反應(yīng)分離耦合技術(shù)生產(chǎn)Ｌ－蘋果酸工藝過程優(yōu)化及酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究

1、反應(yīng)分離耦合技術(shù)生產(chǎn)工一蘋果酸工藝過程優(yōu)化及酶 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究胡永紅歐陽平凱陳武領(lǐng)蔡興懷 (南京化工大學(xué)生物工程與科學(xué)系南京210009)摘要研究了采用游離延胡索酸酶，利用生軸反應(yīng)分離耦舍原理，富馬酸鈣為底物，在延胡 素酸酶的作用下，直接生成蘋果酸鈣_ii法相對(duì)目前廣泛采用的固定化方法具有工藝流程短操 作簡(jiǎn)便轉(zhuǎn)化率及收率高等特點(diǎn)研究結(jié)果表明在轉(zhuǎn)化溫度為40c、pit為7o一75時(shí)，每升 酶延胡索酸酶洼能在20一28h間將32kg的言馬贛鈣轉(zhuǎn)化生成蘋果酸鈣，其轉(zhuǎn)化率高速999 富馬酸在產(chǎn)品中的殘留在01左右，誼工藝生產(chǎn)出的上一蘋果酸產(chǎn)品符合美國(guó)藥其標(biāo)準(zhǔn)，成本于化學(xué)合成法生產(chǎn)的雎一蘋果酸相當(dāng)對(duì)反

2、應(yīng)分離耘舍過程中延胡索酸罐化動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，以旦2旦對(duì)L作圖為一條直線，這說明t反應(yīng)體系的反應(yīng)速率符告米氏方程，并計(jì)算出C。一c。 c。一c，相壓的動(dòng)力學(xué)參數(shù)關(guān)鍵詞蘋果酸 反應(yīng)分再耦夸延胡索酸尊生物反應(yīng)和產(chǎn)物分離過程耦合可以實(shí)現(xiàn)高底物濃度的發(fā)酵或酶轉(zhuǎn)化，消除或減輕產(chǎn)物對(duì)生 物催化劑的抑制，增加反應(yīng)速率。同時(shí)，還可以起到降低產(chǎn)物分離能耗、簡(jiǎn)化產(chǎn)物分離過程、 降低生產(chǎn)成本的作用，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。作為近年來興起的這一集反應(yīng)過程和產(chǎn)物分離 過程于一體的新穎技術(shù)理論。在研究過程中，將該技術(shù)應(yīng)用于三一蘋果酸生產(chǎn)中，取得了重大突破。富馬酸鈉在延胡索酸酶的作用下，轉(zhuǎn)化生成蘋果酸鈉是典型的可逆反應(yīng)，轉(zhuǎn)化

3、率為7080，反 應(yīng)液中蘋果酸含量為10f一”，雖然采用優(yōu)化的高濃度富馬酸銨體系，可以提高轉(zhuǎn)化率達(dá)踮90，酶轉(zhuǎn)化液中蘋果酸含量達(dá)2041，較普通采用的富馬酸鈉體系提高了一倍。隨著反應(yīng)分離耦合研究的不斷發(fā)展，能否采甩該法生產(chǎn)一蘋果酸?本文探討了反應(yīng)分離耦合技術(shù)在生產(chǎn)一蘋果酸中的應(yīng)用。巧妙地運(yùn)用了溶解度的差別在游離延胡索酸酶的催化下，將生物反應(yīng)過 程中生成的一蘋果酸鈣鹽不斷地從溶液中析出，反應(yīng)不斷地向著生成產(chǎn)物的方向移動(dòng)，反應(yīng)轉(zhuǎn) 化率高達(dá)999，對(duì)富馬酸鈣的轉(zhuǎn)化量達(dá)320WV)，大幅度提高目的產(chǎn)物在酶轉(zhuǎn)化液中的 濃度，顯著降低分離成本。同時(shí)，該分離耦臺(tái)技術(shù)亦成功地應(yīng)用于上一丙氨酸的生產(chǎn)中，轉(zhuǎn)化率

