分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)小技巧

1、WORD格式分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)小技巧主要內(nèi)容1.SDS-PAGE2.雙向電泳3.質(zhì)粒提取4.Western Blot5.溶液配制6.PCR、酶切、連接并進(jìn)展凝膠檢測(cè)7.RNA提取與檢測(cè)8.其他SDS-PAGE1." "" " SDS-PAGE配制過程中，濃縮膠與別離膠可預(yù)先配好大體積如 100ml預(yù)制膠，儲(chǔ)存在 4 度冰箱注： 10% APS，TEMED不加，每次配置時(shí)只需吸取所需體積的預(yù)制膠參加相應(yīng)體積 APS， TEMED 即可，預(yù)制膠可儲(chǔ)存半年以上，能節(jié)省很多時(shí)間，更重要的是，可大大減少與丙稀酰胺的接觸，減少中毒。2." "&quo

2、t; "配膠過程中，普通的 SDS-PAGE中參加約 13%的甘油，可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的彌散。改進(jìn)過程只需將配方中的水改成 60%的甘油即可。3." "" "膠配好后，假設(shè)過夜使用，待凝聚后不要拔下梳子，把含膠玻璃板從制膠槽取下，注意玻璃板上下兩邊緣會(huì)有氣體，所以需要加一點(diǎn)電泳緩沖液以防止膠內(nèi)水分蒸發(fā)，用保鮮膜包上，然后放 4 度過夜，第二天在電泳槽內(nèi)直接拔下梳子即可使用。4." "" " 別離膠用水壓膠不平時(shí)，可以換用乙醇濃度無要求，干凈即可 ，效果較好。5." "

3、" " 配置別離膠時(shí)因膠凝時(shí)收縮常導(dǎo)致加樣孔變淺，可以將加剩的膠放入 4以降低凝聚速度，而將凝膠放入 37 度促聚，并隨時(shí)用 4加剩的膠補(bǔ)充下降的膠面；另外將膠橫放與水平面成 10 度角也可以減少收縮的影響。6." "" "丙烯酰胺放置時(shí)間過長(zhǎng)超過一年 ，會(huì)吸水潮解，導(dǎo)致膠不凝。7." "" "凝膠時(shí)溫度高凝膠快， 但過高時(shí)，會(huì)影響交連物的孔徑大小， 25為宜。專業(yè)資料整理WORD格式8." "" "氧氣是膠凝固的終止劑，所以盡量防止膠中氣泡出現(xiàn)。專業(yè)資料

4、整理WORD格式9." "" " 大腸表達(dá)檢測(cè)時(shí)，一般要煮樣，但煮出來時(shí)常較稠，用8M 尿素重懸細(xì)胞后再煮效果較好。10." "配好的 10×TBE經(jīng)過高壓滅菌后，不會(huì)形成沉淀，可以用很長(zhǎng)時(shí)間，而且跑出的條帶也很漂亮。11." "上樣時(shí)，最后保證上樣量一樣，包括體積，當(dāng)體積不同時(shí)，可以加緩沖液補(bǔ)全，這樣跑出的膠較為一致。所有的加樣孔都加樣，可以防止邊緣的樣品拖尾，如樣品不多，其余的孔均用上樣緩沖液加滿，防止影響條帶擴(kuò)散。12." "跑膠時(shí)，因?yàn)榈碗妷号軙?huì)防止高電壓產(chǎn)生的熱量爾導(dǎo)致的膠層

5、變形，所以低電壓泳道會(huì)比高電壓泳道跑的直一些，且別離效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白別離。13." "跑膠過程中，為節(jié)省時(shí)間， 可以提高電壓， 但得注意散熱，可以冰浴跑膠，將電泳槽放入盛有冰水的盆中， 或是冰箱中，節(jié)省的時(shí)間的同時(shí)， 效果也較好。14." "防止條帶跑歪：別離膠配好后 4 度過夜；在點(diǎn)樣的時(shí)候緊靠于上樣兩邊的點(diǎn)樣孔各上 20 微上樣緩沖液。15." "電泳完撬膠時(shí)根本不需要用撬膠板，用流水沖玻璃板的縫隙處也就是凝膠局部，一邊沖一邊輕輕掀起玻板，用水去充滿玻板和膠之間的縫隙，很容易能把玻板掀開。接下來把玻板反過來，讓

