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認(rèn)證類型：個(gè)人認(rèn)證

認(rèn)證主體：馬**（實(shí)名認(rèn)證）

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IP屬地：廣東 上傳時(shí)間：2022-03-05 格式：DOC 頁(yè)數(shù)：11 大小：106KB 積分：12 舉報(bào) 版權(quán)申訴

1、基因定點(diǎn)突變?nèi)ヂ砸弧⒍c(diǎn)突變的目的把目的基因上面的一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基。二、定點(diǎn)突變的原理定點(diǎn)突變是指通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。定點(diǎn)突變能快速、高效的提高DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征，是基因爭(zhēng)辯工作中一種格外有用的手段。 體外定點(diǎn)突變技術(shù)是爭(zhēng)辯蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的簡(jiǎn)單關(guān)系的有力工具，也是試驗(yàn)室中改造/優(yōu)化基因常用的手段。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)打算其功能，二者之間的關(guān)系是蛋白質(zhì)組爭(zhēng)辯的重點(diǎn)之一。對(duì)某個(gè)已知基因的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)轉(zhuǎn)變、缺失或者插入，可以轉(zhuǎn)變對(duì)應(yīng)的氨基

2、酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對(duì)突變基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行爭(zhēng)辯有助于人類了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，探討蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/結(jié)構(gòu)域。而利用定點(diǎn)突變技術(shù)改造基因：比如野生型的綠色熒光蛋白（wtGFP）是在紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出微弱的綠色熒光，經(jīng)過(guò)對(duì)其發(fā)光結(jié)構(gòu)域的特定氨基酸定點(diǎn)改造，現(xiàn)在的GFP能在可見(jiàn)光的波長(zhǎng)范圍被激發(fā)（吸取區(qū)紅移），而且發(fā)光強(qiáng)度比原來(lái)強(qiáng)上百倍，甚至還消滅了黃色熒光蛋白，藍(lán)色熒光蛋白等等。定點(diǎn)突變技術(shù)的潛在應(yīng)用領(lǐng)域很廣，比如爭(zhēng)辯蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)、改造酶的不同活性或者動(dòng)力學(xué)特性，改造啟動(dòng)子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是穩(wěn)定性、活性、爭(zhēng)辯蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，以及藥物研發(fā)、基因治療等等方面。

3、 通過(guò)設(shè)計(jì)引物，并利用PCR將模板擴(kuò)增出來(lái)，然后去掉模板，剩下來(lái)的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過(guò)來(lái)了，然后再轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，再測(cè)序確定就行了。三、引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)的一般原則不再重復(fù)。突變引物設(shè)計(jì)的特殊原則：（1）通常引物長(zhǎng)度為2545 bp，我們建議引物長(zhǎng)度為3035 bp。一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長(zhǎng)度至少為11-12 bp。若兩邊引物太短了，很可能會(huì)造成突變?cè)囼?yàn)失敗，由于引物至少要11-12個(gè)bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設(shè)至少12個(gè)bp，并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物。 （2）假如設(shè)定的

4、引物長(zhǎng)度為30 bp，接下來(lái)需要計(jì)算引物的Tm值，看是否達(dá)到78（GC含量應(yīng)大于40%）。 （3）假如Tm值低于78，則適當(dāng)轉(zhuǎn)變引物的長(zhǎng)度以使其Tm值達(dá)到78（GC含量應(yīng)大于40%）。 （4）設(shè)計(jì)上下游引物時(shí)確保突變點(diǎn)在引物的中心位置。 （5）最好使用經(jīng)過(guò)純化的引物。       Tm值計(jì)算公式：Tm=0.41×(% of GC)675/L+81.5 注：L：引物堿基數(shù)；% of GC：引物GC含量。四、引物設(shè)計(jì)實(shí)例以GCGACG為例：5-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3（1）首先設(shè)

