脂肪源干細(xì)胞修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損研究

1、脂肪源干細(xì)胞修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損研究         10-05-05 16:54:00     作者：李磊    編輯：studa20【摘要】  觀察評(píng)價(jià)兔膝關(guān)節(jié)髕股關(guān)節(jié)面中心人工制造全層關(guān)節(jié)軟骨缺損后，單純脂肪源干細(xì)胞復(fù)合海藻酸鈣凝膠移植到軟骨缺損處對(duì)關(guān)節(jié)全層軟骨缺損的修復(fù)效果，以探索關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)簡(jiǎn)單有效的途徑。方法新西蘭大白兔27只隨機(jī)分為A、B、C三組，A組關(guān)節(jié)軟骨缺損處置入海藻酸鈣凝膠，B組軟骨缺損處不做任何

2、處理，C組缺損處置入未經(jīng)誘導(dǎo)的脂肪源干細(xì)胞復(fù)合海藻酸鈣凝膠，分別于術(shù)后第4、8、12周處死動(dòng)物，通過(guò)大體、組織切片觀察以及透射電鏡等技術(shù)手段對(duì)修復(fù)效果進(jìn)行觀測(cè)，采用改良的Wakitani評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)修復(fù)組織進(jìn)行評(píng)分，所得評(píng)分采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果A、B組軟骨缺損處為纖維組織狀物填充，組織學(xué)切片可見(jiàn)為原纖維覆蓋，C組軟骨缺損處為類透明軟骨組織填充，組織切片可見(jiàn)類軟骨細(xì)胞及其周圍的陷窩，電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞周圍大量膠原纖維，C組在各個(gè)時(shí)期與A組、B組的評(píng)分比較差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，示C組修復(fù)效果較其他兩組為優(yōu)。結(jié)論單純脂肪源干細(xì)胞復(fù)合海藻酸鈣凝膠可有效修復(fù)

3、關(guān)節(jié)軟骨全層缺損。 【關(guān)鍵詞】  脂肪源干細(xì)胞 海藻酸鈣 軟骨    Abstract: ObjectiveTo evaluate the effect of not induced adipose derived stem cells(ADSCs)with calcium alginate healing full-thickness cartilage defects of rabbit knee after the model was made in center of femoral facies patellaris artificially,

4、 in order to find a simple and working way of articular cartilage defect restoration. MethodTwenty-seven New Zealand white rabbits were divided in to A, B, C groups randomly. Calcium alginate was transplanted to cartilage defect position of rabbits of group A, nothing for group B and calcium alginat

5、e with not induced ADSCs for group C. The animals were killed in 4th, 8th and 12th week later.Restored tissue was evaluated using naked eyes, histological section and transmission electron microscopy, score was given according to modified Wakitani grade standard. The total score was analyzed with st

6、atistic software SPSS 11.5. ResultArticular cartilage defects of the animal of groups A and B were filled with fibrous tissue which contains protofiber when it was checked using histological  section  and  microscopy.The  defect was filed with chondrocyte-like tissue .Chondrocyte

7、-like cells surrounded with lacunes were observed in histological section. Plenty of collagen fibers around cells could be seen under transmission electron microscopy. Group C had a significant statistical difference compared with groups A and B (P<0.01) in each period which showed that group C g

8、ot a better indication than other two groups.ConclusionNon-induced ADSCs with calcium alginate could repaire full-thickness cartilage defect of rabbit knee effectively.    Key  words：ADSCs;  calcium alginate;  cartilage    關(guān)節(jié)軟骨的自身修復(fù)能力有限，其損傷后的修復(fù)一直是骨科界的難題之一

9、。隨著干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和組織工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，多種組織工程方法被應(yīng)用來(lái)探索軟骨缺損治療的可行性。2001年Zuk PA和Zhu Min1等從人脂肪組織懸液中第一次分離獲得了多向分化干細(xì)胞。目前已證實(shí)脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞（adipose derived stem cells,ADSCs）能向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞及心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化2。本實(shí)驗(yàn)將單純脂肪源干細(xì)胞復(fù)合藻酸鈣凝膠載體填充修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行觀察分析，以探討單純脂肪源干細(xì)胞應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的可行性，為關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)探索簡(jiǎn)單有效的途徑。    1  材料和

