畢業(yè)論文李穎

1、 學(xué)號(hào)： 畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 題目：HCV核心區(qū)基因片段（C70-140）的原核表達(dá)作 者： 李 穎 屆 別： 2012屆 系 別： 化學(xué)化工學(xué)院 專(zhuān) 業(yè)： 生物工程 指導(dǎo)老師： 聶東宋 職 稱： 副教授 完成時(shí)間： 2012年5月20日 摘要在大腸桿菌中表達(dá)HCV核心區(qū)基因片段（C70-140）, 構(gòu)建一個(gè)pBVIL-70-140原核表達(dá)載體，用于丙型肝炎核心抗原(HCV-cAg)和丙型肝炎抗體(HCV-Ab)聯(lián)合檢測(cè)。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增HCV核心片段，RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切后連接到經(jīng)同樣酶切的pBVIL原核表達(dá)載體中, 轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌BL21，并以IPTG 誘導(dǎo)蛋白

2、表達(dá)，SDS-PAGE 鑒定。結(jié)果表明，將目的基因與表達(dá)載體pBVIL進(jìn)行連接，得原核表達(dá)載體pBVIL-70-140，該載體轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌BL21后可誘導(dǎo)表達(dá)出分子量約為25 KD的重組蛋白。關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒;核心區(qū)基因片段(C70-140)；原核表達(dá)AbstractThe objective is to express the recombinant HCV core gene fragment (C70-140) in Escherichia coli and build a pBVIL-70-140 prokaryotic expression vector for the he

3、patitis B core antigen ( HCV-cAg ) and hepatitis C antibodies ( HCV-Ab ) combined detection. HCV core fragment was amplified by RT-PCR and the product was digested by XhoI and XbaI, then the fragment was inserted into an Escherichia coli prokaryotic expression vector pBVIL，and used to transform E. c

4、oli BL21. The target protein was expressed in BL21 and induced by IPTG ，and the expressed protein was indentified by SDS PAGE. We got the pBVIL-70-140 prokaryotic expression vector by connecting the purpose gene and expression vector pBVIL, the result showed that the pBVIL-70-140 prokaryotic express

5、ion vector can induce the expression of the recombinant protein molecular weight of about 25KD through the transformation of Escherichia coli.Key words: HCV ; Core gene fragment(C70-140); Prokaryotic expression目 錄中文摘要 英文摘要 前言 1一、材料與方法 31、材料31.1實(shí)驗(yàn)儀器 31.2實(shí)驗(yàn)酶及主要試劑 31.3試劑盒 41.4分子量標(biāo)準(zhǔn) 41.5引物 41.6菌株和載體 41.

6、7實(shí)驗(yàn)血漿 42、方法42.1主要溶液配制 42.2培養(yǎng)基配制 52.3丙型肝炎病毒RNA提取 62.4引物設(shè)計(jì) 62.5逆轉(zhuǎn)錄成c DNA 62.6 PCR擴(kuò)增目的基因 62.7載體質(zhì)粒DNA與目的基因DNA的制備及酶切 72.8質(zhì)粒大片段及目的基因片段的分離回收與純化 72.9目的基因片段與載體連接 82.10 BL21感受態(tài)細(xì)胞的制備82.11 轉(zhuǎn)化 92.12 重組克隆的篩選及鑒定 92.13 重組蛋白的表達(dá)與純化 9二、結(jié)果 11 三、討論 14參考文獻(xiàn) 16致謝 18附錄 19前 言丙型肝炎病毒（HCV）是慢性肝炎和肝癌的主要病原體之一，感染HCV之后，約有5085的受染者成為慢性

7、攜帶者；感染后20 年，約有20左右的感染者發(fā)生肝硬化；而一旦發(fā)展成為肝硬化，HCV 相關(guān)的肝細(xì)胞癌每年的發(fā)生率為17；而且目前尚無(wú)有效的疫苗可以預(yù)防感染1-3。因而丙型肝炎給患者帶來(lái)極大的健康負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)和公共衛(wèi)生問(wèn)題。丙型肝炎呈全球性流行，平均HCV 感染率在3左右，全世界約有1.7 億的HCV 感染者4，所感染的HCV 基因型主要包括9 種。我國(guó)一般人群的抗-HCV 陽(yáng)性率為3.2，與世界平均水平接近，HCV 基因型以1b 和2a 為主，其中1b 型占到70以上5。HCV基因組是一個(gè)單股正鏈的RNA分子，HCV利用依賴于RNA的RNA聚合酶復(fù)制其基因組，在結(jié)構(gòu)上可

