《臨床檢驗(yàn)儀器與技術(shù)》復(fù)習(xí)指導(dǎo)

1、【精品文檔】如有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除，僅供學(xué)習(xí)與交流臨床檢驗(yàn)儀器與技術(shù)復(fù)習(xí)指導(dǎo).精品文檔.臨床檢驗(yàn)儀器與技術(shù)復(fù)習(xí)提綱第六章 電泳儀器與技術(shù)一、發(fā)展歷程1809年，俄國科學(xué)家列伊斯，發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。1897，Kohlausch導(dǎo)出了帶電粒子移動(dòng)的理論公式。20世紀(jì)初，Hardy發(fā)現(xiàn)許多生物膠體粒子的遷移率取決于電解質(zhì)溶液的pH。1937年瑞典科學(xué)家Tiselius建立了界面電泳技術(shù)，證明了血清是由白蛋白、1、2、和蛋白組成，獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1950年后，區(qū)帶電泳從發(fā)展到成熟。1980年以來，毛細(xì)管電泳逐漸受到重視。二、基本原理不同的物質(zhì)，由于其帶電性質(zhì)、顆粒形狀和大小不同，因而在一定的

2、電場中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，因此可使它們分離。1、影響電泳速度的因素1）內(nèi)在因素從公式V = EQ/6r，我們認(rèn)識(shí)到：不同物質(zhì)顆粒具有不同的電泳速度；粒子的移動(dòng)速度(泳動(dòng)速度V)與電場強(qiáng)度(E)和粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度()成反比。2）外界因素A、電場強(qiáng)度B、溶液的pH值pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，顆粒所帶的電荷越多，電泳速度；蛋白質(zhì)電泳：pH8.2-8.8巴比妥或硼酸緩沖液核酸電泳：TAE、TBE、TPEC、溶液的離子強(qiáng)度I溶液的離子強(qiáng)度I，離子間的相互作用力越強(qiáng)，電泳速度D、溶液粘度粘度電泳速度E、吸附作用（介質(zhì)對(duì)樣品的滯留作用）吸附作用越強(qiáng)，電泳速度

3、三、常用電泳分析方法1、醋酸纖維素薄膜電泳電泳時(shí)經(jīng)過膜的預(yù)處理、加樣、電泳、染色、脫色與透明即可得到滿意的分離效果。此電泳的特點(diǎn)是分離速度快、電泳時(shí)間短、樣品用量少。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。2、瓊脂糖凝膠電泳以瓊脂糖為支持介質(zhì)進(jìn)行的電泳。具有大量微孔；較高的機(jī)械強(qiáng)度；無毒，不需要催化劑；具有熱可逆性，低熔點(diǎn)瓊脂糖回收樣品容易；生物中性，與別的生物材料結(jié)合性低；具有高靈敏度放射自顯影；膠凝溫度34-43。3、聚丙烯酰胺凝膠電泳以聚丙烯酰胺凝膠作為介質(zhì)，此凝膠機(jī)械強(qiáng)度好、彈性大、無電滲作用、分辨率高。具有濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)。其中的聚丙烯酰胺雙向電泳（2-DE）第一向

4、采用等電聚焦，根據(jù)復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分中各個(gè)蛋白質(zhì)的PI的不同，將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。第二向采用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳，按蛋白質(zhì)分子量的大小使其在垂直方向進(jìn)行分離。其結(jié)果不再是條帶狀，而是呈現(xiàn)為斑點(diǎn)狀。4、毛細(xì)管電泳是以柔性毛細(xì)管柱作為分離通道，以高壓直流電場作為驅(qū)動(dòng)力，對(duì)各種小分子、大分子或細(xì)胞等進(jìn)行高效分離、檢測或微量制備等有關(guān)技術(shù)的總稱。它具有熱效應(yīng)低；高效（每米塔板數(shù)為十萬、百萬、千萬）；高速（幾十秒內(nèi)完成）；高靈敏度、高分辨率（10-1910-21mol）；樣品用量少（進(jìn)樣體積僅為納升，樣品濃度低于10 -5mol/L）；毛細(xì)管內(nèi)徑很?。ㄒ话阈∮?00um）；應(yīng)用范圍廣（無機(jī)離

