醬油風(fēng)味研究進(jìn)展

1、中國釀造2009年第7期總第208期醬油的風(fēng)味是“色、香、味、體”的綜合體現(xiàn),即醬油的色澤、香氣、滋味和體態(tài),其中香氣是決定醬油風(fēng)味的重要因素。在醬油的高鹽稀態(tài)發(fā)酵過程中,一般都要添加耐鹽產(chǎn)香酵母1,從而改善醬油的風(fēng)味提高醬油質(zhì)量。較常見的耐鹽產(chǎn)香酵母菌有S 酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii 、T 酵母菌(Torulopsis versatilis 和C 酵母菌(Candida etchell -sii2。目前醬油中已檢出的風(fēng)味成分近300種。醬油的風(fēng)味物質(zhì)按包含醇類、酯類、酸類、醛類及縮醛類、酚類、呋喃酮類和含硫化合物等。某些風(fēng)味成分形成途徑已被了解,還有一些風(fēng)味成分

2、形成途徑尚待繼續(xù)研究。風(fēng)味成分的組成與原料品種、原料配比、菌種、生產(chǎn)工藝及技術(shù)管理等有關(guān)3。了解醬油風(fēng)味物質(zhì)的種類及其產(chǎn)生的機(jī)制對于如何改造耐鹽酵母從而改善醬油風(fēng)味提高醬油質(zhì)量至關(guān)重要。1醬油風(fēng)味物質(zhì)的種類及形成機(jī)制1.1醇類醬油風(fēng)味成分中含量最多的是醇類,并以乙醇為主。乙醇是由S 酵母和糖類共同作用產(chǎn)生的,廣泛存在于整個發(fā)酵過程中。糖在S 酵母的作用下形成乙醇,但是因為醬油高鹽稀態(tài)發(fā)酵后期的鹽水發(fā)酵中鹽的濃度很高,導(dǎo)致由S 酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的糖類物質(zhì)種類受到限制4。在鹽水發(fā)酵過程中,S 酵母只能利用葡萄糖卻不能利用麥芽糖。如果在無鹽的條件下,S 酵母就能利用麥芽糖。與S 酵母不同,在鹽水發(fā)酵

3、過程中T 酵母能夠利用麥芽糖。在乙醇發(fā)酵過程中最關(guān)鍵的酶是由ADH1基因編碼的乙醇脫氫酶。醬油中的高級醇主要有丙醇、丁醇、戊醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇等。S 酵母和釀酒酵母醇類表現(xiàn)出相似的合成途徑5。高級醇的產(chǎn)生直接與氨基酸代謝相關(guān),即氨基酸脫氨基、脫羧基后生成少一個碳原子的醇類。高級醇可以通過埃爾利希(Ehrlich 途徑由相關(guān)的支鏈氨基酸產(chǎn)生,這包括一個轉(zhuǎn)氨反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的-酮酸,一個去羧基反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的醛,然后醛發(fā)生還原反應(yīng)產(chǎn)生醇類。此外,-酮酸作為關(guān)鍵的中間產(chǎn)物,也可在各自的氨基酸合成途徑中直接合成,并直接轉(zhuǎn)化成高級醇。在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中分別由BAT1和BAT2基因編碼的氨基轉(zhuǎn)移酶是催化

4、支鏈氨基酸代謝的關(guān)鍵酶6。當(dāng)然在S 酵母中,高級醇類可能還存在其他的合成途徑。向S 酵母中加入支鏈的氨基酸導(dǎo)致相應(yīng)的醇類產(chǎn)量增加。此外,醬油中的苯乙醇是具有玫瑰香氣的化合物,它是由T 酵母在發(fā)酵過程中經(jīng)降解,再還原或經(jīng)碳水化合物代謝和氨基酸的生物合成過程這2種途徑而生成。1.2酯類酯類是構(gòu)成醬油風(fēng)味成分的主體,一個酸元和一個醇元即可生成酯。酯類作為基本的香味物質(zhì),可使麥芽酚、苯乙醇等關(guān)鍵風(fēng)味化合物的氣味更醇厚,緩沖醬油中鹽分的咸味。醬油中的酯類有多種,由于發(fā)酵過程中形成的酸類和醇類是多種多樣的,故生成的酯也是多種多樣的。目前,已經(jīng)確認(rèn)醬油中含乙酸乙酯和乳酸乙酯等45種酯類。醬油中高沸點酯類含量

