第三節(jié)免疫檢測技術(shù)的基本原理

1、 抗原、抗體反應(yīng)的原理，利用已知的抗原檢測未知的抗體或利用已知的抗體檢測未知的抗原 . 將免疫反應(yīng)與現(xiàn)代測試技術(shù)結(jié)合 超微量的檢測 高度的靈敏性 高度的特異性 常用的診斷技術(shù) 血凝試驗 酶聯(lián)免疫吸附試驗 膠體金免疫技術(shù) 放射免疫分析技術(shù)概念：顆粒性抗原概念：顆粒性抗原( (細菌、紅細胞等細菌、紅細胞等) )與相應(yīng)抗與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，體結(jié)合，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(yīng)。稱為凝集反應(yīng)。1.1.直接凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)抗原與抗體直接混合作用，出現(xiàn)凝集為陽抗原與抗體直接混合作用，出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。性結(jié)果。玻片直接凝集法：定性試驗玻片直接凝集法：定性

2、試驗試管直接凝集法：半定量試驗試管直接凝集法：半定量試驗+ 玻片直接凝集試驗玻片直接凝集試驗1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/512 先將可溶性抗原或抗體吸附在顆粒載體上先將可溶性抗原或抗體吸附在顆粒載體上( (如如RBC, RBC, 乳膠顆粒乳膠顆粒) )，再與相應(yīng)抗體或抗，再與相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)，出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。原反應(yīng)，出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。 臨床常用的有間接血凝試驗、乳膠凝集試臨床常用的有間接血凝試驗、乳膠凝集試驗等。驗等。+待檢樣品待檢樣品抗原吸附血球抗原吸附血球或乳膠顆粒或乳膠顆粒反應(yīng)凝集物反應(yīng)凝集物 先將待檢抗原與已知的抗體反應(yīng)，再加入用已知先將待

3、檢抗原與已知的抗體反應(yīng)，再加入用已知抗原吸附的載體顆粒，不出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果?？乖降妮d體顆粒，不出現(xiàn)凝集為陽性結(jié)果。例：乳膠凝集抑制試驗檢測例：乳膠凝集抑制試驗檢測HCG (HCG (妊娠診斷妊娠診斷) )步驟步驟1 1：將已知抗體：將已知抗體與待檢標本混勻與待檢標本混勻 步驟步驟2 2：加入抗原吸：加入抗原吸附的乳膠顆?；靹蚋降娜槟z顆粒混勻抗 原 吸 附抗 原 吸 附乳膠顆粒乳膠顆粒結(jié)果判斷：結(jié)果判斷：不 凝 集 為不 凝 集 為陽性結(jié)果陽性結(jié)果已知抗體已知抗體待檢標本待檢標本2.沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 概念：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出概念：可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后出現(xiàn)沉淀物稱沉淀反應(yīng)?，F(xiàn)

4、沉淀物稱沉淀反應(yīng)。類型：類型：單向免疫擴散單向免疫擴散免疫比濁法免疫比濁法雙向免疫擴散雙向免疫擴散對流免疫電泳對流免疫電泳 單向瓊脂擴散試驗單向瓊脂擴散試驗 雙向瓊脂擴散試驗雙向瓊脂擴散試驗 對流免疫電泳對流免疫電泳測吸光度測吸光度計算抗原計算抗原或抗體的或抗體的含量含量抗體抗體抗原抗原免疫復(fù)合物的免疫復(fù)合物的濃度與透射光濃度與透射光的衰減呈正相的衰減呈正相關(guān)關(guān)免疫比濁法原理免疫比濁法原理3.中和反應(yīng)中和反應(yīng) 如抗如抗“O”試驗試驗4.免疫標記技術(shù)免疫標記技術(shù) 概念：用熒光素、酶、同位素等概念：用熒光素、酶、同位素等標記抗體或抗原用以測定相應(yīng)抗原或標記抗體或抗原用以測定相應(yīng)抗原或抗體的技術(shù)稱為

5、免疫標記技術(shù)。常用抗體的技術(shù)稱為免疫標記技術(shù)。常用方法有免疫熒光技術(shù)、酶免疫技術(shù)、方法有免疫熒光技術(shù)、酶免疫技術(shù)、放射免疫檢測技術(shù)等。放射免疫檢測技術(shù)等。 特點：敏感、特異、快速，能定特點：敏感、特異、快速，能定性、定量、定位。性、定量、定位。 酶免疫標記技術(shù) 熒光免疫分析技術(shù) 放射免疫分析技術(shù) 免疫金標記技術(shù) 1971年瑞典學者年瑞典學者Engvail和和Perlmann,荷蘭學者荷蘭學者Van Weerman和和Schuurs分分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法附測定法