4、達(dá)100對(duì)天門冬氨酸的轉(zhuǎn)化量可達(dá)260(WV)，產(chǎn)品濃度提高了，生產(chǎn)成本明顯降低。 當(dāng)然在其他產(chǎn)品諸如對(duì)羥基苯甘氨酸，一苯丙氨敬生產(chǎn)過程中亦可使用該反應(yīng)分離耦合技術(shù)， 提高收率、降低成本。1材料與方法11試劑 富馬酸，工業(yè)級(jí)，蘇州合成化工廠。 碳酸鈣，工業(yè)級(jí)，泗聯(lián)化工廠|_l12菌株本文所用的菌株為產(chǎn)氨短桿菌MA一2(Brevibacterium ammoniagenesMA-2)和黃色短桿菌MA一3(Brevibacteriumlavum MA-3)。13培養(yǎng)基組成131斜面培養(yǎng)基上述兩株菌均于普通肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其成分為：蛋白胨1，牛肉膏0s，氯化鈉05，pH為70。132產(chǎn)氨短桿菌MA

5、一2發(fā)酵培養(yǎng)基成分檸檬酸氫二銨3，KH2P04 o撕，MgS047H20o05，玉米漿45，用30NaOH調(diào)節(jié)pH至75左右，滅菌后各用。133黃色短桿菌MA一3發(fā)酵培養(yǎng)基成分丙二酸2，KH2P04 o2，MgS047r120005玉米漿2用30NaOH調(diào)節(jié)pH至75左右，滅菌后皤用。14培養(yǎng)條件-產(chǎn)氨短桿菌MA一2(丑ammoniagenes MA-2)于3234C下培養(yǎng)2436h，搖瓶接種量為10，搖床轉(zhuǎn)速180rmin，工業(yè)化生產(chǎn)中按800I-發(fā)酵罐計(jì)，接種量為05l黃色短桿菌MA一3(B加vl MA一3)培養(yǎng)溫度為3032C其余條件同產(chǎn)氨短桿菌MA一2。15儀器 DU650分光光度計(jì)(

6、Beckman)。MDl00-2電子分析天平(上海第三分析儀器廠)。JJl一型定時(shí)電動(dòng)攪拌器(金紜國(guó)華儀器廠)。 HH司14一型電熱恒溫水浴鍋，(常州國(guó)華儀器廠)。16分析方法： 富馬酸含量的測(cè)定詳見文獻(xiàn)【2】。 蘋果酸含量的測(cè)定詳見文獻(xiàn)【3l。2生物反應(yīng)與分離耦合生產(chǎn)工一蘋果黢過程及原理傳統(tǒng)的一蘋果酸生產(chǎn)工藝即審內(nèi)外普遍采用賁勺固定化延胡索酸酶生產(chǎn)工藝是將底物富馬酸 配成富馬酸鈉或富馬酸銨j在延胡索酸酶的作用下進(jìn)行水合，生成相應(yīng)的蘋果酸鹽，反應(yīng)式如 F：矗lmaraseNa2Fu或(Nil4)2凡+H20N2IIa或(眥)2Ma由于該反應(yīng)是可逆的，通常富馬酸鈉鹽轉(zhuǎn)化體系平均轉(zhuǎn)化率為7080，

7、富馬酸銨鹽體系轉(zhuǎn)化率在88-90，產(chǎn)物濃度在1020，還需進(jìn)行“轉(zhuǎn)晶”等工藝處理方能獲得合格 的產(chǎn)品，分離成本高，消耗大量原輔材料。基于上述原因及近年來反應(yīng)分離耦合原理在乙醇、 乳酸、o一干擾素等產(chǎn)品中成功地運(yùn)用，現(xiàn)利用該原理把生產(chǎn)所得的產(chǎn)品不斷移走，則可使反 應(yīng)不斷向右移動(dòng)，從根本上提高酶法生產(chǎn)L-蘋果酸的生產(chǎn)效率降低分離成本，縮短流程降 低投資。亦稱該反應(yīng)分離耦臺(tái)工藝為一步酶轉(zhuǎn)化法即富馬酸鈣晶體直接轉(zhuǎn)化成蘋果酸鈣晶體：fumaraseCaFu =Ca2+Fu2一_2十Ca2+=Cata固相 液相液相 固相式中，F(xiàn)u2代表富馬酸根，Ma2一代表蘋果酸根。眾所周知，富馬酸鈣在水中的溶解度很小，

