醫(yī)療器械無(wú)菌試驗(yàn)檢查要點(diǎn)指南(2010版)

1、醫(yī)療器械無(wú)菌試驗(yàn)檢查要點(diǎn)指南（2010版）無(wú)菌檢驗(yàn)是無(wú)菌醫(yī)療器械產(chǎn)品生產(chǎn)控制過程中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。其檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果判定及檢驗(yàn)人員業(yè)務(wù)能力等因素直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和安全。作為無(wú)菌醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)， 其無(wú)菌檢驗(yàn)工作應(yīng)由本企業(yè)獨(dú)立完成。本指南旨在幫助醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管人員增強(qiáng)對(duì)無(wú)菌檢驗(yàn)相關(guān)知識(shí)的認(rèn)識(shí)，指導(dǎo)和規(guī)范全市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管人員對(duì)醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)無(wú)菌檢驗(yàn)過程控制水平的監(jiān)督檢查工作，同時(shí),為醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)（以下簡(jiǎn)稱生產(chǎn)企業(yè)）在無(wú)菌檢驗(yàn)的過程管理要求提供參考和依據(jù)。當(dāng)國(guó)家相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)、檢查要求發(fā)生變化時(shí)，應(yīng)重新修訂本指南。一、適用范圍本指南適用于現(xiàn)場(chǎng)檢查、醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系考核、醫(yī)療器械生

2、產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范檢查、 醫(yī)療器械生產(chǎn)日常監(jiān)督等各項(xiàng)涉無(wú)菌檢驗(yàn)的檢查。二、檢查內(nèi)容檢查人員應(yīng)在充分了解生產(chǎn)企業(yè)無(wú)菌檢驗(yàn)活動(dòng)的情況下，對(duì)其無(wú)菌檢驗(yàn)過程的控制水平進(jìn)行客觀的檢查和評(píng)價(jià)。一般情況下，檢查人員可按照以下順序開展檢查工作，并適時(shí)做好相關(guān)記錄：1、了解產(chǎn)品特性及生產(chǎn)企業(yè)選擇的無(wú)菌檢驗(yàn)方法。常見的產(chǎn)品無(wú)菌檢查法包括直接接種法和薄膜過濾法。當(dāng)建立產(chǎn)品的無(wú)菌檢查方法時(shí)，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法能夠給出正確的結(jié)果。若該產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)按供試品無(wú)菌檢查的規(guī)定及有關(guān)要求進(jìn)行操作。對(duì)藥典規(guī)定的每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的

3、無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。2、了解檢驗(yàn)人員的專業(yè)背景、培訓(xùn)情況及工作經(jīng)歷?？赏ㄟ^查看學(xué)歷證書、培訓(xùn)證書 或當(dāng)面詢問檢驗(yàn)人員的方式，檢查無(wú)菌檢驗(yàn)人員是否具備微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過無(wú)菌技術(shù)的培訓(xùn)。3、現(xiàn)場(chǎng)察看無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室。無(wú)菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度 100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)（如在萬(wàn)級(jí)潔凈間內(nèi)配置超凈工作臺(tái)等）中進(jìn)行，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期監(jiān)測(cè)。4、現(xiàn)場(chǎng)察看無(wú)菌試驗(yàn)所需的設(shè)備和器具。其中，主要設(shè)備包括：恒溫培養(yǎng)箱（真菌、細(xì)菌）、恒溫水浴箱、壓力蒸汽滅菌器、電熱干燥箱、電子天平、光學(xué)顯微鏡、集菌儀、過濾裝置（無(wú)油真空泵、濾杯、濾頭

4、、濾瓶、微孔濾 膜、夾子）等；（從試驗(yàn)安全性考慮，建議陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)使用生物安全柜）主要器具有：試管及試管架、酒精燈、75 %乙醇棉、滅菌刻度吸管（1ml）、滅菌平皿（9cm）、 錐形瓶、三角燒瓶、滅菌剪刀、鐐子等。生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)采用可靠方法對(duì)與供試液接觸的所有器具滅菌，通常置壓力蒸汽滅菌器內(nèi) 121c 30分鐘，或置電熱干燥箱內(nèi) 160 c 2小時(shí)。器具滅菌后必須做好標(biāo)識(shí)，標(biāo)明滅菌的時(shí) 間和使用有效期。器皿在滅菌后，最多1周即用完。檢查時(shí)還應(yīng)注意清點(diǎn)培養(yǎng)皿的個(gè)數(shù)，與試驗(yàn)記錄中反映的培養(yǎng)基個(gè)數(shù)是否一致。5、對(duì)照生產(chǎn)企業(yè)有關(guān)無(wú)菌試驗(yàn)的管理制度、操作規(guī)程等相關(guān)技術(shù)文件，要求檢驗(yàn)人員 當(dāng)場(chǎng)操作或口述無(wú)菌檢