10、方法    1.1  實(shí)驗(yàn)材料    (1)超凈工作臺(tái)(JHT-DDC型，濟(jì)南康寶凈化設(shè)備有限公司)；(2)恒溫孵育箱(Heraeus公司，德國(guó))；(3)倒置相差顯微鏡(Nikon TE2000，日本)；(4)50 ml培養(yǎng)瓶(Corning公司，美國(guó))；（5）低溫高速離心機(jī)（Heraeus公司，德國(guó)）。    (1)DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))；(2) 型膠原酶(Sigma公司，美國(guó))；(3)胰蛋白酶(上海華美公司，中國(guó))；(4)胎牛血清(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)；(5)D

11、-Hanks平衡鹽（Sigma公司，美國(guó)）；（6）海藻酸鈉（上海化學(xué)試劑站分裝廠）；（7）氯化鈣（上海生工生物工程有限公司）。    2  實(shí)驗(yàn)方法    2.1  脂肪源干細(xì)胞的獲取、培養(yǎng)和鑒定    將新西蘭大白兔致死，無(wú)菌取雙側(cè)髂窩處脂肪組織約10 ml，用2倍體積D-Hanks平衡鹽液漂洗3遍，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入0.2%型膠原酶5 ml置于37溫箱內(nèi)消化0.5 h，低溫高速離心機(jī)內(nèi)1 000 r/min離心10 min棄上清，加入16

12、0 mmol/L NH4Cl約5 ml裂解紅細(xì)胞10 min，篩網(wǎng)過(guò)濾，按8 000個(gè)/cm2種植于50 ml培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶置于37體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2恒溫孵育箱內(nèi)。24 h后首次換液，去除殘余紅細(xì)胞及未貼壁細(xì)胞，后每隔23 d換液一次，融合達(dá)80%以上時(shí)傳代，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞傳至第4代。取部分2代細(xì)胞采用含10%FBS，0.1 mol/L地塞米松，50 mol/L維生素C，10 mmol/L -甘油磷酸鈉，100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基向成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)。    2.2  動(dòng)物實(shí)驗(yàn)   

13、; 選擇健康成年新西蘭大白兔27只（購(gòu)自山東魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體重2.53.5 kg，雌雄不限。編號(hào)后隨機(jī)分成A、B、C 3組，每組9只，雙膝均用于實(shí)驗(yàn)。10%水合氯醛耳緣靜脈麻醉，取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口，將髕骨推向外側(cè)，進(jìn)入關(guān)節(jié)腔。分別于左右兩側(cè)用直徑3.5 mm的鉆頭在髕股關(guān)節(jié)面中心造成全厚關(guān)節(jié)軟骨缺損，深度以點(diǎn)狀出血為止，約2.5 mm。A組：（18膝）缺損處單純置入海藻酸鈣凝膠。B組：（18膝），空白對(duì)照，缺損處不作任何處理。C組：（18膝），置入培養(yǎng)的脂肪源干細(xì)胞海藻酸鈣凝膠復(fù)合物，細(xì)胞最終濃度不低于2.0×106 ml。術(shù)畢兔清醒后，放置籠內(nèi)自由活動(dòng)，青霉素肌注連續(xù)5 d

14、。    2.3  檢測(cè)方法    生物學(xué)特性觀察：觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；取部分2代細(xì)胞制成細(xì)胞爬片做油紅O染色；另取部分向成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)的2代細(xì)胞制成細(xì)胞爬片做Von Kossa染色觀察礦化結(jié)節(jié)，以證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞有無(wú)干細(xì)胞特性。    分別于術(shù)后4、8、12周處死動(dòng)物，取材行大體、光鏡組織學(xué)檢查及電子顯微鏡下觀察。(1)大體觀察：膝關(guān)節(jié)滑膜有無(wú)充血水腫，關(guān)節(jié)囊有無(wú)粘連及修復(fù)組織的平整度、光澤度；(2)組織學(xué)檢測(cè)：將標(biāo)本脫鈣、梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色和甲苯胺蘭染色，進(jìn)行光鏡下組織

15、學(xué)觀察；（3）透射電鏡觀察：取12周修復(fù)組織，包埋后超薄切片，觀察細(xì)胞及基質(zhì)情況。    2.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析    根據(jù)改良的Wakitani評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)表1)采用盲法對(duì)各標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。每一標(biāo)本均有3人進(jìn)行評(píng)分，取均數(shù)，所得評(píng)分結(jié)果應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多因素方差分析，與對(duì)照組比較采用Dunnett檢驗(yàn)。表1  軟骨缺損修復(fù)的組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)組織學(xué)表現(xiàn)評(píng)分   3  結(jié)果    3.1  脂肪源干細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)