豇豆輪紋病病菌產(chǎn)毒條件篩選及毒素活性測定

1、紅豆輪紋病病菌產(chǎn)毒條件篩選及毒素活性測定摘要采用種子萌發(fā)抑制率和種子胚芽抑制率的檢測方法，研究了紅豆輪紋病病原菌(Corynesporacassiicola)在不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液pH、光照和振法條件下粗毒素的產(chǎn)生及其活性。試驗結(jié)果表明：不同的培養(yǎng)條件下病原菌產(chǎn)生毒素活性不同，查彼培養(yǎng)液為局至培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)可以促進毒素的產(chǎn)生，最適的產(chǎn)毒pH為78,最適溫度為2025C,最佳培養(yǎng)時間為15d,光照條件下病原菌粗毒素的活性最大。紅豆輪紋病粗毒素對于不同寄主的活性測定結(jié)果表明：紅豆輪紋病菌毒素接種的10種供試植物中，大豆、菜豆致病反應(yīng)明顯，相對的病斑較大，而對黃瓜無致病力，不產(chǎn)生

2、病斑。關(guān)鍵詞紅豆輪紋??；多主棒抱菌；毒素；活性中圖分類號：S436.43文獻標(biāo)識碼：ADOI:10.3969/j.issn.05291542.2014.02.0100ptimizationofculturingconditionsfortoxinproductionbyCorynesporacassiicolaLiuZhihengLLiJianbingLAnXinl,LiWeilfCaoYouwen2fWangJunhel(l.PlantProtectionCollege,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyangl10866,China;2.PlantPr

3、otectionStationofZhangwuCounty,Fuxinl23200/China)AbstractToxinproductionbyCorynesporacassiicolawasinvestigatedunderdifferentculturemedium,culturingduration,temperature,pH,lightorshakingconditionsbydeterminingtheinhibitoryrateofseedgerminationandgermgrowth.Theresultsshowedthattoxinactivitywasdifferen

4、tunderdifferentcultureconditions.Theoptimalcultureconditionswereasfollows:pH7-8,20-25C,culturinginCzapek1sliquidmediumunderlightandshakingconditionsfor15h.Toxicitybioassaydemonstratedthatthecrudetoxinhadhightoxicitytosoybeansandkidneybeanswiththelargerlesion,whilenotoxicitytocucumberplants.Keywordsc

5、owpearingspot;Corynesporacassiicola;toxin;activity作遼寧的主要蔬菜作物之一，隨著栽培面積的擴大和栽培年限的增加，病害的種類和病原菌的種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大變化，出現(xiàn)了一些新病害。2011年8月作者在遼寧省新民市調(diào)查中發(fā)現(xiàn)一種新病害，該病害主要危害紅豆葉片，嚴(yán)重時也危害豆莢，病害蔓延迅速并且危害嚴(yán)重,在7-8月危害最重，病葉率達到60%以上,給紅豆生產(chǎn)造成了很大損失。作者通過病害癥狀描述、病原菌形態(tài)鑒定及分子序列比對，并經(jīng)柯赫氏法則證病，證明紅豆上新見病害輪紋病的病原菌為真菌多主棒泡（Corynesporacassiicola長期以來，種楂抗病品種和

6、施用化學(xué)農(nóng)藥在防治真菌病害中發(fā)揮了巨大作用，但由于多數(shù)病原真菌容易發(fā)生遺傳變異，因此，出販性菌株的現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生，并且高劑量的施用化學(xué)農(nóng)藥勢必會影響環(huán)境及食品的安全性。病菌致病粗毒素在適當(dāng)?shù)倪x擇劑量下可用于篩選高抗病水平的突變體1,病原菌的產(chǎn)毒能力與培養(yǎng)基類型和環(huán)境條件密切相關(guān)2為了明確毒素在病程中的作用和應(yīng)用粗毒素進行細(xì)胞突變體篩選，首先需要培養(yǎng)出大量的病菌粗毒素。然而對于紅豆輪紋病病原菌的毒素培養(yǎng)條件迄今未見報道。本研究在分離紅豆輪紋病的基礎(chǔ)上，初步探討了紅豆輪紋病菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)條件，以期為紅豆輪紋病的相關(guān)研究提供一定依據(jù)。1材料與方法1.1 供試材料供試作物選用9種：紅豆、菜豆、大豆、花生、