5、較多,而低沸點酯類含量則較少。由ATF1和ATF2基因編碼的乙醇酰基轉(zhuǎn)移酶催化的乙酰輔酶A 和高級醇發(fā)生還原反應(yīng)產(chǎn)生揮發(fā)性酯類7。除此外,由EHT1和EEB1基因編碼的其他酶類對乙酸乙酯的生醬油風(fēng)味研究進(jìn)展侯麗華,宋茜,曹小紅(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津300457摘要:介紹了醬油高鹽稀態(tài)發(fā)酵中,由耐鹽酵母菌產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)的種類及其形成機(jī)制。此外,闡述了改造耐鹽酵母菌從而改善醬油風(fēng)味的遺傳操作方法。關(guān)鍵詞:醬油;耐鹽酵母菌;風(fēng)味物質(zhì)中圖分類號:TS26文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編碼:0254-5071(200907-0001-03Research progress of soy-sauc

6、e flavourHOU Lihua,SONG Qian,CAO Xiaohong(College of Food Engineering &Biotechnology,Tianjin University of Science &Technology,Tianjin 300457,ChinaAbstract:The types and formation mechanisms of flavor components,which were produced by salt-tolerant yeasts during high-salt liquid fermentation

7、 of soy sauce,were introduced.In addition,the genetic manipulation methods of salt-tolerant yeasts were also summarized to improve soy-sauce aroma.Key words:soy sauce;salt-tolerant yeasts;flavor components收稿日期:2009-04-21基金項目:天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目(0703600作者簡介:侯麗華(1976-,女,博士后研究生,研究方向為食品微生物。專論與綜述1··2

8、009No.7Serial No.208China Brewing Forum and Summary成也很重要8。1.3有機(jī)酸類醬油風(fēng)味成分中的有機(jī)酸以乳酸和乙酸為主,乳酸菌利用葡萄糖進(jìn)行乳酸發(fā)酵生成乳酸,某些乳酸菌還可利用五碳糖(阿拉伯糖、木糖發(fā)酵生成乳酸和乙酸。其中,乙酸是由乙醇氧化而成。除此之外,醬油中還含有檸檬酸、琥珀酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸等有機(jī)酸。醬油中的有機(jī)酸類互相起協(xié)同效應(yīng)9,豐富了醬油的風(fēng)味。它們和醬油中的醇類在貯存或烹調(diào)過程中起酯化反應(yīng),會提高醬油的酯香味,同時有機(jī)酸的酸味也可以緩和咸味。1.4醛類醬油中的醛類物質(zhì)有甲醛、乙醛、丙醛、異丁醛、異戊醛、酚醛等。其中代表物質(zhì)

9、是乙醛,呈辛辣刺激性氣味。醛除一部分由發(fā)酵產(chǎn)生的以外,大部分是由氨基酸脫胺、脫羰基生成。微量的醛在醬油香氣中起到調(diào)和作用。加熱醬油會提高其中乙醛和一些小分子醛類的濃度,而這些醛類化合物一般可與醇類、甲硫醇等發(fā)生縮合反應(yīng),產(chǎn)生與本身不同的香氣,使醬油風(fēng)味更復(fù)雜化。1.5酚類醬油中的酚類物質(zhì)以揮發(fā)性酚為主體,特別是烷基苯酚,其是由來自小麥的原料經(jīng)米曲霉作用后再經(jīng)T酵母或C酵母發(fā)酵生成的。其代表性成分是4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-EG和4-乙基愈創(chuàng)苯酚(4-EP。其香氣特點十分明顯、活性強(qiáng),為醬油帶來類似丁香和煙熏的香味,是醬油的一種主要的香氣成分。4-EG是醬油風(fēng)味中有代表性的化合物之一,口感有發(fā)酵醬油

10、特有的滋味,同時它還具有調(diào)節(jié)醬油中咸味的作用,增加了醬油的圓潤感。醬油中含有1mgL2mg/L的4-EG就可以明顯提高醬油的風(fēng)味10。4-EG和4-EP分別來源于4-羧基-3-甲基肉桂酸和-香豆酸。而4-羧基-3-甲基肉桂酸和-香豆酸則來源于醬油生產(chǎn)中的麩皮中11。這個轉(zhuǎn)變過程涉及到脫氨基作用,這也是S酵母無法作到的。1.6其他除了上述特征風(fēng)味物質(zhì)外,醬油中還存在著如4-羥基-2(或5乙基-5(或2-甲基-3(2氫-呋喃酮(HEMF、4-羥基-2,5二乙基-3(2氫-呋喃酮(HDMF、4-羥基-5甲基-3(2氫-呋喃酮(HMMF等呋喃酮類物質(zhì);2,3-二乙基-2-戊烯、苯乙烯等烯類物質(zhì);四氫化