5、驗(yàn)的過程。（1）培養(yǎng)基制備生產(chǎn)企業(yè)可按藥典中的處方制備培養(yǎng)基，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在 2 c25 C、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在 3周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在1年內(nèi)使用。無(wú)菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無(wú)菌性檢查 及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無(wú)菌檢查前或與供試品的無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。（2）供試品的無(wú)菌檢查無(wú)菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。供試品無(wú)菌檢查所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證的方法相同。無(wú)菌試驗(yàn)過程中

6、，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對(duì)微生物無(wú)毒性。無(wú)菌操作時(shí)，對(duì)供試品容器表面應(yīng)用適宜的消毒液進(jìn)行徹底消毒，如果供試品容器內(nèi)有一定的真空度，可用適宜的無(wú)菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內(nèi)導(dǎo)入無(wú)菌空氣， 再按無(wú)菌操作起開容器取出內(nèi)容物。（3）培養(yǎng)及觀察含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng) 14天后，不能從外觀上判斷 有無(wú)微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷

7、是否 有國(guó)。在觀察試驗(yàn)結(jié)果的過程中，還應(yīng)考慮假陰性的影響。 其中影響假陰性發(fā)生的因素有：培養(yǎng)條件不能支持微生物的生長(zhǎng)（促生長(zhǎng)試驗(yàn)）；在無(wú)菌試驗(yàn)中，產(chǎn)品中釋放出了殺菌或微生物電解的物質(zhì)（消除抑菌物質(zhì)）；從滅菌處理到培養(yǎng)有一定的時(shí)間間隔（確定滅菌后產(chǎn)品的儲(chǔ)存條件及儲(chǔ)存時(shí)間）。（4）結(jié)果判斷生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷：若供試品管均澄清， 或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，即生長(zhǎng)的微生物非供試品所含。陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照管不得有菌生長(zhǎng)，否則試驗(yàn)無(wú)效。當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗(yàn)結(jié)

8、果無(wú)效： 無(wú)菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無(wú)菌檢查法的要求；回顧無(wú)菌試驗(yàn)過程， 發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；供試品管中生長(zhǎng)的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無(wú)菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無(wú)效，應(yīng)重試。重試時(shí)，重新取同量供試品，依法重試，若無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試 品符合規(guī)定；若有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定。6、查閱試驗(yàn)記錄。完整的試驗(yàn)記錄應(yīng)明確包含下列幾類信息：（1）樣品記錄，至少應(yīng)包括：取樣日期、樣品名稱、樣品規(guī)格、樣品批號(hào)、取樣地點(diǎn)、 取樣方式、取樣人、原始試驗(yàn)記錄序號(hào)。（2）滅菌物品制作記錄培養(yǎng)基：培養(yǎng)基名稱、培，養(yǎng)基批號(hào)、培養(yǎng)基用量（ g）、蒸

9、儲(chǔ)水用量（ml）、培養(yǎng)基 分裝數(shù)量、滅菌日期、滅菌的實(shí)際溫度和壓力、滅菌時(shí)間、制作人、培養(yǎng)基存放地點(diǎn)和有效 期等。器具：器具名稱、器具數(shù)量、滅菌日期、滅菌的實(shí)際溫度和壓力、 滅菌時(shí)間、制作人、 器具存放地點(diǎn)、有效期等。（3）原始試驗(yàn)記錄，至少應(yīng)包括：記錄名稱、記錄序號(hào)、樣品名稱、樣品唯一性標(biāo)識(shí) （例如：樣品號(hào)）、樣品規(guī)格、樣品批號(hào)、滅菌批號(hào)、樣品數(shù)量、取樣日期、檢驗(yàn)日期、檢 驗(yàn)依據(jù)、主要試驗(yàn)設(shè)備及器具、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)環(huán)境條件、試驗(yàn)結(jié)果（每日觀察的結(jié)果）、 試驗(yàn)結(jié)論、檢測(cè)人、復(fù)核人等。（4）廢棄物處理記錄，至少應(yīng)包括：廢棄物形態(tài)（固體、液體）、廢棄物數(shù)量、滅菌 時(shí)間和壓力、經(jīng)辦人、處理日期等。三

