水體中微囊藻毒素的污染狀況和毒效應(yīng)及其檢測方法

1、水體中微囊藻毒素的污染狀況和毒效應(yīng)及其檢測方法    當(dāng)前,水體富營養(yǎng)化已成為全球性的環(huán)境問題。聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署發(fā)布的全球環(huán)境展望2004年年度報告(GEO-Year book of 2004)表明,在其所調(diào)查的66個水域中,有40%正遭受中、重程度富營養(yǎng)化的影響。近年來,我國各類水體都存在不同程度的富營養(yǎng)化問題,湖泊水庫表現(xiàn)得尤為明顯。據(jù)1999年對全國130余個湖泊的調(diào)查資料顯示,高營養(yǎng)化湖泊占調(diào)查總數(shù)的43.5%,中營養(yǎng)化湖泊占調(diào)查總數(shù)的45.0%;在我國東南部經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)的湖泊富營養(yǎng)化常伴隨著藻類的瘋長,而分布在城市和近郊的一些湖泊甚至達(dá)到了超營

2、養(yǎng)化狀態(tài)。在富營養(yǎng)化的水體中,藻類異常繁殖,形成水華。藍(lán)藻水華是最常見的淡水水華,它們大多數(shù)是有毒的。而微囊藻毒素是一種在藍(lán)藻水華污染中出現(xiàn)頻率最高,產(chǎn)量最大和造成危害最為嚴(yán)重的藻毒素。微囊藻毒素是強(qiáng)的致肝癌物質(zhì),長期接觸可引起肝癌。流行病學(xué)調(diào)查顯示,在我國東南沿海一些地區(qū)如江蘇啟東、海門和廣西綏遠(yuǎn)地區(qū)的原發(fā)性肝癌與飲用水源中微囊藻毒素的高本底含量密切相關(guān)。微囊藻毒素與人類健康的關(guān)系問題已成為生命科學(xué)界、醫(yī)學(xué)界和社會公眾廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)之一。為了減少微囊藻毒素對人類健康的影響,深入研究微囊藻毒素的結(jié)構(gòu)特性,了解其在水體和水生生物中的污染狀況以及毒效應(yīng)是非常必要的。1 微囊藻毒素的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)在

3、水華藍(lán)藻產(chǎn)生的毒素中,以銅綠微囊藻、魚腥藻和顫藻等所產(chǎn)生的微囊藻毒素最為普遍。微囊藻毒素(microcystin-MCYST,MC)是一類具有生物活性的環(huán)狀七肽化合物,由七個氨基酸構(gòu)成的環(huán)狀肽鏈分子(D-Ala-X-D-MeAsp-Z-Add-D-GluMdha/Dha),其結(jié)構(gòu)式如圖1。圖1 微囊藻毒素的結(jié)構(gòu)式其分子上1位是Ala-右旋-丙氨酸;2,4位上的X和Z分別代表不同的氨基酸;3位上是MeAsp-D-赤-甲基天冬氨酸;5位上是 (2S,3S,8S,9S)-3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-3甲基-10-苯基-4,6-二烯酸,簡稱Adda;6位上是Glu-異谷氨酸;7位上是Mdha-N

4、-甲基脫氫丙氨酸或Dha-脫氫丙氨酸。其中Adda是一種特殊的含20個碳原子的氨基酸,是微囊藻毒素生物活性表達(dá)所必需的基團(tuán)。由于MC在2,4位上取代基X、Z的不同,以及3、7位上Asp和Dha的甲基化和去甲基化就形成多種MC的異構(gòu)體,其中3種主要微囊藻毒素異構(gòu)體為MC-LR、MC-RR、MC-YR。L、R、Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸。世界上含量較多,分布較為廣泛的是MC-LR和MC-RR。在我國爆發(fā)水華的淡水湖泊中,往往會檢測到MC-LR和MC-RR。由于MC-LR存在較為普遍,產(chǎn)毒量較大,毒性強(qiáng),故現(xiàn)在在藻毒素研究上常以其為代表性指標(biāo),WHO以MC-LR含量為基準(zhǔn)推薦飲水藻毒素標(biāo)準(zhǔn)為1