5、計(jì)30 bp長(zhǎng)的上下游引物，并將A (T)設(shè)計(jì)在引物的中心位置。Primer #1: 5-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3 Primer #2: 5-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3（2）引物GC含量為40%，L為30，將這兩個(gè)數(shù)值帶入Tm值計(jì)算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通過(guò)計(jì)算可以看出其Tm低于78，這樣的引物是不合適的，所以必需調(diào)整引物長(zhǎng)度。（3）重新調(diào)整引物長(zhǎng)度。Primer #1: 5-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3 P

6、rimer #2: 5-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3在引物兩端加5mer（斜體下劃線處），這樣引物的GC含量為45.7%，L值為35，將這兩個(gè)數(shù)值帶入Tm值計(jì)算公式，得到其Tm為80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），這樣的引物就可以用于突變?cè)囼?yàn)了。五、突變所用聚合酶及Buffer引物和質(zhì)粒都預(yù)備好后，當(dāng)然就是做PCR嘍，不過(guò)對(duì)于PCR的酶和buffer，不能用平常的，我們做PCR把整個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)出來(lái)，延長(zhǎng)長(zhǎng)度達(dá)到幾個(gè)K，所以要用那些GC buffer或擴(kuò)增長(zhǎng)片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來(lái)擴(kuò)增

7、，防止引進(jìn)新的突變。除了使用基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，如Stratagene和塞百盛的試劑盒，但價(jià)格昂貴。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase。六、如何去掉PCR產(chǎn)物最簡(jiǎn)潔的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來(lái)的質(zhì)粒一般都被甲基化愛(ài)護(hù)起來(lái)（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產(chǎn)物都是沒(méi)有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質(zhì)粒）而不會(huì)影響PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌株肯定不能是甲基化缺陷株

8、。DpnI處理的時(shí)間最好長(zhǎng)一點(diǎn)，最少一個(gè)小時(shí)吧，最好能有兩三個(gè)小時(shí)，由于假如模板處理得不潔凈，哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長(zhǎng)出來(lái)，就會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。七、如何拿到質(zhì)粒直接把通過(guò)DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了，然后再篩選出陽(yáng)性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測(cè)序，驗(yàn)證突變結(jié)果。八、圖示九、定點(diǎn)突變操作步驟A 誘導(dǎo)突變基因（PCR反應(yīng)）以待突變的質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)的引物及Muta-direct酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，誘導(dǎo)目的基因突變。1. 設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物。  注參考引物設(shè)計(jì)指導(dǎo)2. 預(yù)備模板質(zhì)粒DN A注用dam+型菌株（例如DH5菌株）作為宿主菌。在end+型菌株中常有克隆數(shù)低的現(xiàn)

9、象，但是對(duì)突變效率沒(méi)有影響。提取質(zhì)粒DNA時(shí)我們建議您使用本公司的質(zhì)粒提純?cè)噭┖小?. 選項(xiàng)對(duì)比反應(yīng)體系（50l反應(yīng)體系）10×Reaction Buffer5lpUC18 control plasmid（10ng/l，total 20ng）2lControl primer mix（20pmol/l）2ldNTP mixture（each 2.5mM）2ldH2O 38lMuta-direct Enzyme1l4. 樣品反應(yīng)體系（50l反應(yīng)體系）10×Reaction Buffer5lSample plasmid（10ng/l，total 20ng） 2lSamp

10、le primer (F)（10pmol/l）1lSample primer (R)（10pmol/l）1ldNTP mixture（each 2.5mM）2ldH2O38lMuta-direct Enzyme1l5. PCR反應(yīng)條件注按如下參數(shù)設(shè)置PCR擴(kuò)增條件。CyclesTemperature Reaction Time1cycle95 30sec15cycle9530sec551min721min per plasmid Kb6. PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后冰育5分鐘，然后置于室溫（避開(kāi)反復(fù)凍融）。注 按下列供應(yīng)的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，把握PCR循環(huán)數(shù)。留意當(dāng)突變點(diǎn)位點(diǎn)超過(guò)4個(gè)時(shí)會(huì)發(fā)生突變率降