10、、其它應(yīng)注意的問題1、生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)確保樣品具有代表性：試驗(yàn)樣品應(yīng)從常規(guī)產(chǎn)品中能夠代表加工過程和條件的批中選擇。選擇樣品是隨機(jī)的。 試驗(yàn)樣品的選擇和處理技術(shù)應(yīng)明確，以免對(duì)樣品上所含的微生物的數(shù)量和種類造成污染和改變。試驗(yàn)樣品可以選擇制造過程中的不合格產(chǎn)品，它們應(yīng)該代表這個(gè)生產(chǎn)批的加工程序和條件。用于試驗(yàn)的不合格產(chǎn)品應(yīng)不會(huì)影響無(wú)菌測(cè)試的有效性。2、生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于供試品的選取、轉(zhuǎn)移過程要采取防止污染措施，確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。選取制作供試品的試驗(yàn)樣品時(shí)，樣品包裝須完好無(wú)損，尤其是只有一層包裝的樣品。進(jìn)入無(wú)菌檢驗(yàn)室的樣品若有兩層（或兩層以上）包裝的，需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆 除后，傳入實(shí)驗(yàn)室。3、

11、無(wú)菌檢驗(yàn)中接觸供試品的試驗(yàn)用具溫度不能過高以防可能存在的菌被燙死。對(duì)不同 種類和不同批次的產(chǎn)品，在拆包裝及夾取樣品時(shí)，應(yīng)更換試驗(yàn)用具（如：剪刀、鐐子）。4、進(jìn)入無(wú)菌操作室的所有培養(yǎng)基、供試品等的外表都應(yīng)采用適用的方法進(jìn)行消毒處理（如：紫外燈照射不少于 30分鐘），以避免將外包裝污染的微生物帶入無(wú)菌檢驗(yàn)室。出具 試驗(yàn)結(jié)果后，所有培養(yǎng)物須經(jīng)121c高壓滅菌30分鐘的處理。5、由于無(wú)菌檢驗(yàn)時(shí)間跨度較長(zhǎng)，因此過程的記錄應(yīng)能夠完整體現(xiàn)試驗(yàn)的全過程，對(duì)于在試驗(yàn)過程中出現(xiàn)的各種情況，均應(yīng)在記錄中客觀反映。參考資料一：常見的名詞解釋1、滅菌：殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過程。目前國(guó)際上規(guī)定，滅菌過

12、程必須使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10-6及以下。2、微生物：在顯微鏡下才能看到的微小實(shí)體，包括細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和病毒。3、無(wú)菌技術(shù)：是指在微生物試驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施，其中包括無(wú)菌環(huán)境設(shè)施、無(wú)菌試驗(yàn)器材以及無(wú)菌操作。4、無(wú)菌操作：是指在無(wú)菌環(huán)境條件下，在對(duì)無(wú)菌制品或無(wú)菌器械進(jìn)行檢驗(yàn)的過程中， 能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。5、培養(yǎng)條件：用于促進(jìn)微生物發(fā)育、生長(zhǎng)和繁殖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式的組合。6、需氧菌：在代謝中，有氧條件下才能生存的微生物。7、厭氧菌：在代謝中，沒有氧的條件下才能生存的微生物。8、抑細(xì)菌/抑霉菌試驗(yàn)：