8、以分為三個(gè)區(qū)：5端的非翻譯區(qū)（5-UTR，untranslated region），一個(gè)長(zhǎng)的多蛋白讀碼框（ORF），3端的非翻譯區(qū)（3-UTR）6, 7。翻譯區(qū)的多蛋白讀碼框可以翻譯出多種結(jié)構(gòu)蛋白（CORE, E1, E2,p7）和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) 8, 9。HCV 的核心蛋白（CORE）不僅作為結(jié)構(gòu)蛋白包裹病毒核酸、形成病毒的核衣殼10，而且可以通過(guò)多種途徑11, 12抑制宿主對(duì)病毒感染的防御反應(yīng)，參與細(xì)胞中的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期等13。Li 等14在對(duì)HCV 自我調(diào)節(jié)機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，HCV 核心蛋

9、白可以通過(guò)與HCV 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）的結(jié)合，特異性的抑制IRES 型和帽依賴型的翻譯。所以，HCV 的核心蛋白可被看作一個(gè)多功能蛋白，能夠影響多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活多種病毒及細(xì)胞基因啟動(dòng)子，具有廣泛的反式激活作用10；還可與宿主細(xì)胞中參與凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)化、膜重排及免疫逃逸等的調(diào)節(jié)分子發(fā)生相互作用11, 12, 15。目前，國(guó)內(nèi)公眾對(duì)丙肝流行現(xiàn)狀缺乏全面準(zhǔn)確的了解。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在83的有丙肝高危險(xiǎn)因素的人群中，僅有5檢測(cè)過(guò)丙肝。并且對(duì)丙肝治療尚未完全納入醫(yī)保，公眾對(duì)丙肝認(rèn)知水平也較低，調(diào)查過(guò)程中，約41的公眾不知道丙肝。丙肝，市場(chǎng)上既沒(méi)有非常明確的藥物，也缺少有效的疫苗加以預(yù)防

10、和阻止其進(jìn)一步傳播。因此，HCV的早期診斷對(duì)于篩查HCV的傳染源、指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后判斷有重大意義。當(dāng)前，醫(yī)療機(jī)構(gòu)主要通過(guò)對(duì)血清中抗HCV和HCV RNA的檢測(cè)來(lái)篩查丙肝。但HCV感染后到抗HCV抗體的出現(xiàn)有一個(gè)平均為6周 12周的“窗口期” ,即使患者被高度感染，抗體檢測(cè)技術(shù)也較難檢測(cè)HCV的存在。所以抗HCV 不適合作為HCV 感染的早期診斷指標(biāo)。而HCV RNA的檢測(cè)方法雖然具有早期、敏感和特異等特點(diǎn)，但該方法在技術(shù)和設(shè)備上要求較高，費(fèi)時(shí)，檢出率低，難以在常規(guī)工作或基層實(shí)驗(yàn)室推廣。針對(duì)上述檢測(cè)中存在的一些不足之處，我們通過(guò)大腸桿菌中表達(dá)并純化HCV 核心蛋白, 構(gòu)建一個(gè)pBVIL-70-

11、140原核表達(dá)載體,用于 HCV抗體和HCV核心抗原的聯(lián)合檢測(cè),使HCV感染的“窗口期”縮短至2周，從而達(dá)到準(zhǔn)確、快速、便捷的檢測(cè)目的。一、材料與方法1、材料1.1實(shí)驗(yàn)儀器電子天平： AR3130，Ohaus Corp.Pine.Brank,NJ,USA恒溫磁力攪拌器： HJ-3，金壇市富華儀器有限公司核酸蛋白檢測(cè)儀： smartspec plus，BIO-RAD自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)： DEMIII型，北京拓普分析儀器有限公司酶標(biāo)儀： MK3型，Thermo Labsystems Multiskan SSW型電熱恒溫水槽：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司層析儀： BioLogic LP，BIO-RAD水平搖床：