11、低的現(xiàn)象。MutationCycles 12Nucleotide15cycles3Nucleotides18cyclesB 突變質(zhì)粒選擇PCR反應(yīng)結(jié)束后使用Mutazyme酶消化甲基化質(zhì)粒從而選擇突變質(zhì)粒DNA。1. 預(yù)備PCR反應(yīng)產(chǎn)物2. 加入1l（10U/l）Mutazyme酶37溫育1小時(shí)。注當(dāng)質(zhì)粒DNA用量過(guò)多時(shí)Mutazyme酶可能發(fā)生與樣品反應(yīng)不完全的現(xiàn)象。因此我們建議為了保證突變率請(qǐng)嚴(yán)格遵照試驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。假如突變率低，可以適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或增加Mutazyme酶用量。C轉(zhuǎn)化反應(yīng)完畢后在質(zhì)粒DNA上會(huì)產(chǎn)生缺口，當(dāng)把這個(gè)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入E.coli中時(shí)請(qǐng)選擇dam+型菌株，例如DH

12、5。1. 將10l樣品加到50l感受態(tài)細(xì)胞里，然后放置在冰上30分鐘。 2. 接下來(lái)可以參照一般的轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行。序列分析通常當(dāng)LB平板上出白色菌落則表明發(fā)生了突變。 為了證明這一結(jié)果，我們建議對(duì)白色單菌落進(jìn)行測(cè)序分析。先講最簡(jiǎn)潔的一個(gè)點(diǎn)的定點(diǎn)突變技術(shù)，其它較長(zhǎng)片段的突變，刪除，插入技術(shù)以后會(huì)漸漸奉上：在做試驗(yàn)之前，我們首先要搞清楚試驗(yàn)的目的和試驗(yàn)的原理。 試驗(yàn)的目的應(yīng)當(dāng)比較明確吧：就是要把自己的基因上面的一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基。一般狀況下我們會(huì)有幾種可能使我們需要這樣去做：第一：我們吊出來(lái)的基因有點(diǎn)突變，信任這可能是大家經(jīng)常會(huì)遇到的問(wèn)題。基因好不簡(jiǎn)潔吊出來(lái)，并裝進(jìn)了自己的載體，卻發(fā)覺(jué)有一兩個(gè)

13、堿基跟自己的預(yù)期序列或全部的公共數(shù)據(jù)庫(kù)不匹配，然后暴昏。 大家試驗(yàn)室里面還是用Taq酶為主吧，Pfu這樣的高保真酶大家應(yīng)當(dāng)用得不多吧，Taq酶的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)都很明顯：優(yōu)點(diǎn)就是擴(kuò)增效能強(qiáng)，缺點(diǎn)就是保真性差，其錯(cuò)配機(jī)率是比較高的，相關(guān)數(shù)字忘了，大家可以去網(wǎng)上查那個(gè)數(shù)字，不過(guò)感覺(jué)假如是2000bp的基因，假如擴(kuò)四五十個(gè)循環(huán)的話，很大機(jī)率會(huì)消滅點(diǎn)突變，當(dāng)然這也跟具體PCR體系里的Buffer有很大關(guān)系，具體狀況這里就不爭(zhēng)辯了。其次：要爭(zhēng)辯基因的功能，在基因上自己選定位置更換堿基的保守序列，或者改造成不同的亞型，總之就是要人工改造堿基序列符合自己的試驗(yàn)需要，信任這也是那些爭(zhēng)辯基因的人經(jīng)常的一種思路吧。 對(duì)