11、萘、甲基萘等萘類物質(zhì)以及部分有機(jī)酸鹽類12。其中,HEMF是一種與醬油關(guān)系最密切的香氣成分,它具有小甜餅干那樣類似焦糖的香氣。在醬油中HEMF 的含量越多越好,它能代表醬油的主體香氣13。同時,HEM 具有抑制食道癌的作用。目前對HEMF形成機(jī)制的研究比較多。五磷酸循環(huán)對HEMF的形成至關(guān)重要。含有7個碳的HEMF是由含5個碳的氨基化合物與由葡萄糖代謝產(chǎn)生的含2個碳的化合物發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生的14。HEMF形成的速率和數(shù)量受酵母菌種類、發(fā)酵液中葡萄糖和氯化鈉濃度的影響。2改造耐鹽酵母菌的遺傳操作方法由醬油風(fēng)味物質(zhì)的種類和形成機(jī)制可知,對耐鹽酵母進(jìn)行改造是改善醬油風(fēng)味的關(guān)鍵。對酵母菌株改造的遺傳操作策

12、略主要包括隨機(jī)誘變、有性重組、代謝工程、進(jìn)化工程和基因組重排等15。2.1隨機(jī)誘變利用誘變劑處理耐鹽酵母菌是改善醬油風(fēng)味的最經(jīng)典方法。常用的誘變劑有亞硝基胍(Nitrosoguanidine, NTG、甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulphonate,EMS等。通過誘變的方法可以篩選得到醬油風(fēng)味明顯改善的菌株。如AOKI T等16篩選得到的突變菌株產(chǎn)生的2苯乙醇是野生型菌株的38倍。2.2有性重組改造酵母菌的首要方法就是將不同基因背景的菌株進(jìn)行雜交。KIM J K17將S酵母菌和T酵母菌進(jìn)行雜交得到的重組菌株使醬油的風(fēng)味得到了明顯改善,同時縮短了發(fā)酵周期。2.3代謝工程代謝工程是

13、在對代謝流量及其控制進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行代謝途徑改造,以最大限度的提高目的代謝產(chǎn)物。從廣義上來講,利用分子生物學(xué)方法對某一代謝途徑進(jìn)行修飾也屬于代謝工程的范疇。目前,已經(jīng)構(gòu)建了多個S酵母/大腸桿菌的單拷貝和多拷貝的穿梭質(zhì)粒(如pZEU、pZEL和pZEA,其選擇標(biāo)記分別為ScURA3、ZrLEU2和ZrADE218-20。利用這些質(zhì)?？梢赃^量表達(dá)某一風(fēng)味物質(zhì)形成過程中的關(guān)鍵蛋白,從而改善醬油風(fēng)味,滿足人們對醬油不同風(fēng)味的需求。2.4進(jìn)化工程進(jìn)化工程就是在達(dá)爾文進(jìn)化理論基礎(chǔ)上進(jìn)行隨機(jī)突變與選擇的一種技術(shù)方法,也稱為定向進(jìn)化。其中,整體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)工程(global transcription m

14、achinery engineering, gTME21就屬于進(jìn)化工程的范疇。gTME是通過易錯PCR 突變來改變用于調(diào)解基因整體轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵蛋白,并因此使相關(guān)基因達(dá)到一個新的轉(zhuǎn)錄水平。gTME已經(jīng)成功應(yīng)用到原核生物和釀酒酵母中22。確定S酵母、T酵母和C酵母的全局轉(zhuǎn)錄因子序列是gTME策略能否改善醬油風(fēng)味的必要條件。2.5基因組重排基因組重排就是在多個母本雜交基礎(chǔ)上把DNA改組與傳統(tǒng)的育種方法有機(jī)結(jié)合起來的技術(shù)方法23-25。將經(jīng)典的育種和DNA改組相結(jié)合的基因組重排技術(shù)為快速的使微生物群體產(chǎn)生復(fù)雜后代的重組文庫提供了最有效的方2··中國釀造2009年第7期總第208期法。

15、近年來,基因組重排技術(shù)發(fā)展很快,并且已經(jīng)成功的應(yīng)用到原核生物26-27和極少數(shù)真核生物中28-30。通過基因組重排方法進(jìn)一步提高酵母菌株的耐鹽性是改善醬油風(fēng)味的有效手段?？傊?醬油的風(fēng)味是決定醬油質(zhì)量的關(guān)鍵因素。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,利用分子生物學(xué)手段、gTME 和基因組重排策略是改造耐鹽酵母從而改善醬油風(fēng)味提高醬油質(zhì)量的必然趨勢。參考文獻(xiàn):1MUROOKA Y,YAMSHITA M.Traditional healthful fermented productsof JapanJ.J Ind Microbiol Biotechnol,2008,35:791-798.2SUEZAWA Y

16、,KIMURA I,INOUE M,et al.Identification and typing ofmiso and soy sauce fermentation yeasts,Candida etchellsii and C.versa-tilis,based on sequence analyses of the D1D2domain of the26S riboso-mal RNA gene,and the region of internal transcribed spacer1,5.8S ri-bosomal RNA gene and internal transcribed