12、 WD-9405B，北京六一儀器廠垂直電泳槽： DYCZ-24A，上海天能科技電泳儀： DYY-8B，北京六一儀器廠水平電泳槽： DYCZ-40B，北京六一儀器廠凝膠成像系統(tǒng)： GEL DOC XR，BIO-RAD恒振蕩器： THZ- C，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠水浴振蕩器： HZS-H，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司高速冷凍離心機(jī)： CR21G，廣州天美超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)： JY92-2D，寧波新芝生物科技離心機(jī)： 114，SIGMA低溫恒溫水槽： NCB-1200，Tokyo Rikakikai CO.LTDPCR儀： 2720，ABI超凈工作臺(tái)： 蘇州凈化設(shè)備廠1.2實(shí)驗(yàn)酶及主要試劑（1）Ferm

13、entas公司產(chǎn)品：限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI、Tap酶，SUPERCRIPTTM、RiboLockTMRNase Inhibitor。（2）Clontech公司產(chǎn)品：10advantage 2PCR Buffer 、50dNTP mix 、Control DNA Template dNase、2 DNA polyme-rase mix、PCR-Grade Water。（3）OXOID產(chǎn)品：胰蛋白胨、酵母提取物。（4）Sigma產(chǎn)品：氨芐青霉素、Trizol、DEPC、Tris 、瓊脂糖、IPTG、丙烯酸胺、甲叉雙丙烯酞胺、TEMED、Na2CO3、NaHCO3、CaCl2。（5）HRP

14、-兔抗人：北京博奧森產(chǎn)品。（6）聚苯乙烯酶聯(lián)板：深圳金創(chuàng)華產(chǎn)品。（7）國(guó)產(chǎn)分析純：苯酚、氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇、甘油、氯化鈉、瓊脂、NaOH、NaAc、醋酸、溴化乙錠、HCl、EDTA、硼酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、醋酸鈉、SDS。1.3試劑盒pMDTM18-T Kit購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收純化試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Fermentas公司；T4 DNA Ligase Kit購(gòu)自Fermentas公司；DNA Ligation Kit Ver.2購(gòu)自TaKaRa

15、公司。1.4分子量標(biāo)準(zhǔn)核酸電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)PUCMix18DNA Maker和蛋白質(zhì)電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Maker均購(gòu)自Fermentas公司。1.5引物70-140-F：TATCTCGAGCGGCCCGAGGGCAGGAC70-140-R：TCGGTCTAGAGACGAGCGGTATGTACC由上海生物工程有限公司合成；1.6菌株和載體菌株：大腸桿菌BL21為湖南康潤(rùn)藥業(yè)有限公司實(shí)驗(yàn)室保存。原核表達(dá)載體pBVIL：為湖南康潤(rùn)藥業(yè)有限公司實(shí)驗(yàn)室保存。1.7實(shí)驗(yàn)血漿實(shí)驗(yàn)所用的HCV陽(yáng)性血漿和陰性血漿，為湖南康潤(rùn)藥業(yè)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供。2、方法 2.1主要溶液的配制（1）緩沖液A：50mM Tris-

16、HCl(pH8.0pH9.0),2mM EDTA,100mM NaCl。（2）緩沖液：50mM Tris-HCl(pH8.0pH9.0),2mM EDTA,100mM NaCl，0.5%Triton X-100(V/V)。（3）緩沖液：50mM Tris-HCl(pH8.0pH9.0),2mM EDTA,100mM NaCl，0.5%Triton X-100(V/V)，2M尿素。（4）緩沖液B：100mM Tris-HCl(pH8.0pH9.0),6M尿素。（5）10TBE電泳緩沖液:108g Tris，55g硼酸，40ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0)，加水定容至1L，用前稀釋1

17、0倍即成應(yīng)用液。（6）TE緩沖液:10mmol/L Tris-Cl PH8.0，1mmol/L EDTA PH8.0，用DEPC水配制。（7）0.1mol/L CaCl2:稱取無(wú)水CaCl2 1.11g，加ddH2O定容至l00ml，0.22um濾器過(guò)濾除菌，4貯存。（8）50%甘油：10 ml甘油加10 mlddH2O，滅菌后4貯存。（9）l%瓊脂糖凝膠:1g瓊脂糖，100ml 1TBE，10ul溴化乙錠。（10）01 mol/L IPTG：于8mlddH2O中溶解0238g IPTG后，定容至10ml，022um濾紙過(guò)濾除菌，分裝成lml，20貯存。（11）30%丙烯酞胺溶液：取丙烯酞胺2