14、于第一種狀況：我們首先要分析消滅堿基不匹配的位置是不是重要的位置，假如不是很重要，大可不必管它，比如說(shuō)是三聯(lián)密碼子的最終一位，堿基的轉(zhuǎn)變并沒(méi)有引起相應(yīng)氨基酸的轉(zhuǎn)變，那么一般狀況下也可以不去理它。另外，在NCBI上人類的基因的版本始終在變化，也就是說(shuō)同一個(gè)基因有不同的版本，或者稱不同的亞型，其堿基序列有些許的差異，只要自己克隆出來(lái)的堿基序列與其中一個(gè)相匹配，一般也就可以不做定點(diǎn)突變了。假如有時(shí)間沒(méi)錢(qián)，那干脆重新PCR然后再克隆進(jìn)自己的載體了，不過(guò)最好換個(gè)保真性好一點(diǎn)的酶如PFU，或者PCR循環(huán)數(shù)低一點(diǎn)，不過(guò)這些東西有時(shí)候也得靠運(yùn)氣啦。實(shí)在不行的話再來(lái)做定點(diǎn)突變。對(duì)于其次種狀況：這種狀況下一般也就

15、只能做定點(diǎn)突變了。 接下來(lái)開(kāi)頭聊一聊定點(diǎn)突變的原理吧，那個(gè)Stratagene試劑盒！上面有一個(gè)說(shuō)明書(shū)，說(shuō)得好像很正規(guī)，不過(guò)上面好多都是什么專利啊什么留意之類的話，看都不看，我們簡(jiǎn)明扼要地只講試驗(yàn)方面，通過(guò)設(shè)計(jì)引物，并利用PCR將模板擴(kuò)增出來(lái)，然后去掉模板，剩下來(lái)的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過(guò)來(lái)了，然后再轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，再測(cè)序確定就行了。大家馬上就會(huì)想到幾個(gè)問(wèn)題了：第一：引物怎么設(shè)計(jì)呢？其次：模板怎么去掉呢？第三：怎么拿到質(zhì)粒呢？對(duì)于第一個(gè)問(wèn)題：怎么設(shè)計(jì)引物？我只能講一些原則，并舉一些例子。引物設(shè)計(jì)的原則其它貼子上都有講，這里就不重復(fù)了：不過(guò)這種突變引物要加上一個(gè)

16、原則： 一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長(zhǎng)度至少為11-12base pair。 若兩邊引物太短了，很可能會(huì)造成突變?cè)囼?yàn)失敗，大家應(yīng)當(dāng)都知道，引物至少要11-12個(gè)base pair才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設(shè)至少12個(gè)base pair，并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物。這么說(shuō)大家可能不是很清楚，那我就舉個(gè)例子吧：X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960現(xiàn)有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGA

17、ATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924* *|-deletion X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020現(xiàn)有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984（上面為目的序列，下面為現(xiàn)有序列：我們發(fā)覺(jué)有一個(gè)A堿基的缺失，其直接結(jié)果是在表達(dá)蛋白時(shí)后面的氨基酸全部錯(cuò)配） 我們以它為中心設(shè)計(jì)引物：兩邊各至少12個(gè)堿基，左邊由于含有較多的A造成引物GC%含量過(guò)低，故拉長(zhǎng)引物使GC%含量

18、不至過(guò)低，也使引物退火溫度上升。故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG并合成反向互補(bǔ)引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG 其實(shí)也不肯定要反向互補(bǔ)序列，只要反向引物也是兩邊都有大于12個(gè)堿基，同時(shí)符合引物設(shè)計(jì)的原則就行了。 引物合成公司有很多家，大家可以去查找，不同廠家的引物在價(jià)錢(qián)質(zhì)量上有一些差別，不過(guò)價(jià)錢(qián)一般都是一塊多一個(gè)堿基，合成時(shí)間約為一周。 這樣的結(jié)果是PCR時(shí)把整個(gè)質(zhì)粒都給擴(kuò)出來(lái)了，得到的PCR產(chǎn)物是一條鏈完整，另一鏈有缺刻的PCR產(chǎn)物對(duì)于其次個(gè)問(wèn)題： 怎么去掉模板呢？再簡(jiǎn)潔的方法就是用Dp

