體外構(gòu)建組織工程軟骨種子細(xì)胞的研究進(jìn)展

1、體外構(gòu)建組織工程軟骨種子細(xì)胞的研究進(jìn)展         08-07-01 10:53:00     作者：孫天威 張學(xué)利    編輯：studa20體外構(gòu)建組織工程軟骨的首要問題是種子細(xì)胞的來源，目前獲得種子細(xì)胞的可能途徑主要有以下幾種：(1)培養(yǎng)擴(kuò)增自體獲得的軟骨細(xì)胞；(2)同種異體軟骨細(xì)胞；(3)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及其他組織來源干細(xì)胞；(4)胚胎干細(xì)胞；(5)基因修飾細(xì)胞。本文就當(dāng)前體外構(gòu)建組織工程軟骨的種子細(xì)胞研究進(jìn)展綜述如下：

2、60;   1  自體軟骨細(xì)胞    自體軟骨細(xì)胞可由關(guān)節(jié)軟骨、骺板軟骨、軟骨膜、肋軟骨和耳軟骨等分離培養(yǎng)獲得。軟骨細(xì)胞是構(gòu)成透明關(guān)節(jié)軟骨的唯一細(xì)胞成分，是終末分化細(xì)胞，具有高度特異性。軟骨細(xì)胞的主要功能是維持軟骨基質(zhì)成分的穩(wěn)定。新分離的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在最初的數(shù)天或者數(shù)周內(nèi)會(huì)持續(xù)表達(dá)其特異細(xì)胞表型1，使其成為軟骨缺損關(guān)節(jié)的“細(xì)胞治療”中合適的細(xì)胞類型。    使用標(biāo)準(zhǔn)化的有效培養(yǎng)方式培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，年輕人群的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞每天僅倍增0.3倍；年齡較大患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增生速度更低。當(dāng)軟骨細(xì)胞在非三維環(huán)境中培養(yǎng)

3、時(shí)，經(jīng)過一段時(shí)間后(一般是3代以后)，它們的細(xì)胞表型會(huì)發(fā)生變化，發(fā)生“去分化現(xiàn)象”，表現(xiàn)得更像成纖維細(xì)胞的形態(tài)，表達(dá)型、型膠原，不再表達(dá)型膠原。    軟骨“去分化”過程與培養(yǎng)條件相關(guān)。低密度接種和一些特定生長(zhǎng)因子會(huì)促進(jìn)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表達(dá)成纖維樣細(xì)胞形態(tài)及相關(guān)蛋白2。另一方面，一些特殊培養(yǎng)條件會(huì)促進(jìn)“去分化”的軟骨細(xì)胞“再分化”，恢復(fù)軟骨細(xì)胞特異的生物學(xué)行為。這些特殊的培養(yǎng)條件包括：旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)；高密度微團(tuán)培養(yǎng)；高密度和懸浮培養(yǎng)方法，能獲得形態(tài)與功能都很穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞；低氧培養(yǎng)；固態(tài)基質(zhì)支架培養(yǎng)，例如將細(xì)胞接種到瓊脂糖上、膠原或者藻酸鹽凝膠培養(yǎng)。軟骨組織工程中將軟骨

4、細(xì)胞接種在一些海綿狀載體支架上培養(yǎng)，可以維持軟骨細(xì)胞表型3。不同的細(xì)胞因子對(duì)軟骨細(xì)胞特異分子的表達(dá)影響不同。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)超家族中的成員能夠誘發(fā)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表達(dá)軟骨細(xì)胞表型3。星型包菌素(Staurosporine)一種蛋白激酶C抑制劑，與胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)聯(lián)合應(yīng)用胰島素，或單獨(dú)應(yīng)用IGF，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)，和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)都能夠促進(jìn)軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)5。    應(yīng)用自體軟骨細(xì)胞會(huì)造成供體部位的損傷，供體軟骨部位的相關(guān)研究目前尚未見文章報(bào)道。為了獲得健康軟骨組織，分離軟骨細(xì)胞，需要額外的手術(shù)，但易帶來手術(shù)相關(guān)

5、的并發(fā)癥，如感染、疼痛等。    2  同種異體軟骨細(xì)胞    同種異體軟骨組織作為一種移植物來源，因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)特性，而引起研究者和臨床醫(yī)生的興趣。組織學(xué)方面，軟骨組織內(nèi)部無血管、淋巴管和神經(jīng)，其營(yíng)養(yǎng)靠軟骨基質(zhì)的可滲透性從組織液中獲得。軟骨細(xì)胞被包裹在軟骨陷窩內(nèi)，軟骨囊成為其天然屏障，可阻擋免疫細(xì)胞直接侵入；軟骨組織具有抗原性弱、不易被機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊和排斥等特點(diǎn)10。因此同種異體軟骨細(xì)胞是一種值得研究的種子細(xì)胞。Wakitani即于1989年以同種異體軟骨細(xì)胞組織工程化技術(shù)成功修復(fù)了兔關(guān)節(jié)軟骨表面缺損6。大量研究