5、子到整個(gè)細(xì)胞）；重復(fù)性好；進(jìn)樣的準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)。第七章 流式細(xì)胞分析儀器與技術(shù)一、流式細(xì)胞術(shù)是一種對(duì)處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析和分選的技術(shù)。二、流式細(xì)胞儀包括液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、信號(hào)檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)分析與顯示系統(tǒng)和分選系統(tǒng)。1、液流系統(tǒng)由樣本和鞘液組成。樣本流和鞘液流分別在各自壓力系統(tǒng)作用下經(jīng)專門管道進(jìn)入流動(dòng)室。鞘液輔助樣本流，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔，保證被測細(xì)胞不會(huì)脫離液流的軸線方向并與激光正交。2、光路系統(tǒng)主要由激發(fā)光源的激光器和各種濾光片構(gòu)成。3、信號(hào)系統(tǒng)包括光電檢測器、放大電路和模數(shù)轉(zhuǎn)換器。受激發(fā)產(chǎn)生的光信號(hào)包括散射光

6、信號(hào)和熒光信號(hào)。散射光信號(hào)又分為前向角散射光（FSC）和側(cè)向角散射光(SSC)。FSC與細(xì)胞的大小有關(guān)；SSC與細(xì)胞的顆粒性及其內(nèi)部復(fù)雜程度有關(guān)，反映細(xì)胞內(nèi)的精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)等信息。光電檢測器包括光電二極管(photodiode)和光電倍增管(photomultiplier, PMT)，光電二極管光靈敏度低，用于測定強(qiáng)信號(hào)（如FSC）；PMT光靈敏度高，用于測定弱信號(hào)（如SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。電信號(hào)的放大一般可以使用線性或?qū)?shù)兩種方式。一般FSC和SSC變異范圍較小，故使用線性放大；而測定免疫細(xì)胞膜抗原等時(shí)，熒光信號(hào)變異范圍較大且光譜信號(hào)較為復(fù)雜，故多使用對(duì)數(shù)放大

7、。光信號(hào)經(jīng)PMT轉(zhuǎn)變?yōu)殡娮有盘?hào)時(shí)是以電子波形式被計(jì)算機(jī)系統(tǒng)接收而進(jìn)行分析，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可以根據(jù)電子波的高度、寬度和面積來反映光信號(hào)的大小，信號(hào)越強(qiáng)這三個(gè)參數(shù)值越大，一般以面積代表光信號(hào)的大小比用高、寬度更準(zhǔn)確，但有時(shí)可用高度表示信號(hào)大小，用寬度區(qū)分黏連的細(xì)胞。4、數(shù)據(jù)分析及顯示系統(tǒng)。標(biāo)準(zhǔn)的FCM數(shù)據(jù)采用列表模式，記錄了每個(gè)細(xì)胞的所有參數(shù)的信息。分析后數(shù)據(jù)主要通過流式圖的方式全面客觀的展示，最常用的是散點(diǎn)圖、偽彩圖、等高線圖、密度圖和假三維圖。5、分選系統(tǒng)由液滴形成、充電和偏轉(zhuǎn)三部分構(gòu)成。分選模式有純化模式、富集模式和單細(xì)胞模式。三、流式細(xì)胞儀主要性能指標(biāo)1、熒光靈敏度 200 MESF (FIT

8、C )；100 MESF (PE)；FSC檢測靈敏度：1m ；2、分辨率CV2%；3、表面標(biāo)志物檢測準(zhǔn)確性和重復(fù)性：測定值在給定范圍內(nèi)和CV10%。4、分析速度：一般為30006000個(gè)細(xì)胞/秒。5、分選指標(biāo)：1）分選速度：一般為1萬個(gè)細(xì)胞/秒左右2）分選純度：一般可以達(dá)到98%以上3）分選收獲率：一般可達(dá)95%以上4）其它指標(biāo)：在熒光線性方面，F(xiàn)CM熒光強(qiáng)度的線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.98；在儀器穩(wěn)定性方面，在環(huán)境溫度變化不超過設(shè)定溫度的5%時(shí)，8小時(shí)內(nèi)檢測FSC及所有熒光通道峰值的波動(dòng)范圍應(yīng)不超過10%；儀器的攜帶污染率應(yīng)不大于1%。四、操作流程第十一章 臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)儀器與技術(shù)一、免疫熒光