19、nI酶，DpnI能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來(lái)的質(zhì)粒一般都被甲基化愛(ài)護(hù)起來(lái)（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產(chǎn)物都是沒(méi)有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質(zhì)粒）而不會(huì)影響PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌株肯定不能是甲基化缺陷株，不會(huì)那么湊巧吧，哈哈。關(guān)于第三個(gè)問(wèn)題： 直接把通過(guò)DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了，呵呵，然后再篩選出陽(yáng)性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測(cè)序（這個(gè)就不用我多說(shuō)了吧），驗(yàn)證突變結(jié)果，一般都沒(méi)問(wèn)題的啦，我做了幾十個(gè)突變了，到目前為止還沒(méi)有做不出來(lái)的，呵呵，不要砸我啊。下面講

20、一下具體的試驗(yàn)步驟以及一些試驗(yàn)中要留意的事情：1、 依據(jù)現(xiàn)有基因設(shè)計(jì)引物；2、 合成引物并預(yù)備好模板；3、 PCR，4、 DpnI處理酶切產(chǎn)物；5、 轉(zhuǎn)化酶切產(chǎn)物；6、 篩選 陽(yáng)性克?。?、 送測(cè)序并測(cè)全長(zhǎng)。最終就是慶祝啦，呵呵，沒(méi)什么簡(jiǎn)單的。 引物和質(zhì)粒都預(yù)備好后，當(dāng)然就是做PCR嘍，不過(guò)對(duì)于PCR的酶和buffer，不能用平常的，我們做PCR把整個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)出來(lái)，延長(zhǎng)長(zhǎng)度達(dá)到幾個(gè)K，所以要用那些GC buffer或擴(kuò)增長(zhǎng)片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來(lái)擴(kuò)增，防止引進(jìn)新的突變。那種Quick change試劑盒分為幾種不同的類型 什么QuikChange® Sit

21、e-Directed Mutagenesis Kit標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)突變?cè)噭┖?、QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit長(zhǎng)模板單點(diǎn)突變?cè)噭┖校?gt;8kb）從原理上是一樣的，只是PCR的酶和BUFFER不一樣，后面用了比較適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增的酶和BUFFER罷了，沒(méi)什么特殊的東西。另外，DpnI處理的時(shí)間最好長(zhǎng)一點(diǎn)，最少一個(gè)小時(shí)吧，最好能有兩三個(gè)小時(shí)，由于假如模板處理得不潔凈，哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長(zhǎng)出來(lái)，就會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。試驗(yàn)板長(zhǎng)出來(lái)的菌有兩種可能 一種是質(zhì)粒DPNI沒(méi)處理潔凈長(zhǎng)出來(lái)的（模板），一種是PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化出來(lái)的 （突變體

22、）不過(guò)這兩種菌長(zhǎng)得一模一樣_，即使提出質(zhì)粒來(lái)也是一樣（酶切和PCR都無(wú)法區(qū)分），除了測(cè)序，是分不出來(lái)的， 做PCR時(shí)也最好做一個(gè)負(fù)對(duì)比（不加引物），試驗(yàn)管由于PCR時(shí)有引物，所以在DNPI處理前里面既含有模板又含有PCR產(chǎn)物，而對(duì)比管由于PCR時(shí)沒(méi)放引物，所以在DPNI處理前里面只有模板。 假如兩者都拿去DNPI處理 就能夠證明模板已經(jīng)被去除潔凈。若試驗(yàn)順當(dāng)?shù)脑拺?yīng)當(dāng)是：正對(duì)比長(zhǎng)菌負(fù)對(duì)比不長(zhǎng)菌。假如消滅正負(fù)對(duì)比都長(zhǎng)菌，那么就是DpnI沒(méi)處理好，假如正負(fù)對(duì)比都不長(zhǎng)菌，那么有兩種可能，一種是PCR陰性，也就是說(shuō)PCR出問(wèn)題了，另外一個(gè)可能就是轉(zhuǎn)化出問(wèn)題了。要搞清楚是哪個(gè)問(wèn)題，跑膠說(shuō)明不了問(wèn)題，那就做