18、9g，甲叉雙丙烯酞胺1g，于37溶解完全后，定容至100ml，過(guò)濾避光4保存。（12）10%過(guò)硫酸銨：取lg過(guò)硫酸銨，加ddH2O定容至10ml，4貯存。（13）10%SDS：取SDS10g，加入ddH2O 90ml，加熱助溶，用5molHCl調(diào)PH至72，定容至100ml。（14）濃縮膠緩沖液(l0mol/LTrisCl PH68) ：:取Tris堿121g，加ddH2O80ml溶解，用5mol/L HCl調(diào)PH至68，定容至100ml，4貯存?zhèn)溆?。?5）分離膠緩沖液(l5mol/LTrisCl PH88) ：取Tris堿1816g，加ddH2080ml溶解，用5mol/LHCl調(diào)PH至8

19、8，定容至100ml，4貯存?zhèn)溆谩＃?6）5Tris-甘氨酸電泳緩沖液：取Tris堿151g，甘氨酸94g，SDS 5g加ddH2O溶解，定容至1000ml，4貯存?zhèn)溆茫们跋♂?倍即成應(yīng)用液。（17）2SDS樣品緩沖液：一巰基乙醇lml，lmol/LTrisCl(PH68)ml，10%SDS 4ml，甘油2ml，01%溴酚藍(lán)，加ddH2O至10ml。（18）考馬斯亮藍(lán)R250染色液:考馬斯亮藍(lán)R250 0.5g，甲醇90ml，冰乙酸2Oml，ddH2O90ml。（19）脫色液:甲醇180ml，冰乙酸40ml，加ddH2O至400ml。（20）1PBS：140mM NaCl, 2.7mM KC

20、l, 10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4 PH7.3。（21）Elution buffer: 50mM Tris-HCl,10mM reduced glutathione PH8.0。（22）1PBST: 1PBS 0.05%Tween-20 PH7.3。（23）包被液(碳酸鹽緩沖液，PH9.6):取NaHCO32.93g，Na2CO31.59g，加ddH20定容至1000ml。（24）封閉液：2%BSA 1PBS PH7.3。（25）底物 A: 磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(0.2mol/LNa2HPO4:25.7ml，0.lmol/L檸檬酸24.3ml，過(guò)氧化脲0.04%，ddH2

21、O 50ml，PH5.O。（26）底物 B: 磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(0.2mol/LNa2HPO4:25.7ml，0.lmol/L檸檬酸24.3ml，TMB0.03%，ddH2O 50ml，PH5.O。（27）終止液：112ml濃H2SO4 ddH20定容至1000ml。2.2 培養(yǎng)基的配制 LB液體培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，05%酵母提取物，1%NaCI，用5mol/LNaOH調(diào)PH至70。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入15%的瓊脂。AmpLB液體培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中加入100ug/ml的氨芐青霉素。2.3丙型肝炎病毒RNA的提取2.3.1 取一支用DEPC水處理過(guò)的EP管，分別加入2

22、00ul HCV抗原陽(yáng)性血漿，再加入150ul Trizol，混勻后室溫放置5 min；2.3.2加入200ul氯仿，4條件下，12000 rpm離心15min； 取上清200ul，加入等量異丙醇，-20放置2個(gè)小時(shí)。2.3.4在4條件下，12000 rpm離心15min，棄上清液；2.3.5加入1ml 75%乙醇后5000 rpm離心5min，棄上清液自然風(fēng)干；2.3.6 加入30 ul DEPC處理水溶解備用。2.4引物設(shè)計(jì) 針對(duì)HCV基因序列，利用分析軟件PRIMER PREMIER 5輔助設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR引物，分別在5端和3端引入XhoI和XbaI酶切位點(diǎn).2.5逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 模板

23、RNA 負(fù)鏈引物 DEPC處理水混勻后70放置5min，再至冰上按順序加入以下試劑 5reaction buffer RiboLockTMRNase Inhibitor（20u/ul） 10mM dNTP mix混勻后37放置5min，加入 RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase（200uul） 1ul簡(jiǎn)單離心后，放置在42 60min，再放置70 10min，冰浴。2.6 PCR擴(kuò)增目的基因ddH2O37ul10xPCRbuffer5ul10mmol/LdNTP1ul25pmol/L正鏈引物2ul25pmol/L負(fù)鏈引物2ul模板2ul2U/ulTa