9、染色1、原理：將熒光素標(biāo)記在抗體上，免疫反應(yīng)結(jié)束后使用特定波長的激發(fā)光照射標(biāo)記的熒光素，熒光素吸收激發(fā)光的能量，產(chǎn)生可見的熒光。 時(shí)間分辨免疫熒光分析技術(shù)原理：鑭系元素的熒光壽命比非特異性熒光長，利用這一特點(diǎn)，使用鑭系三價(jià)稀土離子及其螯合物作為標(biāo)記物標(biāo)記抗體（或抗原）進(jìn)行免疫反應(yīng)，待反應(yīng)體系中血清、溶劑和其他成分的短壽命背景熒光完全衰變后，再測量鑭系元素的特異性熒光，以有效地降低本底熒光的干擾。這種技術(shù)稱時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）。 二、免疫比濁技術(shù)原理：當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時(shí)，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。利用現(xiàn)代光

10、學(xué)測量儀器對(duì)濁度進(jìn)行測定從而檢測抗原含量。1、透射免疫比濁法原理：抗原與抗體在一定緩沖液中形成IC，當(dāng)光線透過反應(yīng)溶液時(shí)，由于溶液內(nèi)IC粒子對(duì)光線的反射和吸收，引起透射光減少，IC越多透射光越少，可用吸光度表示。2、散射免疫比濁法原理：抗原抗體復(fù)合物對(duì)一定波長的光產(chǎn)生折射、偏轉(zhuǎn)，偏轉(zhuǎn)角度及散射光強(qiáng)度與復(fù)合物粒子的大小和量有關(guān)。三、酶聯(lián)免疫分析1、原理：是酶標(biāo)記固相免疫分析技術(shù)；抗體、抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)后，標(biāo)記的酶水解反應(yīng)底物而使之顯色；顯色程度與其濃度成一定關(guān)系，能對(duì)抗原（或抗體）進(jìn)行定性或定量。 2、酶標(biāo)儀的基本原理與結(jié)構(gòu) ：基本工作原理和主要結(jié)構(gòu)與光電比色計(jì)基本相同；相當(dāng)于專用于ELISA的

11、光電比色計(jì)或分光光度計(jì)。四、化學(xué)發(fā)光免疫分析1、基本原理：通過免疫反應(yīng)特異性地將待測組分從樣本中分離，再通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)顯示分離的組分，并且化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)強(qiáng)度與待測組分的含量成一定的比例關(guān)系。 2、過程：化學(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個(gè)部分, 即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。 免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記在抗原或抗體上, 經(jīng)過特異性免疫反應(yīng)后,形成抗原2抗體復(fù)合物。然后進(jìn)行對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行檢測, 來測定待檢物。 化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化, 形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體, 當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí), 同時(shí)發(fā)射出光子, 利用發(fā)光信號(hào)測量儀器光量子產(chǎn)率。 3、分類1）

12、化學(xué)發(fā)光酶免疫測定：將酶標(biāo)記于示蹤抗體上，再以酶催化底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。 2）化學(xué)發(fā)光免疫測定：用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。 常用標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物，通過啟動(dòng)發(fā)光試劑（NaOH和H2O2）作用而發(fā)光，強(qiáng)烈的直接發(fā)光在一秒內(nèi)完成，為快速的閃爍發(fā)光。 3）電化學(xué)發(fā)光免疫測定：是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特殊的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實(shí)際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程。4）光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)：抗體包被感光微球，抗原包被發(fā)光微球，抗體與抗原結(jié)合，感光微球在680nm激發(fā)光照射下，產(chǎn)生單線態(tài)氧擴(kuò)散至發(fā)光微球并傳遞能量，發(fā)光微球發(fā)射520620nm熒光信號(hào)；單線態(tài)氧的半

13、衰期只有4微秒（s），在反應(yīng)體系中只能擴(kuò)散大約200nm；發(fā)光的量與樣品中的待測抗原量成反比。第十四章 臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)常用儀器與技術(shù)一、PCR擴(kuò)增 PCR（polymerase chain reaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。近年來發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。1、基本原理：用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA片段，類似于天然DNA的復(fù)制過程。以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板5末端和3末端互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。 基

14、本反應(yīng)步驟分三步：高溫變性； 低溫退火；適溫延伸2、反應(yīng)體系1）緩沖液： 1050 mM Tris- HCl (pH8.4)：維持 Taq 酶作用環(huán)境的偏堿性。 2550 mM KCl：促進(jìn)引物退火，>50 mM 會(huì)抑制 Taq 酶的活性。 100g / ml 牛血清白蛋白 (BSA)：對(duì)酶有一定的保護(hù)性，如質(zhì)量不好將起相反的作用，建議使用乙?；?BSA。明膠、Tween-20、 二硫蘇糖醇 (DTT) 也有類似作用。 2）dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP底物，dNTP的質(zhì)量與濃度和 PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系。 0.020.2 mM，尤其是注意4種dNTP的濃