6、(enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA)酶及其底物酶及其底物 酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, , 半抗原半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISAELISA成敗成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物放大作用，但不同的酶選用不同的底物 ，將得到不同的顏色反應(yīng)將得到不同的顏色反應(yīng). .酶酶 底底 物物顯色顯色反應(yīng)反應(yīng) 測定波長測定波長 辣根過氧化物酶辣根過氧化物

7、酶 鄰苯二胺鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺鄰聯(lián)苯甲胺2,2-2,2-連胺基連胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 橘紅色橘紅色黃色黃色棕色棕色蘭色蘭色藍綠色藍綠色492492460460449449425425642642堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸鹽硝基酚磷酸鹽(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸鹽磷酸鹽+ +重氮鹽重氮鹽 黃色黃色紅色紅色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +

8、噻唑蘭噻唑蘭 黃色黃色深藍色深藍色 405405420 420 -半乳糖半乳糖苷酶苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 熒光熒光黃色黃色 360,450360,450420420 2、標記方法 戊二醛交聯(lián)法 過碘酸鹽氧化法戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法 (一步法）一步法）抗體-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗體酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶戊二醛交聯(lián)法（二步法

9、）戊二醛交聯(lián)法（二步法）COH-（CH2）3-COH + NH2-酶抗體-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶過碘酸鹽氧化法過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+ NH2抗體OOONN抗體抗體H2ON抗體NaBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)標記免疫物的分離與鑒定標記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離酶 方法：鹽析、柱層析2、鑒定 抗體活性 酶活性 標記物純度ELISAELISA的種類和變化的種類和變化 （一）雙抗體夾心法（一）雙抗體夾心法（二）間接法（二）間接法（三）競爭法（三）競爭法 （四）

10、雙位點一步法（四）雙位點一步法（五）捕獲法測（五）捕獲法測IgMIgM抗體抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISAELISA （一）雙抗體夾心法（一）雙抗體夾心法此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原獲得待分析物的未標定抗體獲得待分析物的未標定抗體將特異性抗體與固相將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體載體連接形成固相抗體 洗滌除去未結(jié)合的洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)抗體及雜質(zhì) 加入封閉蛋白溶液以封閉載體加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點表面殘留的蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加受檢標本（

11、抗原）形成加受檢標本（抗原）形成固相抗體抗原復(fù)合物固相抗體抗原復(fù)合物 洗滌除去其他洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)未結(jié)合的物質(zhì) 加酶標抗體生成加酶標抗體生成抗體抗體待測抗原待測抗原酶標記抗體酶標記抗體的復(fù)合物的復(fù)合物 徹底洗滌徹底洗滌未結(jié)合的未結(jié)合的 酶標抗體酶標抗體 加底物進行加底物進行酶催化反應(yīng)酶催化反應(yīng) 根據(jù)顏色反應(yīng)的根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原程度進行該抗原的定性或定量測定的定性或定量測定 間接法是檢間接法是檢測抗體最常用的方測抗體最常用的方法，其原理為利用法，其原理為利用酶標記的抗抗體以酶標記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合檢測已與固相結(jié)合的受檢的受檢抗體抗體，故稱，故稱為間接法。為間接法。（二）

12、間接法（二）間接法 酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA-間接法間接法)包被固相載體包被固相載體: : 用已知抗原包被用已知抗原包被固相載體固相載體 加待檢標本加待檢標本: : 使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì) 加酶標抗抗體加酶標抗抗體: :與固相載體上抗原抗體與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標抗抗體未結(jié)合的酶標抗抗體 加底物加底物顯色顯色 根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量測定該抗原的定性或定量測定（三）競爭法（三）競爭法 此法可用于抗原和半抗原的定此法可用于

13、抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體量測定，也可用于測定抗體 。用已知特異性用已知特異性抗體包被抗體包被固相載體固相載體 測定管加待測抗原和測定管加待測抗原和一定量的酶標抗原使二者與一定量的酶標抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合固相抗體競爭結(jié)合 對照管只加一定量酶標抗原對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結(jié)合與固相抗體直接結(jié)合 分別洗滌分別洗滌除去未結(jié)合除去未結(jié)合的成分的成分 加底物顯色加底物顯色分別測定兩管的吸光度值，分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比， 計算標本中待測抗原含量計算標本中待測抗原含量 對照管由于只加酶標抗原，與對照管由于只加