6、結(jié)果已經(jīng)證明7，同種異體軟骨細(xì)胞可在受體內(nèi)長(zhǎng)期生長(zhǎng)并保持分泌基質(zhì)的功能，這為應(yīng)用組織工程技術(shù)預(yù)制同種異體軟骨組織提供了可能。同種異體來源的軟骨細(xì)胞具有來源廣泛、取材容易、一次可獲取大量細(xì)胞、并且在三維培養(yǎng)環(huán)境和或生長(zhǎng)因子作用下可保持軟骨細(xì)胞的生理特性等特點(diǎn)。        近年來對(duì)于胚胎來源的軟骨細(xì)胞研究較多。且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及多種免疫學(xué)檢查證實(shí)，胚胎來源的軟骨細(xì)胞所形成的新生軟骨比新生及成年動(dòng)物來源的軟骨細(xì)胞所形成的新生軟骨在受體體內(nèi)存留的時(shí)間要顯著延長(zhǎng)。胚胎軟骨細(xì)胞的免疫原性比異體成年細(xì)胞大大降低，提示胚胎來源的軟骨細(xì)胞可以作

7、為組織工程化軟骨組織的一種種子細(xì)胞來源。        但是考慮到組織相關(guān)的免疫反應(yīng)和疾病傳播等方面的影響，同種異體軟骨細(xì)胞用于治療軟骨缺損的方案缺乏足夠的吸引力。    3  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及其他組織來源干細(xì)胞        軟骨細(xì)胞作為軟骨缺損細(xì)胞治療的種子細(xì)胞，在軟骨細(xì)胞來源和體外培養(yǎng)條件下維持軟骨細(xì)胞表型等方面有很多難題，目前尚難于解決。這引導(dǎo)人們研究其它類型的種子細(xì)胞。有些研究顯示在體內(nèi)和體外環(huán)境中，特定的

8、條件會(huì)誘發(fā)自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells，BMSC)、肌肉和脂肪組織來源的干細(xì)胞表達(dá)軟骨細(xì)胞表型。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞以其來源充足、取材方便、創(chuàng)傷小、無排斥反應(yīng)、增殖能力強(qiáng)、可大量培養(yǎng)擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，被公認(rèn)有可能成為軟骨組織工程理想的種子細(xì)胞來源。目前誘導(dǎo)BMSC向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究已取得成功8。高密度接種或者低氧條件培養(yǎng)以及一些特殊的生長(zhǎng)因子會(huì)促進(jìn)BMSC向軟骨細(xì)胞方向分化。研究表明，將離心微球化(pellet)的BMSC在含有TGF無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2周左右即可獲得富含細(xì)胞外基質(zhì)的軟骨細(xì)胞，組織學(xué)檢查可見軟骨細(xì)胞樣陷窩9。同樣，肌肉和脂肪組織來源的干細(xì)胞經(jīng)體外

9、誘導(dǎo)均可表達(dá)軟骨細(xì)胞表型。2003年Dragoo等證實(shí)將來源于人髕骨后脂肪墊的脂肪干細(xì)胞植入纖維蛋白膠，  經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后，在體外和裸鼠體內(nèi)都出現(xiàn)成軟骨的表型，有透明軟骨形成。該研究提示以人脂肪干細(xì)胞為基礎(chǔ)的軟骨工程有可能在臨床上用于治療軟骨缺損10。此外，激素類物質(zhì)，如地塞米松、生長(zhǎng)激素、甲狀旁腺素、性激素以及維生素等都對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、肌肉和脂肪組織來源的干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化有誘導(dǎo)作用。對(duì)生長(zhǎng)因子的作用以及生長(zhǎng)因子與全身激素類物質(zhì)之間的協(xié)同或拮抗調(diào)控方式和調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步研究，有望使骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、肌肉和脂肪組織來源的干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的軟骨細(xì)胞，早日成為軟骨組織工程的充裕的種子細(xì)胞來

10、源。但是這種細(xì)胞有一種明顯的缺點(diǎn)，他們會(huì)進(jìn)一步分化成肥大軟骨細(xì)胞，甚至發(fā)生磷酸類無機(jī)物礦物質(zhì)沉積和軟骨內(nèi)鈣化11。    4  胚胎干細(xì)胞        種子細(xì)胞的老化是組織工程中的一大難題。一些分化和增殖能力  強(qiáng)的原始細(xì)胞，即干細(xì)胞，是解決這一難題的希望所在。目前研究較  多的是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，而胚胎干細(xì)胞因其具有全能性和無限增殖的  能力，有望成為組織工程中種子細(xì)胞的新來源。胚胎干細(xì)胞是從著床  前胚胎(孕35 d)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離所得，在體外進(jìn)行培養(yǎng)的一種高  度未分化的細(xì)胞。目前大部分胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)軟骨細(xì)