15、度要相等， 如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)，就會(huì)引起錯(cuò)配。3）MgCl2: 1.52.0 mM Taq 酶具有 Mg2+依賴性，顯著影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)量，在一般的 PCR反應(yīng)中，各種NTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0 mmol/L為宜。4）引物 (Primer-P)：0.2 1 M 預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵；PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度；理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用 PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。5）Taq DNA 聚合酶：耐高熱；0.55 U

16、 / 100 l 特點(diǎn)：以DNA為模板，從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點(diǎn)， 將4種脫氧核苷酸以堿基配對(duì)方式，按引物5-3的方向，合成新的DNA鏈；無Klenow 酶所具有的3-5外切酶活性，故無校正功能，錯(cuò)誤頻率為0.25，即在25輪循環(huán)后，其擴(kuò)增產(chǎn)物的順序中400個(gè)堿基可能出現(xiàn)一個(gè)篡改（錯(cuò)誤摻入）堿基。6）模板DNA：最低102105 bp DNA片段，實(shí)際用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過此量，用量需在實(shí)驗(yàn)中摸索。7）水：去離子水，補(bǔ)足整個(gè)反應(yīng)體積。3、普通PCR儀分類：1）水浴式PCR擴(kuò)增儀2）變溫金屬塊式PCR擴(kuò)增儀 ：主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是在同一個(gè)金屬塊上完成高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)溫度的交替變化。

17、3）變溫氣流式PCR擴(kuò)增儀：依據(jù)空氣氣流的動(dòng)力學(xué)原理，以冷熱氣流為介質(zhì)對(duì)PCR管進(jìn)行升降溫，實(shí)現(xiàn)三個(gè)溫度循環(huán)。 4）梯度PCR擴(kuò)增儀：梯度PCR擴(kuò)增儀的結(jié)構(gòu)與變溫金屬塊式PCR擴(kuò)增儀的結(jié)構(gòu)基本相同，在溫度控制環(huán)節(jié)增加了梯度功能。5）原位PCR擴(kuò)增儀：在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而組織細(xì)胞的形態(tài)不被破壞，它是原位雜交與PCR技術(shù)的結(jié)合。二、全自動(dòng)DNA測序儀1、工作原理：根據(jù)在某一固定的點(diǎn)開始核苷酸鏈的延伸，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生A、T、C、G四組不同長度的一系列核苷酸鏈，在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳進(jìn)行片段的分離和檢測，從而獲得DNA序列。 主要有：Sanger雙脫氧鏈末端終止法和Max

18、am-Gilber化學(xué)降解法。前者更簡便和更適合于光學(xué)自動(dòng)探測，故在全自動(dòng)DNA測序儀中應(yīng)用廣泛 2、雙脫氧鏈末端終止法1）測序原理：普通的PCR反應(yīng)體系中，加入的核苷酸單體為 4種2-脫氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）。ddNTP在脫氧核糖的位置上缺少一個(gè)羥基，反應(yīng)過程中雖然可以在DNA聚合酶作用下，通過其磷酸基團(tuán)與正在延伸的DNA鏈的末端脫氧核糖-OH發(fā)生反應(yīng)，形成磷酸二酯鍵而摻入到DNA鏈中，但它們本身沒有-OH，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，從而使正在延伸的DNA鏈在此終止。由于存在ddNTP與dNTP的競爭，生成的反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長度不同的多核苷酸片段。2）分類：多色熒光標(biāo)記法：包括熒光標(biāo)記引物法和熒光標(biāo)記終止底物法。熒光標(biāo)記引物法 v 定義：將熒光染料預(yù)先標(biāo)記在測序反應(yīng)所用引物的5端 v 一組（4種）熒光標(biāo)記引物，其序列相同，但標(biāo)記的熒光染料顏色不同v 測序反應(yīng)中，模板、反應(yīng)底物、DNA聚合酶及標(biāo)記引物等按A、T、C、G編號(hào)被置于4支微量離心管中，A、T、C、G四個(gè)測序反應(yīng)分管進(jìn)行，上樣時(shí)合并在一個(gè)泳道內(nèi)電泳。特定顏色熒光標(biāo)記的引物則與特定的雙脫氧核苷酸底物保持對(duì)應(yīng)關(guān)系 熒光標(biāo)記終止底物法v 定義：將熒光染料標(biāo)記在作為終止底物的雙脫氧單核