14、酶標抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色固相抗體充分結(jié)合，故分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)和酶標抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結(jié)合，使固抑制酶標抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標抗原量減少。因此，相上結(jié)合的酶標抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。加入底物后顯色反應(yīng)較弱。 飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中鹽酸克倫特羅的測定 飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素， 簡曲霉毒素簡曲霉毒素 ）

15、飼料中有害微生物的快速篩檢飼料中有害微生物的快速篩檢 （如沙門氏（如沙門氏菌菌 ） 甲胺磷殘留分析甲胺磷殘留分析 甲基對硫磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析 呋喃丹殘留分析呋喃丹殘留分析 ELISA在飼料安全檢測中的應(yīng)用在飼料安全檢測中的應(yīng)用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測用于農(nóng)藥殘留的檢測河豚毒素河豚毒素 植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素 苯并芘苯并芘 主要有除草劑與殺蟲劑兩大類主要有除草劑與殺蟲劑兩大類 例如殺暝松（例如殺暝松（ FN FN ）、）、 甲氟磷酸異已酶（甲氟磷酸異已酶（ SOMAN SOMAN ）、）、 草不綠（草不綠（ Alachor Alachor

16、）、）、 西維因（西維因（ Carbaryl Carbaryl ）、）、 多菌靈及克菌丹（多菌靈及克菌丹（ Captan Captan ）等）等。農(nóng)藥的檢測農(nóng)藥的檢測： 大腸桿菌檢測 沙門氏菌檢測 單增李斯特菌 金黃色葡萄球菌 轉(zhuǎn)基因成份的檢測：如轉(zhuǎn)基因玉米中轉(zhuǎn)基因成份的檢測：如轉(zhuǎn)基因玉米中中的中的cry9e蛋白蛋白轉(zhuǎn)基因大豆中的轉(zhuǎn)基因大豆中的CP4 EPSPS蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)肉制品的摻假檢測：肉制品的摻假檢測： 以辣根過氧化物酶標記不同動物肌肉和血清球蛋以辣根過氧化物酶標記不同動物肌肉和血清球蛋A抗血清檢查牛肉、馬肉、豬肉、羊肉和駝肉檢測抗血清檢查牛肉、馬肉、豬肉、羊肉和駝肉檢測14種種畜禽熟肉

17、制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和馬肉等，在畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和馬肉等，在摻假率為摻假率為1%時即可檢出時即可檢出食品其他檢測食品其他檢測：用熒光素標記抗原或抗體，再與標本中抗體或抗用熒光素標記抗原或抗體，再與標本中抗體或抗原反應(yīng)，然后在熒光顯微鏡下觀察，形成的原反應(yīng)，然后在熒光顯微鏡下觀察，形成的ICIC可可散發(fā)出熒光，對標本中的抗原或抗體進行測定和散發(fā)出熒光，對標本中的抗原或抗體進行測定和定位。定位。常用的熒光素常用的熒光素異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素(FITC)(FITC)、藻紅蛋白、藻紅蛋白(PE)(PE)等。等。常用的方法常用的方法直接熒光法直接熒光法間接熒光法間接熒光法

18、免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)Ag熒光素標記的熒光素標記的特異性抗體特異性抗體組織切片組織切片Ag熒光素標記熒光素標記的抗抗體的抗抗體組織切片組織切片待測抗體待測抗體熒光顯微鏡熒光顯微鏡熒光顯微鏡使用原理熒光顯微鏡使用原理激發(fā)濾片（BG）吸收濾片（OG）標本FITC吸收光峰值：490-495nm FITC發(fā)射光峰值：520-530nmBG：325-500 OG：410-650 免疫金標記技術(shù)免疫金標記技術(shù)(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑的特性，在金標蛋白結(jié)合處，在顯微

19、鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應(yīng)的配體處大量聚褐色顆粒，當這些標記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測。這一反應(yīng)也可以通性或半定量的快速免疫檢測。這一反應(yīng)也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色（immunogold silver staining，IGSS）。膠體金膠體金（colloidal gold）的制備一般采用的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的

20、金壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液，也稱金溶膠原子，形成金顆粒懸液，也稱金溶膠（gold solution）。膠體金粒徑膠體金粒徑1%1%檸檬酸鈉加入量檸檬酸鈉加入量膠體金特性膠體金特性（nm)nm) （ml)ml)* *呈色呈色lmax(nm)lmax(nm)16162.00 2.00 橙色橙色51851824.524.51.50 1.50 橙紅色橙紅色52252241411.00 1.00 紅色紅色52552571.571.50.70 0.70 紫色紫色535535* *還原還原10

