平均光密度； 4 4：試管中反應(yīng)液總體積：試管中反應(yīng)液總體積( (毫升毫升) )； 10 10：反應(yīng)：反應(yīng)1010分鐘；分鐘； N N：稀釋倍數(shù)；稀釋倍數(shù)；W W：曲的稱(chēng)取量曲的稱(chēng)取量( (克克) )3.3.4 3.3.4 計(jì)算計(jì)算 （1 1）對(duì)于同一臺(tái)分光光度計(jì)與同一批福林）對(duì)于同一臺(tái)分光光度計(jì)與同一批福林- -酚試劑，酚試劑，其工作曲線(xiàn)其工作曲