7、茄子、辣椒、絲瓜、黃瓜和西葫蘆。采用市售幼苗用于試驗。1.2 病原菌分離及毒素的提取2011-2012年，于遼寧省新民市露地栽培紅豆采集具有典型特征的輪紋病葉片，采用常規(guī)組織分離方法3進行病原菌分離和純化，并經(jīng)單泡分離獲得病菌純培養(yǎng)備用。40卷第2期劉志恒等：打豆輪紋病病菌產(chǎn)毒條件篩選及毒素活性測定2014采用常規(guī)方法培養(yǎng)獲取病菌毒素。將供試菌株于PDA平板培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)，用打孔器打取約0.5cm的菌餅4塊，置于下述供試液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。將不同條件培養(yǎng)獲得的病菌培養(yǎng)液用8層無菌紗布過濾,然后濾液用濾紙抽濾彳導(dǎo)到無菌濾液。將無菌濾液經(jīng)8000r/min離心10min,取得上清液即為病原菌粗毒素4

8、將所得的粗毒素接種于供試紅豆種子上，置于25C黑暗條件培養(yǎng)36h,計測種子萌發(fā)率及胚芽長度。13試驗方法13.1病原菌粗毒素產(chǎn)生條件的篩選培養(yǎng)液的篩選。試驗選用以下5種培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH均為7。(1)PD培養(yǎng)液：馬鈴薯200g,葡萄糖12g,蒸謠水1000mL0(2)PS培養(yǎng)液：馬鈴薯200g,蔗糖12g,蒸儲水1000mL0(3)Fries培養(yǎng)液：酒石酸鐵5g,KH2PO41.0g,NH4NO31.0g,MgSO4-7H2O0.5gfNaCI0.1g,CaCl20.1g,酵母浸膏1.0g,蔗糖30g,蒸儲水1000mL0(4)Czapek培養(yǎng)液:NaNO32g,K2HPO41g,KCI0.5g

9、,MgSO4-7H2O0.5g,FeS040.01g,蔗糖30g,蒸儲水1000mL0(5)Richard培養(yǎng)液:KN0310g,KH2PO45g,MgSO4-7H2O2.5g,FeCl30.02g,蔗糖50g,蒸儲水1000mL0培養(yǎng)時間篩選。設(shè)置3、6、9、12、15、18、21、24d計8個處理時間。將直徑0.5cm菌餅移入Fries培養(yǎng)液(前述預(yù)備試驗后選定)三角瓶中，于25C、黑暗條件、120r/min培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。分別于不同時間取樣制備紅豆輪紋病病菌粗毒素。試驗設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)pH篩選。設(shè)置pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共8個梯度處理。

10、將直徑05cm菌餅移入Fries培養(yǎng)液三角瓶中,培養(yǎng)溫度25,15d后取樣制備紅豆輪紋病病菌粗毒素。試驗設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)溫度篩選。設(shè)置溫度為5、10、15、20、25、30、35計7個培養(yǎng)溫度處理。將直徑為0.5cm菌餅移入Fries培養(yǎng)液三角瓶中分別培養(yǎng)，15d后取樣制備紅豆輪紋病病菌粗毒素。試驗設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)光照條件篩選。選擇3種條件：24h光照、24h黑暗、12h光照和12h黑暗交替。將直徑0.5cm菌餅移入Fries培養(yǎng)液中,于25C、120r/min培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。15d后取樣制備紅豆輪紋病病菌粗毒素。試驗重復(fù)3次。振蕩條件篩選。設(shè)置24h振蕩、24h靜置、12h靜置12h振蕩3

