體外構(gòu)建組織工程軟骨種子細胞的研究進展

1、體外構(gòu)建組織工程軟骨種子細胞的研究進展         08-07-01 10:53:00     作者：孫天威 張學(xué)利    編輯：studa20體外構(gòu)建組織工程軟骨的首要問題是種子細胞的來源，目前獲得種子細胞的可能途徑主要有以下幾種：(1)培養(yǎng)擴增自體獲得的軟骨細胞；(2)同種異體軟骨細胞；(3)骨髓基質(zhì)干細胞及其他組織來源干細胞；(4)胚胎干細胞；(5)基因修飾細胞。本文就當前體外構(gòu)建組織工程軟骨的種子細胞研究進展綜述如下：

2、60;   1  自體軟骨細胞    自體軟骨細胞可由關(guān)節(jié)軟骨、骺板軟骨、軟骨膜、肋軟骨和耳軟骨等分離培養(yǎng)獲得。軟骨細胞是構(gòu)成透明關(guān)節(jié)軟骨的唯一細胞成分，是終末分化細胞，具有高度特異性。軟骨細胞的主要功能是維持軟骨基質(zhì)成分的穩(wěn)定。新分離的關(guān)節(jié)軟骨細胞在最初的數(shù)天或者數(shù)周內(nèi)會持續(xù)表達其特異細胞表型1，使其成為軟骨缺損關(guān)節(jié)的“細胞治療”中合適的細胞類型。    使用標準化的有效培養(yǎng)方式培養(yǎng)軟骨細胞，年輕人群的關(guān)節(jié)軟骨細胞每天僅倍增0.3倍；年齡較大患者的關(guān)節(jié)軟骨細胞的增生速度更低。當軟骨細胞在非三維環(huán)境中培養(yǎng)

3、時，經(jīng)過一段時間后(一般是3代以后)，它們的細胞表型會發(fā)生變化，發(fā)生“去分化現(xiàn)象”，表現(xiàn)得更像成纖維細胞的形態(tài)，表達型、型膠原，不再表達型膠原。    軟骨“去分化”過程與培養(yǎng)條件相關(guān)。低密度接種和一些特定生長因子會促進培養(yǎng)的軟骨細胞表達成纖維樣細胞形態(tài)及相關(guān)蛋白2。另一方面，一些特殊培養(yǎng)條件會促進“去分化”的軟骨細胞“再分化”，恢復(fù)軟骨細胞特異的生物學(xué)行為。這些特殊的培養(yǎng)條件包括：旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)；高密度微團培養(yǎng)；高密度和懸浮培養(yǎng)方法，能獲得形態(tài)與功能都很穩(wěn)定的軟骨細胞；低氧培養(yǎng)；固態(tài)基質(zhì)支架培養(yǎng)，例如將細胞接種到瓊脂糖上、膠原或者藻酸鹽凝膠培養(yǎng)。軟骨組織工程中將軟骨

4、細胞接種在一些海綿狀載體支架上培養(yǎng)，可以維持軟骨細胞表型3。不同的細胞因子對軟骨細胞特異分子的表達影響不同。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)超家族中的成員能夠誘發(fā)體外培養(yǎng)的軟骨細胞表達軟骨細胞表型3。星型包菌素(Staurosporine)一種蛋白激酶C抑制劑，與胰島素樣生長因子(IGF)聯(lián)合應(yīng)用胰島素，或單獨應(yīng)用IGF，肝細胞生長因子(HGF)，和成纖維細胞生長因子(FGF)都能夠促進軟骨特異性細胞外基質(zhì)產(chǎn)物的表達5。    應(yīng)用自體軟骨細胞會造成供體部位的損傷，供體軟骨部位的相關(guān)研究目前尚未見文章報道。為了獲得健康軟骨組織，分離軟骨細胞，需要額外的手術(shù)，但易帶來手術(shù)相關(guān)

5、的并發(fā)癥，如感染、疼痛等。    2  同種異體軟骨細胞    同種異體軟骨組織作為一種移植物來源，因其獨特的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)特性，而引起研究者和臨床醫(yī)生的興趣。組織學(xué)方面，軟骨組織內(nèi)部無血管、淋巴管和神經(jīng)，其營養(yǎng)靠軟骨基質(zhì)的可滲透性從組織液中獲得。軟骨細胞被包裹在軟骨陷窩內(nèi)，軟骨囊成為其天然屏障，可阻擋免疫細胞直接侵入；軟骨組織具有抗原性弱、不易被機體免疫系統(tǒng)攻擊和排斥等特點10。因此同種異體軟骨細胞是一種值得研究的種子細胞。Wakitani即于1989年以同種異體軟骨細胞組織工程化技術(shù)成功修復(fù)了兔關(guān)節(jié)軟骨表面缺損6。大量研究