6、膠面朝下，使其一端浸入到一個(gè)盛著水的大平皿中，輕輕晃動(dòng)，膠很快就會(huì)被水帶到平皿中了，絲毫不會(huì)損傷膠。16." "染色時(shí)，為節(jié)省染色時(shí)間，可以先將染色液在微波爐內(nèi)加熱5-10 秒，不能太久，防止冰醋酸揮發(fā)，然后在水平搖床上放置半個(gè)小時(shí)即可染色好。如果是舊染色液，隔十分鐘加熱一次。 。17." "脫色時(shí)，可不用脫色液，直接用去離子水，放微波爐中高火里煮沸5 分鐘左右，然后將水倒掉，再換上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次即可。效果可能比正常的脫色稍差一點(diǎn)點(diǎn)， 不如那樣清楚， 只要電泳時(shí)比平時(shí)多上 1/5 的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時(shí)省材料用不著含甲醇和冰醋酸的脫

7、色液 。專業(yè)資料整理WORD格式18." "用硝酸銀染色，那么顯色時(shí)如果遲遲不出現(xiàn)條帶，可以再顯色夜里加一點(diǎn)專業(yè)資料整理WORD格式甲醛。如果染色或顯色沒有做好，染成了海帶膠，我們可以復(fù)染。將膠用一蒸水清洗 7.8 遍，再重新染色，顯色。19." "脫色時(shí)用 0.25M NaCl 代替脫色液，效果較好，無毒。20." "脫色時(shí)，在脫色液中參加婁X捏成條狀的擦鏡紙或是面巾紙，由于染料吸附到紙纖維上，可以加速脫色，待紙著色較深時(shí)，更換新紙條，不用換液。雙向電泳1." "" "向電泳玻璃板內(nèi)參加膠條時(shí)

8、，先在縫隙中參加配好的溴芬蘭緩沖液，要加滿，再將膠條貼后面玻璃板壁用薄塑料片將膠條緩緩?fù)葡轮聊z上緣，這樣可以很好的防止膠條下形成空氣泡。2." "" "一向電泳時(shí)，鹽離子容易聚在膠槽的兩側(cè)， 剪一小段 IPG膠條放在兩側(cè)，構(gòu)成鹽橋，電壓就容易上去了，防止一向電泳不好影響最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 。3." "" "在做第一相等電聚焦別離的時(shí)候，如果空氣濕度大，除濕很重要可通過空調(diào)或除濕機(jī)，要不等電聚焦儀起的鍍金電極會(huì)因?yàn)槔淠谏厦娴乃a(chǎn)生電火花而燒壞。""質(zhì)粒提取1." ""

9、; "質(zhì)粒提取時(shí)，最后一步的酒精揮發(fā)對(duì)后續(xù)酶切等至關(guān)重要，盡量延長(zhǎng)揮發(fā)時(shí)間，最好是在空調(diào)的熱風(fēng)中揮發(fā)。2." "" "加速燥的方法， 70%乙醇清洗過后，再加無水乙醇清洗再倒掉無水乙醇，加速揮發(fā)。3." "" " 利用試劑盒中硅膠柱手提質(zhì)粒，手提質(zhì)粒時(shí)，配置的溶液一、溶液二、溶液三代替試劑盒的 solution1、2、3，然后一比一的與飽和碘化鉀或碘化鈉代替結(jié)合緩沖液 混合，就可以讓質(zhì)粒在硅膠上結(jié)合， 而只要是一樣的質(zhì)粒，試劑盒的硅膠柱可以重復(fù)使用，沒有試劑盒溶液量的限制。專業(yè)資料整理WORD格式4.&q

10、uot; "" " 質(zhì)粒提取的最后一步用 TE水洗硅膠時(shí)，一般是加水后放置一分鐘，再離心收集 DNA。可以加水后當(dāng)即離心，再次把離心收集的液體重新加到硅膠柱上，放置一分鐘，離心，這樣得到的質(zhì)粒的回收率要高出 1030%，另外，同一種質(zhì)粒，用過的柱子可以反復(fù)使用 5 次。Western Blot1." "" " Western Blot在摸索一抗、二抗?jié)舛?，封閉時(shí)間，曝光時(shí)間等條件時(shí)，可以一次轉(zhuǎn)膜后，將膜晾干，裁減成小塊保存，每次取一小塊進(jìn)展條件摸索，可以防止每次都重新跑膠、轉(zhuǎn)膜甚至是重新提取蛋白，可以節(jié)省大量時(shí)間。2.&qu

11、ot; "" " Western Blot 時(shí)，轉(zhuǎn)膜后暫存晾干的膜于 4條件下比將蛋白保存在Buffer中更可靠。溶液配制1." "" "培養(yǎng)基試劑等配制過程中可先將各成分配成母液，并在常用試劑瓶上寫上該試劑配方，方便配制。2." "" "劇毒物質(zhì)配制過程中，以往是先根據(jù)要配的濃度與所需體積算好待稱物質(zhì)的量，其實(shí)可以先稱好有毒物質(zhì)，再去調(diào)整溶劑的體積，以防止長(zhǎng)時(shí)間與有毒物質(zhì)接觸。PCR、酶切、連接并進(jìn)展凝膠檢測(cè)。1." "" " PCR，酶切時(shí)，