24、qDNA聚合酶1ul總體積50ul混勻后放入PCR儀反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為：94變性10 min，94 30s60 30s72 30s 60 30s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，最后72延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。2.7 載體質(zhì)粒DNA與目的基因DNA的制備及酶切 用質(zhì)粒提取試劑盒（TaKaRa公司）提取少量質(zhì)粒DNA 1.取3ml過(guò)夜菌液，12000r/min離心2分鐘，棄上清； 2.用250ul的Solution 充分懸浮細(xì)菌沉淀； 3.加入250ul的Solution 輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合56次，使菌體充分裂解，形成透明溶液； 4.加入400ul的4預(yù)冷的Solution ，輕輕

25、上下翻轉(zhuǎn)混合56次，室溫靜置2分鐘； 5.12000r/min離心10分鐘，取上清； 6.將試劑盒中的Spin Column 安置于Collection Tube上； 7.將上述操作5的上清液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000r/min離心1分鐘，棄去濾液； 8.將500ul的Rinse A加入Spin Column中，12000r/min離心30秒，棄濾液； 9.將700ul的Rinse B加入Spin Column中，12000r/min離心30秒，棄濾液； 10.重復(fù)操作步驟9； 11.將Spin Column安置于新的1.5ml離心管上，Spin Column膜的中央處加入60

26、ul的Elution Buffer，靜置1分鐘； 12.12000rpm離心1分鐘洗脫DNA。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶 進(jìn)行雙酶切：質(zhì)粒64ul10反應(yīng)緩沖液8ul限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶加水至80ul，輕輕混勻，37水浴酶切過(guò)夜， 15%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切情況。2.8 質(zhì)粒大片段及目的基因片段的分離回收與純化用凍融法從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段。按常規(guī)方法對(duì)質(zhì)粒和目的基因酶切反應(yīng)后的樣品進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切割目的條帶，裝入1.5mlEppendorf管中。后續(xù)步驟按按TaKaRa公司膠回收純化試劑盒操作。其操作如下：1.稱量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。計(jì)算膠塊體積時(shí)，以

27、1mg=1ul進(jìn)行計(jì)算。2.向膠塊中加入膠塊融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下表： 3.均勻混合后75加熱融化膠塊（低濃度的瓊脂糖凝膠只需在45加熱）。此時(shí)應(yīng)間斷振蕩混合。4.向上述膠塊融化液中加入DR-I Buffer量一半體積的DR- Buffer，均勻混合。當(dāng)分離小于400bp的DNA片段時(shí)，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。5.將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。6.將上述操作4的溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000rpm離心1分鐘，棄濾液。7.將500ul的Rinse A加入Spin Column中，

28、12000rpm離心30秒，棄濾液。8.將700ul的Rinse B加入Spin Column中，12000rpm離心30秒，棄濾液。9.重復(fù)操作步驟8.10.將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入25ul的滅菌水或Elution Buffer，靜置1分鐘。11.12000rmp離心1分鐘洗脫DNA.2.9 目的基因片段與載體連接目的基因片段8ul載體2ulT4 DNA Ligase0.2ul10Buffer2ul加水至20ul輕輕混勻，16水浴過(guò)夜，同時(shí)設(shè)置空載體作對(duì)照。2.10 BL21感受態(tài)細(xì)胞的制備2.10.1 從LB平板上挑取新

29、活化的Top 10單菌落，接種于35mlLB液體培養(yǎng)基中，37下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)左右； 將該菌以1：201：50的比例接種于盛有5mlLB液體培養(yǎng)基的試管中，于37、220r/min振蕩培養(yǎng)12小時(shí)待吸光度A600達(dá)到為0.5左右； 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入2個(gè)1.5ml的離心管中，冰上放置510分鐘，然后于4下13000r/min離心30秒； 棄去上清液，用預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液0.5ml每管輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置510分鐘后，4下13000r/min離心30秒； 棄去上清液，加入0.2ml每管預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置1530分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸浮

30、液； 若要保存，則加入等體積的50%甘油，混勻后每管200ul分裝，80保存?zhèn)溆谩?.11 氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌2.11.1 將2.9中連接的質(zhì)粒DNA溶液加5ul于上述感受態(tài)細(xì)胞懸浮液中，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘； 42水浴中熱擊90秒，迅速置于冰上冷卻35分鐘； 向離心管中加入0.8mlLB液體培養(yǎng)基（不含Amp），混勻后37振蕩培養(yǎng)0.51小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（Amp）； 將上述菌液搖勻后取50ul涂布于含Amp的2個(gè)篩選平板上，倒置培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)1216小時(shí)。2.12 重組克隆的篩選及鑒定初步鑒定：挑取單菌落接種于AmpLB培養(yǎng)基中，37 2