23、個(gè)轉(zhuǎn)化的對(duì)比，拿試劑盒的對(duì)比試驗(yàn)去試感受態(tài)，馬上就能知道轉(zhuǎn)化有沒(méi)問(wèn)題。假如正對(duì)比很多菌，負(fù)對(duì)比有幾個(gè)菌，那么就是DPNI處理得不潔凈，這個(gè)時(shí)候就得靠運(yùn)氣了_大家有什么問(wèn)題我們可以連續(xù)爭(zhēng)辯。另外，假如大家既沒(méi)有DpnI酶也沒(méi)有好的PCR酶和BUFFER的話，那也有其它方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，只是麻煩一點(diǎn)，假如大家有需要的話，我會(huì)把方法貼上來(lái)。對(duì)于多點(diǎn)突變技術(shù)及較長(zhǎng)片段的缺失插入技術(shù)，同樣的，假如大家有需要的話，我會(huì)把方法貼上來(lái)。 不過(guò)，假如你有錢(qián)的話，那就去買(mǎi)那個(gè)試劑盒吧，其中QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)突變?cè)噭┖?、QuikCha

24、nge® XL Site-Directed Mutagenesis Kit長(zhǎng)模板單點(diǎn)突變?cè)噭┖校?gt;8kb）的原理我上面已經(jīng)說(shuō)了，只是補(bǔ)充了一些我認(rèn)為的留意事項(xiàng)。假如你更有錢(qián)的話，那么你可以叫其它公司幫你做定點(diǎn)突變服務(wù)，大約是改一個(gè)點(diǎn)1000元左右。假如有需要我可以供應(yīng)公司的聯(lián)系方式。 下面我以一個(gè)例子為例來(lái)講100個(gè)bp以下的堿基插入缺失或者轉(zhuǎn)變?cè)囼?yàn)方案。其實(shí)這種方案并不是那么好的，只不過(guò)考慮到大家一般都沒(méi)有TYPEII限制性內(nèi)切酶或者UDG and NTHIII（另外兩種方法），所以才打算先介紹這種方法。 首先先說(shuō)明一點(diǎn)，這種 方法在原理上存在肯定成功機(jī)率，也就是說(shuō)有運(yùn)氣成分

25、。而定點(diǎn)突變則一般都是百分之百成功的，而這種100bp以下的插入缺失或者堿基轉(zhuǎn)變可能要測(cè)幾個(gè)克隆才能挑到一個(gè)好的克隆，大家假如要用請(qǐng)慎重考慮。 同樣的，我只變那幾十個(gè)堿基，并沒(méi)有轉(zhuǎn)變載體及其它地方，所以我還是依靠于DPNI酶。舉例：Homo sapiens FzE3 是一個(gè)人類基因，其含有32個(gè)氨基酸的信號(hào)肽MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGA，后面是成熟肽QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKF

26、GFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYPTAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPCEPGRANGLMYFKEEERRFARLWVGVWSVLCCASTLFTVLTYLVDMRRFSYPERPIIFLSGCYFMVAVAHVAGFLLEDRAVCVERFSDDGYRTVAQGTKKEGCTILFMVLYFFGMASSIWWVILSLTWFLAAGMKWGHEAIEANSQYFHLAAWAVPAVKTITILAMGQVDGDLLSGVCYVGLSSVDALRGFVLAPLFVYLFIGTS