11、種條件。將直徑0.5cm菌餅移入Fries培養(yǎng)液三角瓶中，25C、黑暗、120r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。15d后取樣制備紅豆輪紋病病菌粗毒素。試驗重復(fù)3次。1.3.2病原菌粗毒素活性的測定葉片測定法。紅豆植株上的健康葉片用無菌水洗凈,采用針刺法將蘸有1mL粗毒素的脫脂棉放入傷口上,25C光照保濕培養(yǎng)，3d后觀察葉片處理部位的病變情況。以空白培養(yǎng)液為對照。幼苗浸漬法。取大約8cm株高的紅豆幼苗,放入裝有5mL紅豆輪紋病粗毒素的試管內(nèi)培養(yǎng)，觀察幼苗生長情況,以空白培養(yǎng)液為對照。不同植物敏感性測定。播種茄子、番茄、花生、大豆等作物，待作物46片葉時，采用針刺法，以蘸有紅豆輪紋病病菌粗毒素的脫脂棉接種供

12、試楂株葉片上，保濕培養(yǎng)觀察葉片針刺部位發(fā)病情況，測量病斑直徑大小。以空白培養(yǎng)液為對照。13.3粗毒素的生物活性測定取粗毒液5mL注入培養(yǎng)皿中作為種子萌發(fā)培養(yǎng)液，每皿放入20粒豆豆種子。重復(fù)5次。置于25。（2黑暗條件下培養(yǎng)36h,計測紅豆種子萌發(fā)數(shù)及胚芽長度,計算萌發(fā)率和胚芽抑制率。胚芽生長抑制率（）=對照胚芽平均長度-處理胚芽平均長度對照胚芽平均長度X100；種子萌發(fā)抑制率（%）=種子萌發(fā)數(shù)量種子總數(shù)量X100。13.4統(tǒng)計與分析每個處理重復(fù)5次，所得數(shù)據(jù)用SPSS和Excel軟件分析。2結(jié)果與分析2.1不同條件對病原菌毒素產(chǎn)生的影響不同的培養(yǎng)基病原菌毒素的產(chǎn)生量不同，在查彼培養(yǎng)液中的產(chǎn)生量

13、最大，種子萌發(fā)抑制率及胚芽抑制率均達到80%以上其次為Fries培養(yǎng)液，產(chǎn)生粗毒素最少的為PD培養(yǎng)液（表1表1病菌在不同培養(yǎng)液產(chǎn)生的粗毒素對虹豆種子萌發(fā)和胚芽生長抑制率的影響1）Table1Effectofcrudetoxinunderdifferentculturemediaontheinhibitoryrateofcowpeaseedgerminationandgermgrowth培養(yǎng)液Culturemedia種子萌發(fā)抑制率/%Inhibitionrateofseedgermination胚芽生長抑制率/%InhibitionrateofgermgrowthPD28.89el8.95fPS

14、41.lld35.73eRich45.56d54.57dFries70.00C70.66cCzapek83.33b81.18bCK98.00a98.00a1)根據(jù)Duncan分析，同列后相同寫字母表示數(shù)據(jù)間無顯著性差異（P=0.05 1Withinthesamecolumn,themeanswiththesamelowercaselettersindicatenosignificantdifferenceatP=0.05accordingtoDuncan1sanalysisofvariance.不同培養(yǎng)時間對病原菌粗毒素的影響見圖lo在培養(yǎng)3-15d之間，隨著時間的延長，種子萌發(fā)、胚芽生長抑制

15、率逐漸變大并且從圖中可知曲線的斜率較大，因此毒素的產(chǎn)生與培養(yǎng)時間具有一定的正相關(guān)。在15d時無論種子萌發(fā)抑制率還是胚芽生長抑制率均達到80%以上;在15-21d時，病原菌粗毒素隨著時間的延長種子萌發(fā)及胚芽生長抑制率均下降。據(jù)此認(rèn)為，病原菌產(chǎn)毒的最佳培養(yǎng)時間為15d0不同pH對病原菌粗毒素的影響根據(jù)圖2結(jié)果可知，紅豆輪紋病病原菌在pH29之間均可產(chǎn)生毒素。在pH28間，病原菌粗毒素的產(chǎn)生量隨pH值的增加而增加。在pH8時，抑制率最大，種子萌發(fā)抑制率71.35%,胚芽生長抑制率72.68%。當(dāng)pH為9時，抑制率下降為50%以下。據(jù)此確定病原菌產(chǎn)毒最佳pH為8。圖1病菌在不同時間產(chǎn)生的粗毒素對紅豆種