31、50r/min搖床培養(yǎng)4-6小時(shí)，取培養(yǎng)菌作模板，運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，同DNA Marker對(duì)照比較分子量大小，與理論分子量大小基本一致，即初步鑒定為陽(yáng)性克隆株。2.12.2酶切鑒定：取上述鑒定得到的陽(yáng)性重組克隆在AmpLB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，用XhoI和XbaI雙酶切鑒定重組子，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切片段大小。 測(cè)序鑒定：將篩選的陽(yáng)性重組克隆菌體進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。2.13 重組蛋白的表達(dá)與純化核心基因重組菌誘導(dǎo)：取2mlAmp-BL培養(yǎng)基活化核心基因重組菌，次日轉(zhuǎn)接到200mlAmp-BL培養(yǎng)基于37220r/min繼續(xù)活化，待吸光度

32、A600達(dá)到0.61.0時(shí)，加入100ulIPTG 于37160r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)46小時(shí)，4 12000r/min離心10分鐘收集菌體。 超聲：將菌體用緩沖液A溶解，12000r/min離心10分鐘，棄上清。將沉淀用緩沖液溶解，超聲破碎菌體，功率400W，超5秒，間隔5秒，總時(shí)間約30分鐘，直至超聲完全（菌液清亮），12000r/min、4離心15min。保留上清和沉淀，離心后將沉淀用緩沖液B溶解，用15%SDS-PAGE電泳檢測(cè)。 表達(dá)蛋白的純化：將超聲破碎后的沉淀用緩沖液B溶解再經(jīng)離子交換柱純化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.PCR擴(kuò)增目的基因的檢測(cè)結(jié)果運(yùn)用兩條引物擴(kuò)增HCV核心抗原基因片段，PCR產(chǎn)物

33、經(jīng)1.5%的瓊脂凝膠電泳顯示，在220bp處有一條特異擴(kuò)增條帶，分子量大小與預(yù)計(jì)值一致。（圖1） 圖1：1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)條帶; 1為HCV核心抗原基因PCR產(chǎn)物。2.酶切回收將載體與目的基因均用限制性內(nèi)切酶雙酶切回收。（圖2） 圖2：1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖Marker為PUCMix18分子量標(biāo)準(zhǔn)；3為表達(dá)載體酶切回收產(chǎn)物，1、2為目的基因酶切回收產(chǎn)物。3.重組克隆的篩選及鑒定將回收后的目的基因片段定向連接到酶切后的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。從轉(zhuǎn)化平板上挑取6個(gè)單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)的菌體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳（如圖3）,發(fā)現(xiàn)圖3

34、中的除5號(hào)菌株外，其他菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與HCV核心基因(70-140)大小一致。 圖 3 ：Marker為PUCMix18分子量標(biāo)準(zhǔn)，16號(hào)為挑取菌株的PCR產(chǎn)物選用2號(hào)菌株進(jìn)行基因序列測(cè)序，結(jié)果如圖4所示，測(cè)到的基因序列與GenBank序列號(hào)為AY460204中的HCV70-140完全一致。 圖4：HCV核心基因70-140測(cè)序圖譜 4、重組質(zhì)粒表達(dá)：上述圖3中2號(hào)菌株誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后帶有重組質(zhì)粒的工程菌表達(dá)產(chǎn)物中有一相對(duì)分子量大小約為25KD左右的新蛋白區(qū)帶（如圖5），與目的蛋白大小一致。 圖5：15%SDS-PAGE蛋白膠電泳圖Marker為蛋白質(zhì)分子

35、量標(biāo)準(zhǔn)；1為誘導(dǎo)前的重組工程菌菌體；2為誘導(dǎo)后的重組工程菌菌體，目的蛋白大小為25KD。5、表達(dá)蛋白的純化： 重組工程菌菌體經(jīng)超聲破碎后，發(fā)現(xiàn)目的蛋白大量存在于沉淀中，超聲上清液中均只含有很少的量（如圖6）。 圖6：15%SDS-PAGE蛋白膠電泳圖Marker為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為超聲破碎后的上清；2為誘導(dǎo)前的重組工程菌菌體；3為超聲破碎后的沉淀討論丙型肝炎病毒(HCV )感染所致丙型肝炎是慢性肝病的主要病因之一, 主要由輸血引起, 與肝細(xì)胞癌(HCC )及肝硬化關(guān)系密切, 對(duì)人類(lèi)危害巨大。目前全球范圍內(nèi)感染HCV 的患者約有1. 7億人, 我國(guó)約4000萬(wàn)左右。HCV 感染己成為嚴(yán)重的世