27、FLLAGFVSLFRIRTIMKHDGTKTEKLEKLMVRIGVFSVLYTVPATIVLACYFYEQAFREHWERTWLLQTCKSYAVPCPPGHFPPMSPDFTVFMIKYLMTMIVGITTGFWIWSGKTLQSWRRFYHRLSHSSKGETAV，想在信號(hào)肽和成熟肽之間插入一個(gè)FLAG標(biāo)簽并在標(biāo)簽前面加上一個(gè)Leucine。即在信號(hào)肽和成熟肽之間插入一段序列：TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG（一共三十個(gè)bp）、試驗(yàn)設(shè)計(jì)：信號(hào)肽：ATGCGGGACCCCGGCGCGGCCGTTCCGCTTTCGTCCCTGGGCTTCTGTGCCCTGGTG

28、CTGGCGCTGCTGGGCGCACTGTCCGCGGGCGCCGGGGCG成熟肽：CAGCCGTACCACGGAGAGAAGGGCATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTTTTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCC

29、GCCGTGTCGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTCCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGCGTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCGGGCCCACTGCCTACCCTACCGCGCCCTACCTGCCGGACCTGCCCTTCACCGCGCTGCCCCCGGGGGCCTCAGATGGCAAGGGGCGTCCCGCCTTCCCCTTCTCATGCCCCCGTCAGCTCAAGGTGCCCCC

30、GTACCTGGGCTACCGCTTCCTGGGTGAGCGCGATTGTGGCGCCCCGTGCGAACCGGGCCGTGCCAACGGCCTGATGTACTTTAAGGAGGAGGAGAGGCGCTTCGCCCGCCTCTGGGTGGGCGTGTGGTCCGTGCTGTGCTGCGCCTCGACGCTCTTTACCGTTCTCACGTACCTGGTGGACATGCGGCGCTTCAGCTACCCAGAGCGGCCCATCATCTTCCTGTCGGGCTGCTACTTCATGGTGGCCGTGGCGCACGTGGCCGGCTTCTTTCTAGAGGACCGCGCCGTGTGCGTGGAGCG

31、CTTCTCGGACGATGGCTACCGCACGGTGGCGCAGGGCACCAAGAAAGAGGGCTGCACCATCCTCTTCATGGTGCTCTACTTCTTCGGCATGGCCAGCTCCATCTGGTGGGTCATTCTGTCTCTCACTTGGTTCCTGGCGGCCGGCATGAAATGGGGCCACGAAGCCATCGAGGCCAACTCGCAGTACTTCCACCTGGCCGCGTGGGCCGTGCCCGCCGTCAAGACCATCACTATCCTGGCCATGGGCCAGGTAGACGGGGACCTGCTGAACGGGGTGTGCTACGTTGGCTTCTCCAGTGT

32、GGACGCGCTGCGGGGCTTCGTGCTGGCGCCTCTGTTCGTCTACTTCTTCATAGGCACGTCCTTCTTGCTGGCCGGCTTCGTGTCCTTCTTCCGTATCCGCACCATCATGAAACACGACGGCACCAAGACCGAGAAGCTGGAGAAGCTCATGGTGCGCATCGGCGTCTTCAGCGTGCTCTACACAGTGCCCGCCACCATCGTCCTGGCCTGCTACTTCTACGAGCAGGCCTTCCGCGAGCACTGGGAGCGCACCTGGCTCCTGCAGACGTGCAAGAGCTATGCCGTGCCCTGCCCGCCCGG

33、CCACTTCCCGCCCATGAGCCCCGACTTCACCGTCTTCATGATCAAGTGCCTGATGACCATGATCGTCGGCATCACCACTGGCTTCTGGATCTGGTCGGGCAAGACCCTGCAGTCGTGGCGCCGCTTCTACCACAGACTTAGCCACAGCAGCAAGGGAGAGACCGCGGTATGA插入序列TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG 通過(guò)引物3端大于或等于18個(gè)堿基的匹配使引物與模板質(zhì)粒搭配，再通過(guò)引物5端的序列來(lái)補(bǔ)上那三十個(gè)堿基，先用PNK酶把引物磷酸化，再用下面這兩條引物把整個(gè)質(zhì)粒給擴(kuò)增出來(lái)，上游和下游引物就剛好

