動(dòng)物組織基因組DNA的提取（課堂PPT）

1、.1實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三動(dòng)物組織基因組動(dòng)物組織基因組DNA的提取的提取王翠芳2017-3-29.2實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?.實(shí)驗(yàn)原理（核酸分離純化）實(shí)驗(yàn)原理（核酸分離純化）2.實(shí)驗(yàn)儀器、試劑和耗材實(shí)驗(yàn)儀器、試劑和耗材3.實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論5.動(dòng)物組織基因組動(dòng)物組織基因組DNA的提取的提取.3一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膎從小鼠尾巴中提取純的基因組從小鼠尾巴中提取純的基因組DNA;n掌握基因組掌握基因組DNA抽提的辦法，抽提的辦法，理解核酸分離純化的基本原理；理解核酸分離純化的基本原理；.4二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理nDNA：主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也主要存在于細(xì)胞核的染色體中

2、。核外也有少量有少量DNA，如線粒體，如線粒體DNA（mtDNA）、葉）、葉綠體綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒），質(zhì)粒DNA。nRNA：存在于細(xì)胞質(zhì)中，如存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA，rRNA，tRNA等。等。1 1、核酸的分類、核酸的分類.5二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理n分離純化核酸總的原則：分離純化核酸總的原則： 應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性； 排除其它分子的污染；排除其它分子的污染；n核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求： 核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；溶劑和過高濃度的金屬離子； 其它生物大

3、分子的污染應(yīng)降到最低程度；其它生物大分子的污染應(yīng)降到最低程度； 排除其它核酸分子的污染；排除其它核酸分子的污染；2 2、核酸制備的一般原則、核酸制備的一般原則.6二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理n核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)：核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)： 盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程；盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程； 減少化學(xué)因素對(duì)核酸的講解；減少化學(xué)因素對(duì)核酸的講解； 減少物理因素的核酸的講解：機(jī)械剪切力和減少物理因素的核酸的講解：機(jī)械剪切力和高溫；高溫； 防止核酸的生物講解；防止核酸的生物講解；2 2、核酸制備的一般原則、核酸制備的一般原則.7二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理降低溫度，改變降低溫度，改變pH值，及

4、鹽的濃度，都利于對(duì)值，及鹽的濃度，都利于對(duì)核酸酶活性的抑制，但均不如用核酸酶抑制劑更核酸酶活性的抑制，但均不如用核酸酶抑制劑更有利，幾個(gè)條件并用更好。有利，幾個(gè)條件并用更好。DNA，抑制，抑制Dnase活力很容易，但活力很容易，但防止機(jī)械拉防止機(jī)械拉力張力更重要力張力更重要；RNA，因分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但，因分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但抑制抑制Rnase活力較難，故在活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制提取中設(shè)法抑制Rnase更重要更重要。3 3、核酸酶的抑制和抑制劑、核酸酶的抑制和抑制劑.8二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理nDnase抑制：抑制： 加入少量金屬離子螯合劑，如加入少量金屬

5、離子螯合劑，如0.01 mol/L EDTA或檸檬酸鈉，或檸檬酸鈉，Dnase基本可以全部失活；基本可以全部失活； 去垢劑、蛋白變性劑及去垢劑、蛋白變性劑及Dnase抑制劑也可使抑制劑也可使Dnase失活；失活；3 3、核酸酶的抑制和抑制劑、核酸酶的抑制和抑制劑.9二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理nRNase抑制：抑制： 操作要帶手套；操作要帶手套； 所有器皿要嚴(yán)格消毒；所有器皿要嚴(yán)格消毒； 試劑處理；試劑處理； 低溫操作；低溫操作； 在分離過程中要加入一定的在分離過程中要加入一定的Rnase抑制劑抑制劑3 3、核酸酶的抑制和抑制劑、核酸酶的抑制和抑制劑.10二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理4 4、核酸制備中

6、常用的、核酸制備中常用的去垢劑去垢劑核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)，核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)，用于核酸提取的去垢劑一般都是陰離子去垢劑，用于核酸提取的去垢劑一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：去垢劑的作用： 溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂； 溶解核糖體上面的蛋白，使其解聚，將核酸溶解核糖體上面的蛋白，使其解聚，將核酸釋放出來；釋放出來； 對(duì)對(duì)Rnase和和Dnase有一定的抑制作用；有一定的抑制作用；如如: SDS，脫氧膽酸鈉，脫氧膽酸鈉，4-氨基水楊酸鈉，萘氨基水楊酸鈉，萘-1，5-二磺酸鈉二磺酸鈉等等.11二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理5 5

7、、核酸制備中常用的蛋、核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑白質(zhì)變性劑蛋白質(zhì)變性劑的作用：蛋白質(zhì)變性劑的作用： 使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白質(zhì)污染；除去，以防造成蛋白質(zhì)污染； 使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸；酸； 某些蛋白質(zhì)變性劑也可抑制某些蛋白質(zhì)變性劑也可抑制Rnase活性和破活性和破裂細(xì)胞的作用；裂細(xì)胞的作用；如：如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC.12二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理6 6、核酸制備的步驟、核酸制備的步驟破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞提取提取純化純化.13二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)