13、用選定的微生物來(lái)演示某些物質(zhì)的存在能夠抑制這些微生物的 繁殖。9、促生長(zhǎng)試驗(yàn)：用于證明生長(zhǎng)培養(yǎng)基能夠支持微生物生長(zhǎng)的技術(shù)操作。10、假陰性：實(shí)際陽(yáng)性的無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果被變成了陰性。11、假陽(yáng)性：實(shí)際陰性的無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果被變成了陽(yáng)性。12、生物指示物：對(duì)特定滅菌工藝有確定的抗力，可供使用的微生物檢驗(yàn)器材。13、化學(xué)指示物：根據(jù)暴露于某種滅菌工藝所產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化，在一個(gè)或多個(gè) 預(yù)定工藝參數(shù)上顯示變化的指示器材。14、無(wú)菌保證水平（SAL）:滅菌后產(chǎn)品上存在單個(gè)活微生物的概率。參考資料二：無(wú)菌室空氣中菌落數(shù)的檢查無(wú)菌室在消毒處理完畢后，應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)。方法如下：取直徑約 90mm培養(yǎng) 皿，無(wú)菌

14、操作注入融化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20mL ,在30 c35 C培養(yǎng)48小時(shí)證明無(wú)菌后，取3只培養(yǎng)皿在無(wú)菌室操作臺(tái)或超凈工作臺(tái)平均位置打開上蓋，暴露30分鐘后蓋好，置30 C35 C培養(yǎng)48小時(shí)后取出檢查，3只雙碟上生長(zhǎng)的菌落數(shù)平均不得超過1個(gè)。無(wú)菌試驗(yàn)過程中應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)，方法同上。在試驗(yàn)開始進(jìn)行時(shí)打開平皿蓋，至試驗(yàn)結(jié)束蓋好照上法培養(yǎng)，應(yīng)符合上述要求。參考資料三：供試品數(shù)量的選擇檢驗(yàn)數(shù)量是指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按藥典附錄X m B中表1規(guī)定；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)按表 2、表3規(guī)定。表1、表2、表3中最少 檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的供試品用量。一般情況下

15、，供試品無(wú)菌檢查若采用薄膜過濾法，應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作陽(yáng)性對(duì)照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品1支（或瓶）作陽(yáng)性對(duì)照用。執(zhí)行GB/T14233.2的供試品數(shù)量應(yīng)滿足同一批號(hào)311個(gè)單位供試品。檢驗(yàn)量是指一次試驗(yàn)所用的供試品總量（g或ml）。除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種的供試品量按表2、表3規(guī)定。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則 應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時(shí)，檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直接接種法的總接種量，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物過濾。表1批出廠產(chǎn)品最少量檢驗(yàn)數(shù)量供試品批產(chǎn)量N（個(gè)）每種培養(yǎng)基最少檢驗(yàn)數(shù)量注射劑大體積注射

16、劑（ 100ml）100100V NK 50050010% 4個(gè)（取較多者）10個(gè)2% 20個(gè)（取較少者）2% 10個(gè)（取較少者）眼用及其他非注射產(chǎn)品2002005% 2個(gè)（取較多者）10個(gè)桶裝固體原料4每個(gè)容器4502% 10個(gè)容器（取較多者）1醫(yī)療器具1010010% 4件（取較多者）100V NK 50010件5002% 20件（取較少者）注:若每個(gè)容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基，那么表中的檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)加倍表2上市抽驗(yàn)樣品（液體制劑）的最少檢驗(yàn)量供試品量V每支樣品接入每管培養(yǎng)基最少檢驗(yàn)數(shù)量(ml)的最少樣品量（瓶或支）1全量201V 5一105 V 202ml1020 V 505ml105

17、0 V 10010ml1050 V 100（靜脈給藥）一10100 V 500500ml61每種培養(yǎng)基各接種 10支供試品.表3上市抽驗(yàn)樣品（固體制劑）的最少檢驗(yàn)量供試品裝量M （瓶或支）每支樣品接入每管培養(yǎng)基的 最少樣品量最少檢驗(yàn)數(shù)量 （瓶或支）M 50mg全量2050mge M 300mg10300mge M 5g500mg10一次性使用含藥產(chǎn)品整個(gè)產(chǎn)品10每種培養(yǎng)基各接種 10支供試品桶裝固體原料的最少檢驗(yàn)數(shù)量為4個(gè)包裝參考資料四：培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)應(yīng)注意培養(yǎng)條件：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基3035 c 14天；改良馬丁培養(yǎng)基2328 c 14天。選擇培養(yǎng)條件需考慮的因素：產(chǎn)品的性質(zhì)、制造方法、