8、40時(shí)為91210molL，但蘋果酸鈣在同樣條件F的溶解度更小，只有67510molL，它們均與液相中的酸根離子存在平衡轉(zhuǎn)化關(guān)系。在生物反應(yīng)分離耦合過程中，在延胡索酸酶的作用下，富馬酸鈣不斷溶解并在延胡索酸酶的催化下將其轉(zhuǎn)化生成卜蘋果酸鈣并且結(jié)晶析出。3結(jié)果與討論31酶反應(yīng)溫度對(duì)耦合轉(zhuǎn)化率的影響 任何酶催化作用本質(zhì)上是一種化學(xué)反應(yīng)?；瘜W(xué)反應(yīng)均以分子運(yùn)動(dòng)為基礎(chǔ)。酶催化反應(yīng)以酶分子與底物分子運(yùn)動(dòng)和分子與酶活性有關(guān)，基團(tuán)的碰撞絡(luò)合解離為基礎(chǔ)。分子動(dòng)能與溫度高低 直接相關(guān)。因此，溫度對(duì)酶的催化反應(yīng)速度有著不可分割的關(guān)系。在本文中，筆者研究考察了不同溫度對(duì)產(chǎn)氨短桿菌MA一2(Bammoniagenes

9、MA-2)、黃 色短桿菌MA一3(丑pa”um MA一3)反應(yīng)分離耦合生產(chǎn)p蘋果酸的影響。結(jié)果如圖1，在所研 究的溫度范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高，其轉(zhuǎn)化庠增大，40時(shí)為最大，25及50G下均較小。這是由于在較高的溫度下，延胡索酸酶失活速率增加，細(xì)胞中的延胡索酸酶蛋白發(fā)生變性而失 去催化活力，使最終轉(zhuǎn)化率降低，相反，在較低反應(yīng)溫度下，由于延胡索酸酶活力較低，因此， 最終酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率也較低。在加時(shí)，酶轉(zhuǎn)化反痘處于最佳狀態(tài)。j圈I 溫度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響圖2 pH對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響32 pH對(duì)酶反應(yīng)分離耦合的影響 ：酶同所有的蛋白質(zhì)一樣是可籍解的。酶在承溶液環(huán)境中的解離狀態(tài)和行為，均受到氫離子 的左右，

10、氫離子對(duì)酶的催化反應(yīng)有明顯的效應(yīng)，由圖2可知，當(dāng)pH=7075時(shí)，該酶轉(zhuǎn)化反 應(yīng)的平均轉(zhuǎn)化率為最大值，超過這一范圍，轉(zhuǎn)化率迅速下降，這說明延胡索酸酶在該反應(yīng)分離耦合過程中不同氫離子濃度下曳催化活力有顯著變化，只有在最佳離解狀態(tài)下才能與底物結(jié)合而表現(xiàn)出最大酶活力。33不同酶量對(duì)分離耦合反應(yīng)的蓐響 在底物富馬酸鈣大量存在吐，形成中間產(chǎn)鋤的量取決于延胡索酸酶的濃度，延胡索酸酶分子愈多。則底物富馬酸鈣轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物蘋果酸鈣盼蕈亦相應(yīng)地增加，研究中筆者取16只三角瓶分別分批加入3209富馬酸鈣，并在瓶中各加入產(chǎn)氟短桿菌MA一2、黃色短桿菌MA一3的酶發(fā)酵 液20，40，60，80，90，100，110，12

11、0ml，p礙=70，在40C下反應(yīng)25h后取樣分析，實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著兩菌酶發(fā)酵液量酌增加，轉(zhuǎn)化率不斷上升，當(dāng)兩菌酶發(fā)酵液量增至一定值其轉(zhuǎn)化率即為恒定值，如圖3所示。在該試驗(yàn)體系中取酶發(fā)酵液量為100ml，此時(shí)兩菌酶轉(zhuǎn)化率達(dá)99 9，即相當(dāng)于m延胡索酸酶發(fā)酵液能將32kg富馬酸鈣轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的蘋果酸鈣。7j：n?”圖3 酶液體積對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響圖4反應(yīng)分離耦臺(tái)進(jìn)程曲線34反應(yīng)分離藕合進(jìn)程曲線 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，筆者考察了反應(yīng)分離耦合工藝的進(jìn)程曲線，在兩只1L的燒杯中分別加入lOOm!產(chǎn)氨短桿菌MA一2、黃色短桿菌“A一3培養(yǎng)液，一次性加入底物富馬酸鈣，在攪拌狀態(tài)下連 續(xù)取樣分析蘋果酸含