12、可以將反響液除模板，引物，酶的其他成分配預(yù)混合制成 Mix 形式，儲(chǔ)貯在 -20冰箱中，用時(shí)取出分裝，可以防止每次條件不均。 。2." "" "菌落或菌液直接PCR時(shí)，預(yù)變性的時(shí)間延長(zhǎng)至5min，效果較好。3." "" " PCR的循環(huán)參數(shù)的第一步都是 94 或 95 度預(yù)熱 35 分鐘，延伸一般都是72，按照這些參數(shù)做 PCR一般都可以做出來，但在長(zhǎng)片段 PCR(>2kb)中，由于 DNA 模板在 94高溫 20 秒以上就會(huì)發(fā)生脫嘌呤反響， 當(dāng) taq 酶遇到模板上的這些錯(cuò)誤時(shí)就會(huì)停下來從而使反響不能繼續(xù)進(jìn)

13、展， 時(shí)間越長(zhǎng)，模板損壞也越嚴(yán)重，專業(yè)資料整理WORD格式得不到產(chǎn)物的可能性也越大， 另外，對(duì)于我們實(shí)驗(yàn)中用到的許多 taq 酶來說，72并不是其最正確的反響溫度。 如 Takara LA酶的最適反響溫度是 68，采用 92預(yù)熱 3 分鐘， 95變性 15-20 秒，退火后于 68延伸取得很好的效果，擴(kuò)過最長(zhǎng)的片段為 10kb。4." "" "雙酶切時(shí)，兩個(gè)酶單獨(dú)酶切效果要好很多。在第一個(gè)酶切完成后，將體系熱失活根據(jù)說明書，一般 65， 20min，再進(jìn)展第二個(gè)酶切。5." "" " 提高酶切效率的方法，將要進(jìn)展酶

14、切的質(zhì)粒 DNA直接放于 95的水浴鍋中 10 s，取出自然放冷，再加樣進(jìn)展酶切。6." "" "高 GC含量的酶切位點(diǎn)如 NotI，應(yīng)該用甲基化缺陷的宿主菌如 E.coli Top10 等。7." "" " 用酶切作檢測(cè)時(shí)，在微波爐里面加熱 1min 即可跑膠檢測(cè)，雙酶切可以考慮 2min，但酶切不夠充分，回收量可能不夠。8." "" "瓊脂糖凝膠跑完后可以二次點(diǎn)樣。9." "" " 跑膠過程中，先100V 電壓跑約 15min，再將

15、電壓調(diào)大至120-130V，進(jìn)行較小差異電泳，可以防止大片段殘存在膠孔不動(dòng)的情況，跑出來的帶較為漂亮且省時(shí)。10." "做連接時(shí)，連接 buffer 一定要防止反復(fù)凍融，可在第一次用時(shí)就分裝成小份，三次以上凍融會(huì)大大降低連接效率。RNA提取與檢測(cè)1." "" "" "RNA電泳過程中， 預(yù)電泳 5-10min 減少了非特異 RNA 條帶的出現(xiàn)， 有利于別離和純化，同時(shí)可根據(jù)電泳儀是否冒泡判斷電泳儀裝置是否有誤。 。2." "" "" "RNA點(diǎn)樣過程中，樣

16、品是在電泳緩沖液液略低于膠外表而不是在高過膠面時(shí)加進(jìn)齒槽，防止了加樣時(shí) RNA 的擴(kuò)散、加樣后 RNA 從齒槽逸出造成 RNA 的彌散及定位不良等現(xiàn)象。電 3-5min 讓 RNA 進(jìn)入凝膠后再加電泳緩沖液液高過外表，確保了加到每個(gè)槽中的 RNA量及定位的準(zhǔn)確性，從而有利于 RNA 的鑒專業(yè)資料整理WORD格式定和純化。 (亦適合于 DNA)。其他1." "" "超濾對(duì)于按照分子量進(jìn)展初別離的效果不是很好，但很適合用于蛋白的濃縮，更換緩沖液和除鹽。2." "" "蛋白質(zhì)純化時(shí)，蛋白質(zhì)降解可能與超聲破菌保持冰浴有關(guān)，之前建議加PMSF劇毒，蛋白降解抑制劑 ，建議在上柱子洗脫的時(shí)候也加 PMSF，一定要用之前再加。3." "" "垂直電泳時(shí)，可在電泳糟中放入青霉素小瓶等，可使液面提高而不影響電泳，又很節(jié)約電泳緩沖液。4." "" "柱層析時(shí)，如果樣品較多，可以將樣放在三角瓶中，用一個(gè)輸液管與柱上端連通，并持平，用槍頭引導(dǎo)液體流出，調(diào)好流速。 。5.&quo