實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1、PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶(Taq DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性是該酶用于PCR反應(yīng)的前提條 件)的作用下，以dNTP(dNTP，deoxy-ribonucl

2、eoside triphosphate（脫氧核糖核苷三磷酸）的縮寫。是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP,dUTP等在內(nèi)的統(tǒng)稱，N是指含氮堿基，代表變量指代A、T、G、C、U等中的一種。在生物DNA、RNA合成中，以及各種PCR（RT-PCR、Real-time PCR）中起原料作用)為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理所謂實(shí)時(shí)

3、熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 1. Ct 值的定義在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念 - Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如圖1所示）。 2. 熒光域值（threshold）的設(shè)定PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 3. Ct值與起始模板的關(guān)系研究

4、表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 4. 熒光化學(xué)熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下： 1）TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'3

5、9;外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺(tái)。 2）SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。 編輯本段內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的意義1 幾種傳統(tǒng)定量

6、PCR方法簡(jiǎn)介：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。 2）競(jìng)爭(zhēng)法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知

7、模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。 3）PCRELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCRELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。 4）微譜分析法：主要是用來分析產(chǎn)品的成分，對(duì)各個(gè)成分進(jìn)行定性定量分析，是一種集光譜、能譜、質(zhì)譜、色譜等微觀譜圖于一體使用、或者是指結(jié)合使用其中的兩到三種方式的綜合性定性定量分析方法。 2內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測(cè)，即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而PCR經(jīng)過對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。

8、同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異（見圖4），因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 編輯本段內(nèi)標(biāo)對(duì)熒光定量PCR的影響1實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的： 1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正

9、的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。 2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。 2內(nèi)標(biāo)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的影響若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是

10、這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。 美國(guó)Texas大學(xué)的科研人員進(jìn)行了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。 Applied Biosystems公司的7700型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是全球公認(rèn)的熒光定量PCR的金標(biāo)準(zhǔn)，可實(shí)現(xiàn)多色熒光同時(shí)檢測(cè)，但定量檢測(cè)仍然采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，而不用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。 綜上所述，利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體

11、檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。 熒光PCR是分子診斷的熱點(diǎn)技術(shù)，它將先進(jìn)的定量PCR與實(shí)時(shí)PCR技術(shù)相結(jié)合，西安天隆生產(chǎn)的國(guó)產(chǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸檢測(cè)及分子診斷、同時(shí)也為沙門氏菌阪崎氏腸桿菌等食品安全檢測(cè)提供了先進(jìn)手段。即使在發(fā)達(dá)國(guó)家，熒光定量PCR儀和基因擴(kuò)增儀都被廣泛用于臨床及生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究。由于其極高的靈敏度、極寬的檢測(cè)范圍，以及精確定量、方便快速、無窗口期等優(yōu)點(diǎn)，美國(guó)FDA及我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)已將定量PCR儀規(guī)定為確診禽流感等傳染病以及奶粉等食品安全檢測(cè)的必備儀器。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（real-time qPCR）的發(fā)明實(shí)現(xiàn)了榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的PCR核酸檢測(cè)、分子診斷

12、的技術(shù)飛躍。 編輯本段PCR儀在國(guó)內(nèi)的發(fā)展?fàn)顩r西安天隆科技有限公司生產(chǎn)的處于國(guó)際領(lǐng)先水平的TL988型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀適用于臨床及科研以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為特征的、以實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)分析DNA/RNA為目的的病原體檢測(cè)及基因分析。 臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評(píng)價(jià)；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測(cè)；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)遺傳病診斷。 動(dòng)物疾病檢測(cè)：禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。 食品安全：食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因、

13、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測(cè)。 科學(xué)研究：醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。 應(yīng)用行業(yè)：各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。 由于qPCR是實(shí)時(shí)定量檢測(cè)致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨(dú)到優(yōu)勢(shì)。 技術(shù)原理：微譜分析實(shí)驗(yàn)室將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長(zhǎng)，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)與之對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)

14、增而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度，求得CT值，同時(shí)利用數(shù)個(gè)已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，即可得出待測(cè)標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。 性能標(biāo)準(zhǔn)及參數(shù)標(biāo)本載體 0.2ml薄壁PCR離心管 標(biāo)本數(shù)量 標(biāo)本數(shù)量36個(gè)，包括4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品 試 劑 SYBR Green I，F(xiàn)AM，Tex Red，F(xiàn)ITC等熒光染料，開放式PCR試劑 反應(yīng)體系 10-100L 建議質(zhì)控 四個(gè)陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照 指標(biāo) 熒光激發(fā)波長(zhǎng) 470nm 熒光發(fā)射波長(zhǎng) 530nm，640nm，710nm 570nm，605nm 熒光檢測(cè)方式 光開關(guān)陣列組合光電倍增管PMT方式 控溫范圍 4.0-99.0 熱蓋溫度 100120 升/降溫速度 4.0/S（Ma