18、潛在的微生物污染來(lái)源、可能遇到的微生物種類。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基必須在煮沸后，再進(jìn)行分裝、滅菌。1、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基酪月東（胰酶水解）15.0g、酵母浸出粉 5.0g、葡萄糖5.0g、氯化鈉2.5g、L-胱氨酸0.5g、 新配制的0.1%刃天青溶液1.0 ml、硫乙醇酸鈉 0.5g（或硫乙醇酸 0.3ml）、瓊脂0.75g、水 1000 ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH為弱堿性，煮沸， 濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié) pH值使滅菌后為 7.1 10.2。分裝至適宜的 容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深

19、度的1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5 ,否則，須經(jīng)100 c水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次， 并防止被污染。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30 C35 C培養(yǎng)。2、改良馬丁培養(yǎng)基月東5.0g、磷酸氫二鉀1.0g、酵母浸出粉 2.0g、硫酸鎂0.5g、葡萄糖20.0g、水1000 ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH值約為6.8,煮沸，加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié) pH值使滅菌后為6.4 M.2 ,分裝，滅菌。改良馬丁培養(yǎng)基置 23 c28 c培養(yǎng)。3、選擇性培養(yǎng)基按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的

20、處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同驗(yàn)證試驗(yàn)。4、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基月東10.0g、氯化鈉 5.0g、牛肉浸出粉 3.0g、水1000 ml取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2 M.2,分裝，滅菌。5、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按上述營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的處方及制法，加入14.0g瓊脂，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.2 M.2分裝，滅菌。6、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基按改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，加入14.0g瓊脂，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.4 i0.2 ,分裝，滅菌。參考資料五：培養(yǎng)基的適用性檢查1、無(wú)菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支(

21、瓶)，培養(yǎng)14天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。2、靈敏度檢查菌種：培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第 0代)，試驗(yàn)用菌種應(yīng)采用適宜的菌種保存技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn) 菌株的生物學(xué)特性。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26 003銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis ) CMCC (B) 63 501生抱梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64 941 白色念珠菌(Candida a

22、lbicans) CMCC(F) 98 001 黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F) 98 003 3、菌液制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中 或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生抱梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30 c35 C培養(yǎng)18小時(shí)24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂 培養(yǎng)基上，2328 c培養(yǎng)2448小時(shí)，上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu (菌落形成單位)的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2328 c培養(yǎng)57天，加入35

23、ml含0.05% (v/v)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫。然后，用適宜 的方法吸出抱子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含 0.05% (v/v)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶 液制成每1ml含抱子數(shù)小于100cfu的抱子懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28c可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉抱子懸液可保存在 28C,在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。4、培養(yǎng)基接種取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌、生抱梭菌各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照， 培養(yǎng)3天;取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基 5支,分別接

24、種小于100cfu的白色念珠菌、 黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng) 5天。逐日觀察結(jié)果。5、結(jié)果判定空白對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，若加菌的培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。參考資料六：方法驗(yàn)證試驗(yàn)1、菌種及菌液制備除大腸埃希菌(Escherichia coli ) CMCC(B) 4 4102 外，金黃色葡萄球菌、枯草芽抱 桿菌、生抱梭菌、白色念珠菌、 黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。 大腸埃希菌的菌液制備同金黃 色葡萄球菌。2、薄膜過濾法取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體

25、培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng) 基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。置規(guī)定溫度培養(yǎng) 35天，各試驗(yàn)菌同法操作。3、直接接種法取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽抱桿菌、生胞梭菌各2管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定量的供試品量，另 1管作為對(duì)照，按置規(guī)定的溫度培養(yǎng)35天。4、結(jié)果判斷與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作

26、用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量、 增加培養(yǎng)基的用量、 使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。參考資料七：供試品處理及接種培養(yǎng)基直接接種法：每個(gè)供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培 養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于 培養(yǎng)基體積的10% ,同時(shí)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml ,改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于 10ml。薄膜過濾法：將供試液混勻，過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。沖洗后，如用封閉式薄膜過濾器，分別將100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。如采用一般薄膜過濾器，取出濾膜，將其剪成 3等份，分別置于含 50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容 器中，其中一份做陽(yáng)性對(duì)照用。薄膜過濾法應(yīng)優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器，也可使用一般薄膜過濾器。無(wú)菌檢查用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.