17、spacer2J.Biosci Biotech-nol Biochem,2006,70:348-354.3WANAKHACHORNKRAI P,LERTSIRI S.Comparison of determinationmethod for volatile compounds in Thai soy sauceJ.Food Chem,2003, 83:619-629.4SLUIS C,TRAMPER J,WIJFFELS R H.Enhancing and accelerating fla-vor formation by salt-tolerant yeasts in Japanese s

18、oy-sauce processesJ.Trends Food Sci Tech,2001,12:322-327.5JANSEN M,VEURINK J H,EUVERINK G W,et al.Growth of thesalt-tolerant yeast Zygosaccharomyces rouxii in microtiter plates:effects of NaCl,pH and temperature on growth and fusel alcohol production from branched-chain amino acidsJ.FEMS Yeast Res,2

19、003,3: 313-318.6MASON A B,DUFOUR J P.Alcohol acetyltransferases and the sig nifi-cance of ester synthesis in yeastJ.Yeast,2000,16:1287-1298.7SAERENS S M G,VERBELEN P J,VANBENEDEN N,et al.Moni tor-ing the influence of high-gravity brewing and fermentation temperature on flavour formation by analysis

20、of gene expression levels in brewing yeastJ.Appl Microbiol Biotechnol,2008,in press.8SAERENS SMG,VERSTREPEN KJ,VAN LAERE SDM,et al.The Sac-charomyces cerevisiae EHT1and EEB1genes encode novel enzymes with mediumchain fatty acid ethyl ester synthesis and hydrolysis capacity J.J Biol Chem,2006,281:444

21、6-4456.9NODA F,HAYASHI K,MIZUNUMA T.Antagonism between os mophiliclactic acid bacteria and yeasts in brine fermentation of soy sauceJ.Appl Environ Microbiol,1980,9:452-457.10SUEZAWA Y,SUZUKI M.Bioconversion of ferulic acid to4-vinylgua-iacol and4-ethylguaiacol and of4-vinylguaiacol to4-ethylguaiacol

22、 by halotolerant yeasts belonging to the genus CandidaJ.Biosci Biotech Biochem,2007,71:1058-1062.11HAYASHIDA Y,KURIYAMA H,NISHIMURA K,et al.Production of4-hydroxyfuranones in simple media by fermentationJ.Biotechnol Lett,1999,21:505-509.12KATAOKA,S.Functional effects of Japanese style fermented soy

23、sauce(Shoyuand its componentsJ.J Biosci Bioeng,2005,100:227-234.13HECQUET L,SANCELME M,BOLTE J,et al.Biosynthesis of4-hy-droxy-2,5-dimethyl-3(2H-furanone by Zygosaccharomyces rouxiiJ.J Agric Food Chem,1996,44:1357-1360.14OHATA M,KOHAMA K,MORIMITSU Y,et al.The formation mech a-nism by yeast of the2(o

24、r5-ethyl-5(or2-methyl-4-hydroxy-3(2H-fura-none in MisoJ.Biosci Biotech Biochem,2007,71:407-413.15GIUDICI P,SOLIERI L,PULVIRENTI A M,et al.Strategies and per-spectives for genetic improvement of wine yeastsJ.Appl Microbiol Biotechnol,2005.66:622-628.16AOKI T,UCHIDA K.Enhanced formation of2-phenyletha

25、nol in Zy-gosaccharomyces rouxii due to prephenate dehydrogenase deficiency J.Agric Biol Chem,1990,54:273-274.17KIM J K.Hybridoma of Zygosaccharomyces rouxii and Torulopsis ver-satilis which produces aromas of soy sauceJ.United States Patent, 1993,5,210,034.18PRIBYLOVA L,MONTIGNY J,SYCHROVA H.Tools

26、for the genetic-manipulation of Zygosaccharomyces rouxiiJ.FEMS Yeast Res,2007, 7:1285-1294.19PRIBYLOVA L,SYCHROVA H.Efficient transformation of the osmo-tolerant yeast Zygosaccharomyces rouxii by electroporationJ.J Mi-crobiol Meth,2003,55:481-484.20PRIBYLOVA L,STRAUB M L,SYCHROVA H,et al.Characteris

27、ationof Zygosaccharomyces rouxii centromeres and construction of first Z.rouxii centromeric vectorsJ.Chromosome Res,2007,15:439-445. 21ALPER H.Development of systematic and combinatorial approachesfor the metabolic engineering of microorganismsD.Massachusetts In-stitute of Technology Thesis,2006.22A

28、LPER H,MOXLEY J,NEVOIGT E,et al.Engineering yeast tran-scrip tion machinery for improved ethanol tolerance and productionJ.Science,2006,314:1565-1568.23ZHANG YX,PERRY K,VINCI VA,et al.Genome shuffling leads torapid phenotypic improvement in bacteriaJ.Nature,2002,415: 644-646.24STEPHANOPOULOS G.Metabolic engineering by genome shufflingJ.Nat Biotechnol,2002,