人氣管上皮細(xì)胞對(duì)綠膿桿菌抗菌作用觀察

1、人氣管上皮細(xì)胞對(duì)綠膿桿菌抗菌作用觀察         11-04-21 13:35:00     編輯：studa20               作者：劉燕翔 趙麗君 隋鵬諾 劉珍 王伯瑤 黃寧 吳琦【摘要】  目的：探討呼吸道上皮細(xì)胞與呼吸道致病菌之間的相互關(guān)系，觀察呼吸道上皮細(xì)胞對(duì)綠膿桿菌的抗菌作用。方法：(1)貼壁生長(zhǎng)的

2、人呼吸道上皮細(xì)胞株HBE16與綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27853共孵育，慶大霉素殺死胞外菌，動(dòng)態(tài)觀察上皮細(xì)胞內(nèi)活細(xì)菌數(shù);(2)HBE16細(xì)胞與綠膿桿菌共同懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)基，在不同孵育時(shí)間點(diǎn)用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)活菌數(shù)。結(jié)果：綠膿桿菌不能在HBE16細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)，并被細(xì)胞逐漸清楚。懸浮狀態(tài)下的HBE16細(xì)胞對(duì)綠膿桿菌有一定殺菌作用。結(jié)論：呼吸道上皮細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)外綠膿桿菌的抗菌作用，可能是呼吸道抵抗細(xì)菌感染的一種天然免疫防御機(jī)制。 【關(guān)鍵詞】  呼吸道上皮細(xì)胞;綠膿桿菌;抗菌作用機(jī)體在生物進(jìn)化過程中，為抵抗微生物的侵襲，發(fā)展出各種抗感染防御機(jī)制。機(jī)體的免疫系統(tǒng)分為天然免疫和獲得性免疫，他們共同作

3、用，使機(jī)體在復(fù)雜的外環(huán)境中，維持正常的生命過程。在發(fā)生學(xué)上最古老的防御機(jī)制是天然免疫，其在對(duì)抗病原微生物的感染過程中所發(fā)揮的作用越來越引起人們的注意1。上皮細(xì)胞是天然免疫的重要組成部分，構(gòu)成機(jī)體抵御外來病原微生物的首要防線。研究顯示泌尿道、消化道及口腔上皮細(xì)胞對(duì)細(xì)菌有直接抗菌作用2-3。呼吸道上皮細(xì)胞是呼吸道防御微生物感染的第一道屏障，綠膿桿菌在自然界中廣泛存在，是肺囊性纖維化病人和醫(yī)院內(nèi)感染最常見的條件致病菌之一4-6。綠膿桿菌對(duì)正常人不致病，只在免疫功能低下或粘膜上皮細(xì)胞受損和功能失常的時(shí)候才引起感染7。呼吸道上皮細(xì)胞在防御這類機(jī)會(huì)致病菌感染時(shí)可能發(fā)揮了重要的作用。為了了解呼吸道上皮細(xì)胞與

4、綠膿桿菌之間的相互關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)觀察呼吸道上皮細(xì)胞對(duì)綠膿桿菌的抗菌作用。1 材料與方法1.1 材料綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27853株、人呼吸道上皮細(xì)胞株HBE16為本實(shí)驗(yàn)室保存。酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉為OXOID公司產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸購(gòu)自GIBCO公司，新生牛血清購(gòu)自Hyclon公司，TritonX100購(gòu)自Sigma，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2 細(xì)菌的準(zhǔn)備從LB平板中挑取單個(gè)菌落接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)3-5h，取100l菌液涂布接種于固體LB培養(yǎng)板上。倒置于37°C孵箱培養(yǎng)，16h后收集活菌。用PBS洗滌細(xì)菌三次，紫外分光光度計(jì)測(cè)定

5、650nmOD值，確定細(xì)菌的濃度(綠膿桿菌OD650=1.3相當(dāng)于每mL細(xì)菌量109)。1.3 細(xì)胞的準(zhǔn)備HBE16細(xì)胞用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基(無抗生素)，37°C，5%CO2孵箱常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，PBS洗滌，胰酶消化，收集并計(jì)數(shù)確定細(xì)胞數(shù)量。將HBE16細(xì)胞以8×104/孔接種于48孔板，經(jīng)48小時(shí)生長(zhǎng)細(xì)胞匯合后(細(xì)胞數(shù)大約為1.2×105/孔)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.4 單層貼壁HBE16細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)綠膿桿菌生長(zhǎng)的影響HBE16細(xì)胞用PBS洗三次，每孔加入200l DMEM培養(yǎng)基稀釋好的ATCC2785細(xì)菌(細(xì)菌與細(xì)胞的數(shù)量比分別是10:1，2

6、0:1，50:1)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組做3復(fù)孔。放入37°C，5%CO2孵箱孵育兩小時(shí)。用PBS洗細(xì)胞三次，每孔加入含慶大霉素(100g·mL-1)及10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基500l，37°C，5%CO2孵箱孵育兩小時(shí)以殺死細(xì)胞外的綠膿桿菌(慶大霉素不進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，只殺死胞外的細(xì)菌)。分別于實(shí)驗(yàn)的4小時(shí)、24小時(shí)用TritonX100裂解細(xì)胞，釋放出細(xì)胞內(nèi)的活細(xì)菌，用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算胞內(nèi)活菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,數(shù)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗(yàn)。1.5 懸浮狀態(tài)HBE16細(xì)胞對(duì)綠膿桿菌的抗菌實(shí)驗(yàn)HBE16細(xì)胞用含10%

7、新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基(無抗生素)，37°C，5%CO2常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，PBS洗滌，胰酶消化，收集并計(jì)數(shù)確定細(xì)胞數(shù)量。細(xì)菌與細(xì)胞數(shù)按10：1的比例混合，加入EP管(體積為200l)，細(xì)胞的終濃度為1×105個(gè)/ml，細(xì)菌的終濃度為1×106個(gè)/ml。實(shí)驗(yàn)分二組：對(duì)照組只加細(xì)菌;實(shí)驗(yàn)組加入細(xì)胞和細(xì)菌，試驗(yàn)采用三復(fù)管。放入37，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，分別于孵育后的15min、30min、60min、90min、120min，加入200l 濃度為0.25%的Tritonx100，放置15 min，作10倍系列稀釋,每個(gè)稀釋度取100ul 樣品涂布于LB 瓊脂平板, 37 溫箱培養(yǎng),菌落計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 綠膿桿菌在貼壁生長(zhǎng)HBE16細(xì)胞內(nèi)的存活情況HBE16細(xì)胞與綠膿桿菌共孵育(細(xì)菌與細(xì)胞數(shù)比值分別為10：1，20：1，50：1)，以慶大霉素殺滅細(xì)胞外