5、.0 g/L。微囊藻毒素具有環(huán)肽結(jié)構(gòu),化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定。在實(shí)驗(yàn)室研究中,水庫水中低濃度的MC-LR(10 g/L)不到1周就可降解,在去離子水中超過27 d依然很穩(wěn)定,自然水庫中的不穩(wěn)定性可能是由于生物降解的作用。Takenake 等從湖泊表層水中分離出一種能夠產(chǎn)生堿性蛋白酶的細(xì)菌pseudomonas aeruginsa,它能夠?qū)⑺械腗C降解。張維昊等的研究表明,由于微生物作用,溶液中的微囊藻毒素可以半衰期為2.5 d左右的速率降解。純化的MC在陽光照射下依然是穩(wěn)定的,當(dāng)毒素暴露于波長在其吸收峰周圍紫外線時,通過額外的異構(gòu)化機(jī)制,更多的MC-LR、MC-RR被快速降解。此外,MC具有熱穩(wěn)定性

6、,加熱煮沸不易喪失毒性,在室溫條件下干燥的MC可以保存數(shù)年之久。由于毒素構(gòu)型的變化使毒性的大小差異很大,如MC-LR的毒性大大高于MC-RR。在自然條件下,溫度和光照對構(gòu)型的變化似乎起著很重要的作用,如不同的季節(jié),不同的水域甚至同一水域采集到同種微囊藻毒素的毒性會有很大的差異。2 微囊藻毒素的產(chǎn)生機(jī)制MC是細(xì)胞內(nèi)毒素,在細(xì)胞內(nèi)合成,細(xì)胞破裂后釋放出來并表現(xiàn)出毒性。由于它的環(huán)狀結(jié)構(gòu)及其氨基酸的特殊結(jié)構(gòu),一般認(rèn)為它不是由核糖體合成,而是由肽合成酶復(fù)合體合成的生物活性小肽。研究發(fā)現(xiàn),MC在藻類的對數(shù)生長期內(nèi)明顯增加,毒素主要集中于細(xì)胞內(nèi)部,對數(shù)生長末期達(dá)最大含量;停止生長后隨著藻細(xì)胞的死亡解體,細(xì)胞

7、內(nèi)的水溶性毒素不斷釋放進(jìn)入水體。MC產(chǎn)生的機(jī)制有很多學(xué)說,但到目前為止尚沒有令人信服的結(jié)論,現(xiàn)在常提到的有遺傳和環(huán)境因素。遺傳影響學(xué)說的支持者認(rèn)為,微囊藻有毒株(toxic strains)和無毒株(nontoxic strains)的毒性是由遺傳決定的;環(huán)境影響學(xué)說認(rèn)為MC的產(chǎn)生受微囊藻的生長期、光照、溫度和營養(yǎng)條件的影響,生長條件改變,毒性也發(fā)生變化,環(huán)境因子通過作用于細(xì)胞分裂速度而控制毒素產(chǎn)生。MC的產(chǎn)生與否由基因決定,現(xiàn)已從銅綠微囊藻染色體中分離出了產(chǎn)生MC的DNA片段Mcy基因,同時發(fā)現(xiàn)凡能夠產(chǎn)生藻毒素的藻種都含有Mcy基因,而不產(chǎn)生藻毒素的藻種有的也含有Mcy基因,說明基因的調(diào)控表

8、達(dá)易受到外界條件影響而改變。3 微囊藻毒素的污染狀況近10多年來,水體富營養(yǎng)化已成為一個全球關(guān)注的環(huán)境問題。據(jù)聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署(UNEP)的一項(xiàng)調(diào)查,在全球范圍內(nèi)30%40%的湖泊和水庫遭受了不同程度富營養(yǎng)化的影響。中國、美國、澳大利亞、德國、日本等20多個國家和地區(qū)都曾對其境內(nèi)的淡水湖泊、水庫等飲用水水源中的水華現(xiàn)象進(jìn)行了報道,分離并檢測出了主要毒素微囊藻毒素。1993年Fastner等對德國境內(nèi)12個富營養(yǎng)化水體進(jìn)行了調(diào)查,結(jié)果其中有9個檢測出了MC。國外學(xué)者也相繼報道了多起因微囊藻毒素污染導(dǎo)致人群、家畜、魚類患病甚至死亡的事件。近20年來,我國湖泊、水庫和江河水體的富營養(yǎng)化發(fā)展速度也相當(dāng)

