蠶豆細(xì)胞微核檢測(cè)亞硝酸鹽的遺傳毒性

1、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1了解微核測(cè)試的原理和毒理遺傳學(xué)在實(shí)際生活與工作中的應(yīng)用范圍及意義2學(xué)習(xí)蠶豆根尖的微核測(cè)試技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理 微核（micronucleus, 簡(jiǎn)稱MCN），也叫衛(wèi)星核，是真核類生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，是染色體畸變?cè)陂g期細(xì)胞中的一種表現(xiàn)形式。微核往往是各種理化因子，如輻射、化學(xué)藥劑對(duì)分裂細(xì)胞作用而產(chǎn)生的。在細(xì)胞間期，微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小應(yīng)在主核1/3以下。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣，也具合成DNA的能力。一般認(rèn)為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片產(chǎn)生的。有實(shí)驗(yàn)證明，整條染色體或幾條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在分裂過(guò)程中行動(dòng)滯后，

2、在分裂末期不能進(jìn)入主核，便形成了主核之外的核塊。當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時(shí)，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核。已經(jīng)證實(shí)，微核率的大小是和作用因子的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，這一點(diǎn)與染色體畸變的情況一樣。蠶豆根尖微(micronucleus，MCN)技術(shù)是一種檢測(cè)化學(xué)品對(duì)生物毒害的遺傳毒理學(xué)方法。不僅具有簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好和靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，而且其檢測(cè)結(jié)果與動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果具有很高的一致性。 亞硝酸鹽廣泛存在于自然環(huán)境(水體、土壤、植物)中，許多腌制食品中亦含有亞硝酸鹽。在胃酸等環(huán)境下亞硝酸鹽與食物中的仲胺、叔胺和酰胺或蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物等反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物N_亞硝胺。亞硝胺還能夠透過(guò)胎盤進(jìn)入

3、胎兒體內(nèi)，對(duì)胎兒有致畸作用。硝酸鹽和亞硝酸鹽作為化學(xué)物質(zhì)的毒害性多有研究，但把蠶豆根尖細(xì)胞微核技術(shù)用于食品添加劑的安全評(píng)價(jià)和檢測(cè)其對(duì)生物體誘變效應(yīng)的遺傳毒理性試驗(yàn)卻未見報(bào)道。NaNO2對(duì)蠶豆根尖的微核效應(yīng)，由此證明蠶豆可以作為快速、靈敏檢測(cè)食品中亞硝酸鹽遺傳毒性的供試材料。三、實(shí)驗(yàn)材料蠶豆種子、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、濾紙、NaNO2 蒸餾水卡納氏固定液（3甲醇：1冰醋酸）改良苯酚品紅溶液四、實(shí)驗(yàn)過(guò)程1、被測(cè)試劑的配制與分組 用蒸餾水將NaN02配制成001、002、004、008 mmol/L 4種不同的濃度；另設(shè)蒸餾水做對(duì)照(CK)組。另設(shè)蒸餾水做對(duì)照(CK)組。最后對(duì)應(yīng)分成5組。

4、2 、浸種、催芽選取籽粒飽滿、大小一致的蠶豆種子洗凈后，放入盛有蒸餾水的燒杯中，25下浸泡24 h 期間換水2次。待種子吸脹后，用紗布包裹置于培養(yǎng)皿中，在25恒溫生化培養(yǎng)箱中催芽24 h，至初生根長(zhǎng)至2 cm左右。3、染毒選取發(fā)育良好，大小與根近似的蠶豆幼苗，將幼苗分別放入盛有不同濃度NaNO3和不同濃度NAN02溶液的培養(yǎng)皿中，染毒6 h。然后用蒸餾水清洗根尖35次，換人新鮮蒸餾水培養(yǎng)24 h。同時(shí)用蒸餾水設(shè)立空白對(duì)照組。4、 根尖細(xì)胞固定切取根尖1 cm，用新配的卡諾氏固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)固定24 h，固定材料可經(jīng)95酒精和70酒精各處理05 h，然后放入70酒精中，在4冰箱中保

5、存(保存時(shí)間不超過(guò)2個(gè)月)。5、 解離從固定液中取出蠶豆根尖，用蒸餾水漂洗，再放到010 molL HC1中，在60 水浴中處理15 min，再用45的醋酸處理10 min，使根尖軟化。6、 染色和壓片取處理好的根尖用蒸餾水漂洗后，置于載玻片上，用吸水紙吸去多余的液體，用刀片將根尖的分生組織切下并切碎，加12滴改良的苯酚一堿性品紅染色20 min，采用十字壓片法制片。7、鏡檢及微核識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)制片后，將玻片標(biāo)本放在顯微鏡的低倍鏡下觀察，找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散良好、核膨大、分裂相多的部分轉(zhuǎn)到高倍鏡下進(jìn)行觀察。微核識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)：（1）在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。（2）小核著色與主核相當(dāng)或稍淺。（3）小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則型。每一處理觀察3個(gè)根尖，每個(gè)根尖計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞中的微核數(shù)并進(jìn)行記錄。五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和污染程度劃分將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按一下步驟進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理：1計(jì)算各測(cè)試樣品（包括對(duì)照組）微核千分率（MCN）如果對(duì)照本底MCN為10以下，可采用如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析以確定樣品的污染程度：MCN在10以下，表示基本沒(méi)有污染；MCN在1018區(qū)間，則表示有輕度污染；MCN大于30，表示有重度污染；2.也可以計(jì)算各測(cè)試樣品（包括對(duì)照組）污染指數(shù)污染指數(shù)PI=實(shí)測(cè)微核率/對(duì)照組微核率PI<1.5 無(wú)污染1.5&l