6、結(jié)果已經(jīng)證明7，同種異體軟骨細胞可在受體內(nèi)長期生長并保持分泌基質(zhì)的功能，這為應(yīng)用組織工程技術(shù)預(yù)制同種異體軟骨組織提供了可能。同種異體來源的軟骨細胞具有來源廣泛、取材容易、一次可獲取大量細胞、并且在三維培養(yǎng)環(huán)境和或生長因子作用下可保持軟骨細胞的生理特性等特點。        近年來對于胚胎來源的軟骨細胞研究較多。且動物實驗及多種免疫學(xué)檢查證實，胚胎來源的軟骨細胞所形成的新生軟骨比新生及成年動物來源的軟骨細胞所形成的新生軟骨在受體體內(nèi)存留的時間要顯著延長。胚胎軟骨細胞的免疫原性比異體成年細胞大大降低，提示胚胎來源的軟骨細胞可以作

7、為組織工程化軟骨組織的一種種子細胞來源。        但是考慮到組織相關(guān)的免疫反應(yīng)和疾病傳播等方面的影響，同種異體軟骨細胞用于治療軟骨缺損的方案缺乏足夠的吸引力。    3  骨髓基質(zhì)干細胞及其他組織來源干細胞        軟骨細胞作為軟骨缺損細胞治療的種子細胞，在軟骨細胞來源和體外培養(yǎng)條件下維持軟骨細胞表型等方面有很多難題，目前尚難于解決。這引導(dǎo)人們研究其它類型的種子細胞。有些研究顯示在體內(nèi)和體外環(huán)境中，特定的

8、條件會誘發(fā)自體骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stem cells，BMSC)、肌肉和脂肪組織來源的干細胞表達軟骨細胞表型。骨髓基質(zhì)干細胞以其來源充足、取材方便、創(chuàng)傷小、無排斥反應(yīng)、增殖能力強、可大量培養(yǎng)擴增等優(yōu)點，被公認有可能成為軟骨組織工程理想的種子細胞來源。目前誘導(dǎo)BMSC向軟骨細胞轉(zhuǎn)化的實驗研究已取得成功8。高密度接種或者低氧條件培養(yǎng)以及一些特殊的生長因子會促進BMSC向軟骨細胞方向分化。研究表明，將離心微球化(pellet)的BMSC在含有TGF無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2周左右即可獲得富含細胞外基質(zhì)的軟骨細胞，組織學(xué)檢查可見軟骨細胞樣陷窩9。同樣，肌肉和脂肪組織來源的干細胞經(jīng)體外

9、誘導(dǎo)均可表達軟骨細胞表型。2003年Dragoo等證實將來源于人髕骨后脂肪墊的脂肪干細胞植入纖維蛋白膠，  經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后，在體外和裸鼠體內(nèi)都出現(xiàn)成軟骨的表型，有透明軟骨形成。該研究提示以人脂肪干細胞為基礎(chǔ)的軟骨工程有可能在臨床上用于治療軟骨缺損10。此外，激素類物質(zhì)，如地塞米松、生長激素、甲狀旁腺素、性激素以及維生素等都對骨髓間充質(zhì)干細胞、肌肉和脂肪組織來源的干細胞向軟骨細胞轉(zhuǎn)化有誘導(dǎo)作用。對生長因子的作用以及生長因子與全身激素類物質(zhì)之間的協(xié)同或拮抗調(diào)控方式和調(diào)控機制的進一步研究，有望使骨髓基質(zhì)干細胞、肌肉和脂肪組織來源的干細胞轉(zhuǎn)化的軟骨細胞，早日成為軟骨組織工程的充裕的種子細胞來

10、源。但是這種細胞有一種明顯的缺點，他們會進一步分化成肥大軟骨細胞，甚至發(fā)生磷酸類無機物礦物質(zhì)沉積和軟骨內(nèi)鈣化11。    4  胚胎干細胞        種子細胞的老化是組織工程中的一大難題。一些分化和增殖能力  強的原始細胞，即干細胞，是解決這一難題的希望所在。目前研究較  多的是骨髓基質(zhì)干細胞，而胚胎干細胞因其具有全能性和無限增殖的  能力，有望成為組織工程中種子細胞的新來源。胚胎干細胞是從著床  前胚胎(孕35 d)的內(nèi)細胞團中分離所得，在體外進行培養(yǎng)的一種高  度未分化的細胞。目前大部分胚胎干細胞誘導(dǎo)軟骨細