8、驗(yàn)原理6 6、核酸制備的步驟、核酸制備的步驟破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞 微生物：溶酶菌、微生物：溶酶菌、SDS裂解；裂解； 高等植物：搗碎器破碎、液氮研高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。磨。 酶法酶法蛋白酶、胰蛋白酶；蛋白酶、胰蛋白酶； 冰凍法冰凍法 反復(fù)凍融或液氮凍后反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎；組織搗碎； 動(dòng)物：液氮處理后用勻漿器破碎；動(dòng)物：液氮處理后用勻漿器破碎；以上處理時(shí)均要以上處理時(shí)均要加入核酸酶抑制劑加入核酸酶抑制劑。.14二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理6 6、核酸制備的步驟、核酸制備的步驟 首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離；病毒的核蛋白與其它成分

9、分離； 使核酸與蛋白質(zhì)分離；使核酸與蛋白質(zhì)分離； 除去脂類；除去脂類； 多糖的除去；多糖的除去；破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞提取提取.15二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理6 6、核酸制備的步驟、核酸制備的步驟根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污染，并除去其它提取過程中的核酸污染，并除去其它提取過程中的一系列試劑（鹽、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)，一系列試劑（鹽、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。最后得到均一的核酸樣品。破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞提取提取純化純化.16二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理7 7、核酸樣品的保存、核酸樣品的保存核酸保存的主要條件是核酸保存的主要條件是溫度溫度和和介質(zhì)介質(zhì)溫度：溫

10、度： 4 最佳最簡(jiǎn)單；最佳最簡(jiǎn)單； -70長(zhǎng)期保存的良好溫度；長(zhǎng)期保存的良好溫度； -20 ；保存介質(zhì)：保存介質(zhì)：TE緩沖液（最常用）緩沖液（最常用） 10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 1mmol/L EDTA pH 8.0.17三、實(shí)驗(yàn)試劑、儀器和耗材三、實(shí)驗(yàn)試劑、儀器和耗材材料：材料：小鼠尾巴小鼠尾巴儀器：儀器：離心機(jī)、各種規(guī)格移液器、無(wú)離心機(jī)、各種規(guī)格移液器、無(wú)菌移液器吸頭、分光光度計(jì)菌移液器吸頭、分光光度計(jì)試劑：試劑：組織基因組組織基因組DNA提取試劑盒提取試劑盒 無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇.18四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 在液氮中將組織塊研磨粉碎；在液氮中將組織塊研磨粉碎； 取不

11、多于取不多于50 mg磨碎的組織，放入磨碎的組織，放入1.5或或2.0 ml離心離心管中。注意：樣本的磨碎程度將影響裂解效果。管中。注意：樣本的磨碎程度將影響裂解效果。 加入加入600ul的的FL Buffer和和10ul PK solution，混合，混合均勻。注意混合充分將有助于裂解。均勻。注意混合充分將有助于裂解。 于于56溫浴溫浴15min（如果組織較難裂解完全，可（如果組織較難裂解完全，可以適當(dāng)延長(zhǎng)溫浴時(shí)間，甚至過夜）。然后以適當(dāng)延長(zhǎng)溫浴時(shí)間，甚至過夜）。然后14000g離離心心3min。 取取500ul上清液，至新的上清液，至新的2.0ml離心管中。離心管中。.19四、實(shí)驗(yàn)步驟四、

12、實(shí)驗(yàn)步驟 加入加入700ul binding buffer和和300ul無(wú)水乙醇，顛倒無(wú)水乙醇，顛倒混勻；混勻； 將混合液轉(zhuǎn)移至將混合液轉(zhuǎn)移至Spin Colomn。于。于10000g離心離心1min，并棄去接液管中的液體。由于混合液體積大，并棄去接液管中的液體。由于混合液體積大于于750ul，請(qǐng)分兩次離心過柱。，請(qǐng)分兩次離心過柱。 向向Spin colomn中加入中加入500ul的的PW Buffer。于。于10000g離心離心30s，并棄去接液管中液體。，并棄去接液管中液體。 向向Spin colomn中加入中加入600ul的的Wash Bufer。于。于10000g離心離心30s，并棄去接液管中液體。，并棄去接液管中液體。 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟9。.20四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟11 再次將再次將Spin Colomn于于10000g離心離心1min，并將，并將Spin Colomn轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5ml離心管；離心管；12 向向Spin colomn中加入中加入100ul-200ul Elution Buffer, 并于室溫放置并于室溫放置1min。13 10000g離心離心1min，并棄去，并棄去Spin Colomn, 1.5 ml離離心管中液體含有心管中液體含有DNA。.21五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)檢測(cè)DNA