9、快,全國淡水水體富營養(yǎng)化狀態(tài)日益嚴(yán)重,涉及范圍不斷擴(kuò)大。在對長江、黃河、松花江等主要河流以及江西鄱陽湖、江蘇太湖、安徽巢湖、武漢東湖、昆明滇池、上海淀山湖等幾大淡水湖泊的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)有大量藻類繁殖,并檢測到了藻毒素的存在。產(chǎn)生的毒素主要是MC,對人們飲用水的安全供給構(gòu)成了越來越嚴(yán)重的威脅。在我國許多地區(qū)是以湖泊、水庫作為飲用水源,從飲用水源水和出廠水中檢測出MC的報道也不少,其中水源水中MC最高可達(dá)54 g/L,而出廠水中最高達(dá)到2.7 g/L,是目前WHO所建議的飲用水中MC濃度的2倍多。微囊藻毒素不但污染水體而且可以污染水生生物。國外報道稱長期暴露于微囊藻毒素的魚類、蝦蟹體內(nèi)出現(xiàn)了微囊藻毒素

10、的生物富集。在實(shí)驗(yàn)室的條件下,以浮游植物密度和微囊藻毒素的濃度為基礎(chǔ),經(jīng)過40多個月的觀察分析,在水華前、水華及水華后等6個不同時間段,持續(xù)檢測到魚肝和肌肉中含有MC。徐海濱等對我國淡水湖泊MC污染水平和其在魚體內(nèi)的動態(tài)變化進(jìn)行了研究,用ELISA方法測定鄱陽湖的水樣及魚樣中微囊藻毒素濃度,結(jié)果顯示各采樣點(diǎn)魚肌肉和肝臟中都檢測出微囊藻毒素,進(jìn)一步提示藻毒素可以在生物鏈中富集。4 微囊藻毒素的毒效應(yīng)肝臟是MC主要的靶器官,急性中毒主要表現(xiàn)為肝臟腫大,淤血,肝體比重增加,肝臟細(xì)胞被破壞,肝臟出血壞死。已有研究結(jié)果表明,MC是以肝臟為靶器官的多肽毒素,通過對鼠或魚腹腔注射或經(jīng)口給予毒素染毒,可以使動

11、物在3 h內(nèi)迅速死亡,死亡前動物出現(xiàn)蒼白和虛脫并伴有抽搐,解剖觀察發(fā)現(xiàn)肝臟腫大,肝細(xì)胞小葉中心性壞死,肝細(xì)胞內(nèi)有大量的紅細(xì)胞,而其他部位呈缺血狀態(tài)及出血性休克的結(jié)果。MC對肝細(xì)胞影響的特點(diǎn)是細(xì)胞凋亡與活躍的細(xì)胞增殖相伴隨。胡志堅(jiān)等建立MC促肝癌動物模型對MC的促癌作用進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示, MC可顯著增加大鼠肝癌前指標(biāo)-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(-GT)的陽性率; MC可上調(diào)肝癌前病灶的主要凋亡抑制作用基因bc1-2的表達(dá),同時可下調(diào)促細(xì)胞凋亡作用基因bax的表達(dá)。進(jìn)一步證明MC有促癌作用,并且初步明確了調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的癌基因和抑癌基因表達(dá)可能是MC促癌過程的重要機(jī)制之一。MC作用于肝巨噬細(xì)胞,刺激細(xì)