16、子萌發(fā)和胚芽生長抑制率的影響Fig.lEffectofcrudetoxinunderdifferentculturetimeontheinhibitionrateofcowpeaseedgerminationandgermgrowth圖2病菌在不同pH產(chǎn)生的粗毒素對紅豆種子萌發(fā)和胚芽生長抑制率的影響Fig.2EffectofcrudetoxinunderdifferentpHvaluesontheinhibitionrateofcowpeaseedgerminationandgermgrowth不同溫度對病原菌粗毒素的影響見圖3。由圖3可知，病原菌粗毒素在535C之間均可產(chǎn)生，對種子萌發(fā)及胚芽

17、的抑制率隨著溫度的升高逐漸增高。在25C時種子萌發(fā)抑制率達到最大為72.22%,胚芽生長抑制率為62.33%;而其后隨著溫度的升高抑制率逐漸降低，在35時種子萌發(fā)抑制率僅為28.89%,胚芽生長抑制率為38.36%。由此可知，紅豆輪紋病菌粗毒素在25時產(chǎn)生量最大。不同光照對病原菌粗毒素的影響見圖4。由圖4可知，光照條件下種子萌發(fā)抑制率達63.33%,胚芽生長抑制率為65.75%;而黑暗條件下種子萌發(fā)抑制率為48.89%,胚芽生長抑制率為49.32%。表明光照條件有利于病原菌粗毒素的產(chǎn)生。圖3病菌在不同溫度條件下產(chǎn)生的粗毒素對紅豆種子萌發(fā)和胚芽生長抑制率的影響Fig.3Effectofcrude

18、toxinunderdifferenttemperaturesontheinhibitionrateofcowpeaseedgerminationandgermgrowth圖4病菌在不同光照條件下產(chǎn)生的粗毒素對紅豆種子萌發(fā)和胚芽生長抑制率的影響Fig.4Effectofcrudetoxinunderdifferentlightconditionsontheinhibitionrateofcowpeaseedgerminationandgermgrowth不同振蕩條件對病原菌粗毒素的影響測定結(jié)果見圖5。不同振蕩條件對病原菌粗毒素的產(chǎn)生影響不同。間歇振蕩利于病原菌粗毒素產(chǎn)生，種子萌發(fā)抑制率達74.

19、44%,胚芽生長抑制率為7055%;而靜止培養(yǎng)下抑制率僅為40%。因此間歇振蕩培養(yǎng)利于病原菌粗毒素產(chǎn)生。2.2病原菌毒素活性測定結(jié)果針刺紅豆葉片接種粗毒素，3d后觀察到葉片上可產(chǎn)生類似于真菌感染后產(chǎn)生的病斑,病斑中心成黃褐色枯斑，周圍產(chǎn)生黃色暈圈，具明顯的同心輪紋。表明病菌粗毒素對葉片細(xì)胞組織具有致病危害作用。試驗結(jié)果為毒素在病程中是主要致病因子提供了佐證（圖61圖5病菌在不同振蕩條件下產(chǎn)生的粗毒素對紅豆種子萌發(fā)及胚芽生長抑制率的影響Fig.BEffectofcrudetoxinunderdifferentshakingconditionsontheinhibitoryrateofcowpea

20、seedgerminationandgermgrowth圖6針刺葉片接種毒素后的癥狀（24h）Fig.6Leafsymptomsafterstabinoculationwiththetoxin（24h）幼苗浸漬致萎法測定表明，虹豆輪紋病病菌粗毒素可以對紅豆幼苗產(chǎn)生明顯的毒害作用。毒素處理24h后，紅豆幼苗開始月兌水呈現(xiàn)青枯狀，48h后，用毒素處理的幼苗完全脫水姜香（圖7、圖7毒素處理后姜菁（2d）Fig.7Wiltingaftertreatmentwithtoxin（2d）不同寄主對粗毒素的敏感性測定結(jié)果表明（表2）,針刺接種3d后，10種供試植物中，豆科及茄科作物植株均產(chǎn)生不同程度的病斑，其