12、量，計(jì)算出轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果如圖4所示，在開始反應(yīng)的前6h左右轉(zhuǎn)化效率 持續(xù)一個(gè)很低的水平，隨著時(shí)間的推移反應(yīng)轉(zhuǎn)化率不斷上升，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行至24h左右?？傮w轉(zhuǎn) 化率達(dá)999。用相同的方法進(jìn)行中試，根據(jù)酶培養(yǎng)液批次的不同，當(dāng)n酶培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化32t馬 酸鈣，且其轉(zhuǎn)化效率達(dá)999，所需轉(zhuǎn)化時(shí)間為2Q一28h。將該反應(yīng)生成的蘋果酸鈣進(jìn)行分離， 純化所得上一蘋果酸各項(xiàng)指標(biāo)均符美國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品中富馬酸殘留量在01左右，經(jīng)成本核算 達(dá)16萬元t，基本與化學(xué)合成法生產(chǎn)的DL一蘋果酸相當(dāng)，是固定化細(xì)胞生產(chǎn)成本的60。35反應(yīng)分離耦合中酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，實(shí)驗(yàn)中，底物富馬酸鈣的起始滲度C。為91102ItlolL，加入酶的初

13、始濃度為ck=1班，表1產(chǎn)氨短桿菌MA-2時(shí)闊與富馬酸鈣濃度的關(guān)系h乞c,，h島(m01，1102)c。一c； c。一c。5 7，0：5!5 2，7Oh955-6，3g 鰓昭鹋鉀亂盯絲一_3一 郎竹娃跖黔一拈釘們蝣鈣如一 嘶盯蚰珀；2鮞一 現(xiàn)以間歇操作測(cè)得了不同時(shí)間下富馬酸鈣濃度的變化，結(jié)果如表l，表2所示，并且在表中計(jì)算了!墮互，L一。根據(jù)實(shí)驗(yàn)提供的教據(jù)。以旦!：絲對(duì)上一作圖，結(jié)果如圖5所示。C。一c； c。c。 c。一C 8c。一c；487表2黃色短桿菌MA一3時(shí)問對(duì)富馬酸鈣濃度的關(guān)系竺。sm札剮曠1 萬c-cinc。fc；t一“1?！?_-。二=。=0258 441I39 3677057

14、761187 367707S 7 091240 36951 0642 13 003704I 5 5 071450 3704203 721661 3704一經(jīng)；：!。 12；塹 !Z：z由圖可知以生丘!對(duì)上一作圖為一象直線c。一c。 c。一c；這說明該反應(yīng)體系的反應(yīng)速率符備米氏方程，有：，吣f-(島一e)如ln(c巾e)將上述方程進(jìn)行整理可得：!壘!：上k一上。C。一c，c。c。K。K。由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可計(jì)算結(jié)果如表3。圖5以墊丘!對(duì)!作圖-c。一c；C。C；表3動(dòng)力學(xué)參數(shù)動(dòng)力學(xué)參數(shù) 產(chǎn)氨短桿菌M一2黃色短桿菌MA一3 如rnrnolL554 817 蔓s：竺竺!墊：塹 iQ：!因此，反應(yīng)分離耦臺(tái)

15、過程酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可用下述微分方程來表示 dCdt=2455X102c玎554X 103+c3 dCldt=3015)10c(8t7X 103H)參考文獻(xiàn)J Takata l,Kayashima K，Tosa T，et a1Improvement ofstability offumarase activit-：ofBflavum byimmobilizationwith K-carragedmn and polyetheneimineJFermentTechn011982，60(5)：43 12 Neufeld R J，Peleg Y，Pines O，et a1L-Malic acid form

16、ation by tmmobilized Saccharomyces cerevisiaeamplifed for fumaraseEnzyme Microb Technol 1991，13 02)：991 婦83 Takata l，Tosa T，et alReasons for the high stability offumarase activity ofBflavumcells immobilized with Kcarrageenan gel，Appl Biotecimol 1983，8(1)：394胡永紅，歐陽平凱固定化細(xì)胞生產(chǎn)蘋果酸新工藝及動(dòng)力學(xué)研究，化學(xué)反應(yīng)工程與工藝，1995

17、1l(1)：1317Study on the Optimal Conditions and Kinetics ofEnzyme in Simultaneous Reaefon andSeparation forL-Malic Acid productionHu Yonghong，Ouyang Pingkai。Chen Wuling，Cai Xinghai(Department ofBiotechnology&Bioengineering，Nanjing University ofChemicalTechnology，Nanjing210009)Abstract The free fumaras

18、e reaction system using the principle of the simultaneous bioreactionand the product separation processes were used for producing上一malic acidThe calcium fumaratewas used as substrate to produce calcium malate directlyThis new method WaS more advantageousthan the traditional immobilized cells conversion sys肆m in aspects such as simiple equipment and operation，high conversion efficiency and the yield of productThe results showed that at reaction temperature 40，pH7O75，reactioaB time 20,-28h