12、胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素1(IL-1),IL-1再誘導(dǎo)產(chǎn)生可以引起急性炎癥反應(yīng)的物質(zhì),如前列腺素、血栓素及腫瘤壞死因子-(TNF-),這些物質(zhì)導(dǎo)致了肝臟損傷和壞死,并引起炎癥休克。此外一些實(shí)驗(yàn)還證實(shí),MC是腫瘤促進(jìn)劑,對免疫功能產(chǎn)生明顯的抑制作用。5 微囊藻毒素的檢測國內(nèi)外對微囊藻毒素的檢測方法目前可歸結(jié)為3種:生物分析法、化學(xué)分析法和免疫學(xué)檢測法。生物分析法是用動物急性毒性測定間接推算出MC的含量,一般無法準(zhǔn)確定量。因此目前使用較多的是后2種方法?；瘜W(xué)分析方法包括高效液相色譜(HPLC)、質(zhì)譜分析(MS)以及薄層色譜(TLC)等。液相色譜方法可與二極管陣列檢測器(DAD)、紫外檢測器(UV)或毛細(xì)管

13、電泳(CE)等聯(lián)用,MS法成本較高,但靈敏度高;液質(zhì)聯(lián)用(LC/MS)快速而精確,即使沒有標(biāo)準(zhǔn)毒素,在已知毒素相對分子質(zhì)量情況下也可定性和定量檢測;CE方法所需樣品量少,采用激光誘導(dǎo)的熒光檢測器能提高檢測靈敏度。以上方法可用來對MC進(jìn)行鑒別和定量,檢出限可達(dá)幾十到幾百ng/L。這些方法分離效率高,分析時間短,樣品體積小,但是多數(shù)方法必須通過與標(biāo)準(zhǔn)樣品的比對才能定性、定量且對檢測儀器精密度依賴程度高。免疫學(xué)檢測法包括酶聯(lián)免疫分析(ELISA)及蛋白磷酸酯酶抑制分析(PPIA),應(yīng)用此類分析方法篩選毒素的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,在處理大批樣品時分析速度快,工作原理簡單。在具備微囊藻毒素單克隆抗體、標(biāo)準(zhǔn)純毒

14、素和相關(guān)試劑的前提下,尤其是使用商品化的試劑盒時,ELISA方法是一種簡單、高效、快速的方法。缺點(diǎn)是不能很好鑒別毒素,會出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。此外,微囊藻毒素的檢測方法還有熒光探測、質(zhì)譜法和細(xì)胞毒性監(jiān)測技術(shù)等。微囊藻毒素的研究歷史已久,亦取得了很多有價值的研究成果。但在MC的產(chǎn)生機(jī)制、致癌性的分子機(jī)制等方面尚有很多值得深入探討的問題。研究MC的產(chǎn)生是受遺傳控制還是環(huán)境因子左右,尚無定論。對于建立高效的藻毒素制備、提純的方法,調(diào)查MC的污染狀況以及慢性、亞慢性暴露所引起的危害,應(yīng)予以足夠的重視。未來對MC的進(jìn)一步研究將集中于: MC進(jìn)入肝細(xì)胞的特殊傳輸機(jī)制的分子生物學(xué)研究,確證其是否為蛋白磷酸酶抑制劑

15、; 研究長期低濃度的MC對人體造成的危害,開展流行病學(xué)調(diào)查,提供淡水中MC的污染對人體健康影響的評價資料; 建立國際公認(rèn)的能反映MC損傷的靈敏指標(biāo); 有必要建立一種簡便、靈敏、定量準(zhǔn)確的檢測方法來測定水體中微囊藻毒素的含量;盡快建立對飲用水中微囊藻毒素的常規(guī)檢測方法,以確保人們?nèi)粘ｏ嬘盟陌踩蜕眢w的健康。6 參考文獻(xiàn)1國家環(huán)?？偩?1999年中國環(huán)境狀況公報. 環(huán)境保護(hù),2000,(6):3-8.2俞順章,趙寧,資小林,等.飲用水與我國原發(fā)性肝癌關(guān)系的研究.中華腫瘤雜志,2001,23(2):96-99.3陳剛,俞順章,衛(wèi)國榮.肝癌高發(fā)區(qū)不同飲用水類型中微囊藻毒素含量調(diào)查.中華預(yù)防醫(yī)學(xué),19

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