15、x） 溫度均勻性 ±0.3 溫度精確度 ±0.3 溫度顯示精度 0.1 檢測(cè)范圍 1011010DNA/RNA copy/ml CT值重復(fù)性誤差 CV2.1% 核酸精度相關(guān)系數(shù) R0.997 軟件 溫階 19 循環(huán) 199 保溫時(shí)間 19999秒 文件 19個(gè)連接 升級(jí)方式 遠(yuǎn)程硬件內(nèi)控軟件升級(jí) 系統(tǒng)接口 RS-232C串行接口，雙向數(shù)據(jù) 主機(jī)操作系統(tǒng) Windows2000/XP 產(chǎn)品外形尺寸 50cm × 40cm × 35cm 產(chǎn)品重量 25kg 使用環(huán)境 溫度540，相對(duì)濕度80% 使用電源 AC220 × (1±10%)V,

16、50 × (1±2%)HZ 功耗 1100VA 多規(guī)格 提供96孔，多通道/多色、36孔等不同規(guī)格產(chǎn)品 專利技術(shù)應(yīng)用實(shí)現(xiàn)快速高效均衡擴(kuò)增檢測(cè)由光開關(guān)陣列、自聚焦透鏡和尾纖準(zhǔn)直器及變?cè)鲆嫖⒐釵/E裝置組成的MEMS有機(jī)整體，在以16位單片機(jī)為核心的電控裝置管理下，能在毫秒級(jí)時(shí)間內(nèi)完成多個(gè)標(biāo)本快速均衡掃描檢測(cè)，避免了機(jī)械掃描方式或CCD掃描方式引起的時(shí)間滯后或漸暈誤差。實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)樣本的PCR熱循環(huán)擴(kuò)增及高通量實(shí)時(shí)熒光激發(fā)和定量檢測(cè)。 編輯本段產(chǎn)品突出特性« 走在PCR技術(shù)的前列 在PCR儀研發(fā)和市場(chǎng)化領(lǐng)域中歷史悠久； 將標(biāo)準(zhǔn)化的PCR檢測(cè)技術(shù)成功廣泛用于臨床；

17、 « 快速實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DNA/mRNA檢測(cè)的快速性 實(shí)時(shí)檢測(cè)啟用熒光探針標(biāo)記特定核酸的方法使準(zhǔn)確性更高； 簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)PCR方法； 使用最少的樣本量，在一小時(shí)左右出結(jié)果； « 簡(jiǎn)便閉管分析使您完成加樣后就無須再接觸樣本 減少樣本消耗殆盡風(fēng)險(xiǎn)； 縮短了出報(bào)告時(shí)間； 簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟； « 提高了用戶高級(jí)應(yīng)用的靈活性 提供了用戶自定義PCR操作平臺(tái)； 建立您的用戶自定義應(yīng)用； 分析用戶自定義試驗(yàn)； « 高性能 高靈敏度； 高特異性； 寬的動(dòng)態(tài)范圍； « 強(qiáng)大的軟件數(shù)據(jù)管理系統(tǒng) 完整的病例檔案；

18、集成化的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)功能； 圖標(biāo)顯示； 自動(dòng)試劑及結(jié)果跟蹤； 客戶使用界面友好； « 開放式、個(gè)性化儀器易于適應(yīng)您的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境 « 免維護(hù)光源系統(tǒng) 高亮度窄帶LED光源，工作穩(wěn)定，使用壽命長(zhǎng)，終身免維護(hù) « 靈敏精確的光電系統(tǒng) 熒光激發(fā)/檢測(cè)單色器采用美國(guó)原產(chǎn)濾光片；檢測(cè)器采用日本原產(chǎn)金屬封裝式光電倍增管PMT，具有靈敏度高、快速、穩(wěn)定的特點(diǎn)；準(zhǔn)直器、光開光陣列、光纖組件、電控裝置全部采用進(jìn)口期間；精度高，一致性好。 « 先進(jìn)的溫控系統(tǒng) 本儀器采用膜加熱及半導(dǎo)體熱泵制冷技術(shù)保證了升降溫的快速穩(wěn)定、儀器壽命長(zhǎng)的特點(diǎn)，加有熱蓋保證了PCR無礦物油操作，避免了人為原因造成的污染。 « 先進(jìn)的溫控系統(tǒng) 本儀器采用膜加熱及半導(dǎo)體泵制冷技術(shù)保證了升降溫的快速穩(wěn)定、儀器壽命長(zhǎng)的特點(diǎn)，加有熱蓋保證了PCR無礦物油操作，避免了人為原因造成的污染。 « 友好的軟件系統(tǒng) 中文Windows傳統(tǒng)界面更符合國(guó)人操作習(xí)慣，多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)填空式輸入降低了因參數(shù)設(shè)置所造成的事物；參數(shù)輸入