21、中大豆、菜豆、茄子上的病斑較大，分別為2.0、1.2、15cm;然而葫蘆科作物中的黃瓜及西葫蘆均未產(chǎn)生病斑，絲瓜病斑直徑為1.2cm;番茄、辣椒、花生病斑相對較小。表2不同寄主上毒素致病反應(yīng)測定1)Table2Toxicitydeterminationofthecrudetoxinondifferenthostplants寄主植物Hostplant病斑直徑/cmDiameteroflesions寄主植物Hostplant病斑直徑/cmDiameteroflesions番茄TomatoO.5e花生PeanutO.3f辣椒Pepper0.2f大豆Soybean2.0a茄子Eggplantl.5b西

22、葫蘆SquashOg菜豆Beanl.Od黃瓜CucumberOgalaCowpeal.2c絲瓜Suakwavegetablespongel.2c1)不同4號字母表示0.05水平差異顯著。Differentsmalllettersindicatedsignificantdifferenceat0.05level.3討論楂物病原菌毒素能使寄主產(chǎn)生特定癥狀反應(yīng)，在植物病害發(fā)生、發(fā)展過程中具有明顯致病或致毒作用，是一類重要的致病因子56L1975年Onesirosan等7最先報道了多主棒抱能產(chǎn)生毒性物質(zhì)。1983年，Toder8研究表明：病菌致病粗毒素在適當(dāng)?shù)倪x擇劑量下可用于篩選高抗病水平的突變體。然

23、而培養(yǎng)基內(nèi)毒素的產(chǎn)生量直接受培養(yǎng)基成分和外界環(huán)境條件的影響910因此為了篩選出抗病突變體，病原菌粗毒素培養(yǎng)條件的篩選是其基礎(chǔ)，但是在國內(nèi)尚無報道紅豆輪紋病粗毒素培養(yǎng)條件的篩選。本研究結(jié)果表明：紅豆輪紋病產(chǎn)毒最適培養(yǎng)液為查彼培養(yǎng)液，光照有利于病原菌粗毒素的產(chǎn)生。病原菌在035之間均可產(chǎn)生毒素，在25C時毒素的產(chǎn)量最高。在pH8的條件下粗毒素產(chǎn)生最多，振蕩可以促進病原菌粗毒素的產(chǎn)生。隨著時間的延長病原菌粗毒素產(chǎn)生量逐漸增加，在15d時達到最大。病原菌毒素活性測定結(jié)果顯示，針刺接種的離體葉片在48h后即可產(chǎn)生直徑為1cm的病斑，幼苗浸漬在毒素中48h后萎焉,由此可知病原菌粗毒素的致病性較高。在10種

24、供試寄主植物中，病原菌粗毒素可以侵染7種，其中大豆、茄子、菜豆等測試植株病斑最大達到1cm以上，從而證明其侵染寄主范圍之廣。因此，在生產(chǎn)實踐中，應(yīng)將虹豆與大豆、茄子、菜豆等敏感作物分離種植，避免作物之間的交叉感染，引起病害的蔓延，造成經(jīng)濟損失。本研究證實了紅豆輪紋病病菌粗毒素的致病性，明確了紅豆輪紋病病菌的產(chǎn)毒條件及致病性為毒素的純俗口進一步深入研究其理化特性、活性組分、致病機理及利用毒素進行抗病品種篩選提供了理論基礎(chǔ)。參考文獻1趙蕾,梁存元，張?zhí)煊?利用致病毒素篩選植物抗病突變體的研究進展J.生物技,2001,11(3):4143.2萬佐璽，強勝，徐尚成.鏈格抱菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)條件及其毒素的致病范圍J.中國生物防治,2001,17(1):10.