36、界公共衛(wèi)生問(wèn)題之一, 但迄今尚無(wú)疫苗和特異有效的治療藥物。HCV 是一種單股正鏈RNA 病毒, 其基因組長(zhǎng)約9. 4 kb, 其核心蛋白位于病毒多肽的氨基末端,被宿主的信號(hào)肽酶切割后產(chǎn)生, 由191個(gè)氨基酸殘基組成16-17 。此蛋白被認(rèn)為是病毒的核殼蛋白, 與HCV 其它的結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)蛋白相比, 其氨基酸序列高度保守。核心蛋白高度堿性, 無(wú)糖基化位點(diǎn), 且具有細(xì)胞毒性18-19 , 其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其難以在真核系統(tǒng)中表達(dá)。為了表達(dá)HCV核心區(qū)基因片段（C70-140）, 本研究擬構(gòu)建HCV 核心蛋白的原核表達(dá)載體pBVIL-70-140、并將表達(dá)蛋白進(jìn)行純化,用于丙型肝炎核心抗原(HCV-cAg

37、)和丙型肝炎抗體(HCV-Ab)聯(lián)合檢測(cè)。多項(xiàng)研究均表明HCV 核心蛋白能夠?qū)е赂渭?xì)胞惡變和腫瘤的發(fā)生, 除了參與病毒核衣殼的形成,HCV 核心蛋白還能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄, 影響細(xì)胞分化,細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 抑制宿主免疫反應(yīng) 20-22 等。核心蛋白氨基酸序列上有多個(gè)B、CTL 和T 細(xì)胞的抗原表位 23 , 能誘導(dǎo)不同病毒株的交叉免疫應(yīng)答24 , 并具有調(diào)控多種細(xì)胞基因、影響細(xì)胞生長(zhǎng)、增生及凋亡的能力, 可能是引起宿主細(xì)胞癌變的重要因素25 。因此, 核心蛋白具有的多種功能促使人們從不同角度對(duì)其進(jìn)行研究, 以期探討HCV 的致病機(jī)制, 為預(yù)防和治療HCV 感染提供新的策略。本研究旨在在大腸桿菌中原

38、核表達(dá)HCV 核心基因片段（C70-140）,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增HCV核心區(qū)基因片段（C70-140），將其連接到經(jīng)同樣酶切的pBVIL原核表達(dá)載體中, 轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌BL21，以IPTG誘導(dǎo)，SDS-PATG鑒定。結(jié)果表明，將目的基因與表達(dá)載體pBVIL進(jìn)行連接，得原核表達(dá)載體pBVIL-70-140，該載體轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌BL21后可誘導(dǎo)表達(dá)出分子量約為25 KD的重組蛋白。以目前廣泛使用的原核表達(dá)系統(tǒng)大腸埃希菌來(lái)構(gòu)建HCV 核心基因的表達(dá)載體。同真核表達(dá)系統(tǒng)相比, 大腸埃希菌具有較多的優(yōu)點(diǎn), 其表達(dá)目的蛋白快速、高效、經(jīng)濟(jì)。其本身繁殖力強(qiáng)。但由于原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞所特有的翻譯后加工

39、修飾系統(tǒng), 如糖基化等, 使不少具有生物活性的糖蛋白不能利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá); 而且蛋白的高水平表達(dá)常形成包涵體, 而包涵體的溶解純化步驟繁瑣, 也正因?yàn)槿绱? 以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白的分離純化、以及融合蛋白的復(fù)性成為了原核表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用過(guò)程中遇到的主要障礙之一。本研究還可以優(yōu)化地方,如：（1）工程菌在大腸桿菌中誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化，可以選擇多個(gè)時(shí)間段誘導(dǎo)比較蛋白表達(dá)量，從而選擇一個(gè)最佳的誘導(dǎo)時(shí)間；（2）誘導(dǎo)時(shí)IPTG的濃度優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)中加入50200ul的IPTG對(duì)蛋白表達(dá)量的影響不明顯，還可以在這個(gè)基礎(chǔ)上增加或減少其濃度，比較結(jié)果，從而選取一個(gè)最佳的濃度。參考文獻(xiàn)1. Dash S, Haqu

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