21、0 ml0.01%HAuCl4 100 ml0.01%HAuCl4 所需量所需量優(yōu)優(yōu) 質(zhì)質(zhì)劣劣 質(zhì)質(zhì)其原理與層析法相類同，中心圓點為一株單抗，邊上小點為抗鼠二抗。先將待測樣品滴在其中，若有抗原即被結(jié)合在中心圓點，洗去未結(jié)合抗原，再滴加金標另一株單抗，若有抗原則形成金-Ab-Ag薄膜的紅色斑點，而邊上是金-Ab-Ab2薄膜的質(zhì)控點，是為金標二步法。ABLATERAL FLOW TEST STRIP OF VEDALAB30 將金標的一株單抗吸附于下端的玻璃纖維紙上，浸入尿液，此金標單抗即被溶解，并隨尿液上行，若尿中有相應(yīng)抗原，既形成Ag-Ab-金復(fù)合物，當上行至中段醋酸纖維薄膜，即與下端的另一株

22、單抗結(jié)合并被固定下來，顯示陽性結(jié)果。其上方還有一條抗鼠二抗，待紅色金標單抗上行此處即被固定下來，作為金標單抗質(zhì)控的提示。此種方法稱金標一步法。 兔抗鼠兔抗鼠IgG鼠抗鼠抗HCG單抗單抗金標鼠抗金標鼠抗HCG單抗單抗尿液浸濕標志線尿液浸濕標志線 手持端手持端斑點金免疫層析試驗（一）斑點金免疫層析試驗（一）斑點金免疫層析試驗（二）斑點金免疫層析試驗（二）尿樣尿樣陽性陽性弱陽性弱陽性陰性陰性無效無效質(zhì)控線質(zhì)控線測試線測試線免疫層析試驗競爭法測小分子抗原原理圖 陰性陰性陽性陽性無效無效 陽性陽性陰性陰性無效無效IFAIFAICAICA試劑形式試劑形式滲濾裝置及附滲濾裝置及附加試劑加試劑試劑條試劑條試劑

23、保存試劑保存4 48 68 6個月個月室溫一年室溫一年操作步驟操作步驟3 35 51 1觀察時間觀察時間3 min3 min3 320 min20 min陽性反應(yīng)顏色陽性反應(yīng)顏色濃度濃度操作結(jié)束顏色操作結(jié)束顏色不變不變顏色逐漸加深顏色逐漸加深I(lǐng)FA IFA 穿流（穿流（FLOW THROUGHFLOW THROUGH）ICA ICA 橫流（橫流（LATERAL FLOWLATERAL FLOW） 1、 羅立新, 繆瓏, 潘力, 等. 快速檢測產(chǎn)單核李斯特菌免疫膠體金層析法的研究J. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2006, 16(2): 154-156. 2、 賴衛(wèi)華, 熊勇華, 陳高明, 等. 應(yīng)用膠

24、體金試紙條快速檢測赭曲霉毒素A的研究J. 食品科學, 2005, 26(5): 204-207. 3、 諶志強, 段惠莉, 王新為, 等. 大腸埃希菌O157:H7的膠體金免疫滲濾法檢測J. 中國公共衛(wèi)生, 2005, 21(4): 705-706. 4、 謝昭聰, 宋志強, 呂敬章, 等. 應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測水產(chǎn)品中霍亂弧菌的研究J. 中國國境衛(wèi)生檢疫雜志, 2005, 28(3): 163-165. 5、 王中民, 李君文, 王新為, 等. 免疫金滲濾試驗檢測食品中沙門氏菌的研究J. 微生物學免疫學進展, 2001, 29(4): 45-47. 6、劉永德, 汪毅, 陳禹雷, 免疫金探針快速檢測禽流感病毒研究J. 上海交通大學學報: 農(nóng)業(yè)科學版, 2005, 23(3): 321-324.斑點金免疫滲濾試驗斑點金免疫滲濾試驗ADCB陰性（未懷孕）陰性（未懷孕）陽性（懷孕）陽性（懷孕）加尿樣加尿樣除去濾器除去濾器加膠體金標記抗體加膠體金標記抗體加洗滌液加洗滌液結(jié)果判定結(jié)果判定免疫印跡法圖解免疫印跡法圖解SDS裂解裂解病毒病毒聚丙酰胺凝膠電泳聚丙酰胺凝膠電泳-+