34、把那三十個(gè)堿基給補(bǔ)上了，再參照引物的設(shè)計(jì)原則做一些潤(rùn)色，細(xì)心的伴侶可以具體分析一下這兩條引物。擴(kuò)出來(lái)后再用DPNI酶把模板質(zhì)粒去掉，再用連接酶把PCR產(chǎn)物的兩端連接起來(lái)（雖然是平端連接 ，可是由于是同一條PCR產(chǎn)物的兩端連接，效率會(huì)很高），轉(zhuǎn)化后，測(cè)序驗(yàn)證，OK。設(shè)計(jì)引物forward primer:GGACTACAAAGACGATGACGACAAGCAGCCGTACCACGGAGAGAAG88.5reserve primer: ATTAACGCCCCGGCGCCCGCGGACAGT86.9 但是由于引物的合成是由3端向5端合成，而且每合成多一個(gè)堿基的效率最多也是百分之九十九點(diǎn)幾而不是百分之一

35、百，所以我們拿到手的引物其實(shí)是一個(gè)混合物，比如說(shuō)我們合成一條長(zhǎng)二十個(gè)堿基的引物，實(shí)際上拿到手的是一個(gè)混合物，里面即含有二十個(gè)堿基的引物，也含 有肯定比率的十九個(gè)、十八個(gè)、十七個(gè)堿基的引物。所以我們用這種方法做PCR時(shí)，假如連上的是足額長(zhǎng)度的引物，那么試驗(yàn)也就成功了，假如連上的是少一兩個(gè)堿基的引物，那么試驗(yàn)就失敗了，不過(guò)引物當(dāng)中主要的仍是足額長(zhǎng)度的引物，所以成功機(jī)率還是蠻高的。不過(guò)送測(cè)序時(shí)就要做好預(yù)備，可能要測(cè)三五個(gè)才能拿到一個(gè)好的。 假如覺(jué)得這樣不好的話，我稍后會(huì)附上用TYPEII酶或者UDG，NTHIII做的方法，它們是通過(guò)互補(bǔ)粘端來(lái)連接，就不存在這個(gè)問(wèn)題。下面附上具體試驗(yàn)過(guò)程：第一步：設(shè)計(jì)

36、引物；其實(shí)只要符合一般引物設(shè)計(jì)原理就行了，順便說(shuō)一下，引物一般的話，越長(zhǎng)其質(zhì)量就其次步：引物PNK處理，一般合成的引物其三端是沒(méi)有磷酸化的，所以我們要自己進(jìn)行磷酸化，一般可以讓其磷酸化過(guò)夜，不磷酸化的話最終一步連接就連不上哦。第三步：PCR，跟基因定點(diǎn)突變一樣，要用好的擴(kuò)增酶和BUFFER，由于要把整個(gè)環(huán)高保真的壙增出來(lái)嘛；第四步：DPNI處理，跟基因定點(diǎn)突變一樣，要把模板去除潔凈。第五步：連接，加上連接BUFFER和連接酶連接，第六步：轉(zhuǎn)化。定點(diǎn)誘變(DpnI法)1、引物設(shè)計(jì)：每條引物都要攜帶有所需的突變位點(diǎn)，引物一般長(zhǎng)2545bp,設(shè)計(jì)的突變位點(diǎn)需位于引物中部。2、反應(yīng)：使用高保真的pyr

37、obest DNA聚合酶 ;循環(huán)次數(shù)少，一般為12個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：10x pyrobest Buffer                         5 uldNTP Mixture(10mM)             &#

38、160;         1ul                   模板DNA(550ng)                    

39、60;    1ulprimer 1 (125ng)                            1ulprimer 2 (125ng)                            1ulpyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul)    0.25ul加無(wú)菌蒸餾水至