PCR實驗室(相關(guān)資料)

1、PCR:即聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction),利用DNAft體外95c時解旋(變性),55C時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合(退火)，再調(diào)溫度至72c左右,DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈(延伸)。PCRZ實際就就是一個溫控設備，能在95C,55C,72c之間很好地進行溫度控制。根據(jù)DNAT增的目的與檢測的標準可以將PCRZ分為：普通PCRZ,梯度PCR儀，原位PCRZ,實時熒光定量PC做等幾類。普通PCRtZ:一般把一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀，稱之為普通PCR儀，也就就是傳統(tǒng)的PCR儀。如果要用

2、它做不同的退火溫度則需要多次運行。普通PCR儀主要應用于科研、教學、臨床醫(yī)學、檢驗、檢疫等。如:啟步BSW-2P,BSW-3P,ABI2720型梯度PCR儀：PCR反應能否成功，退火溫度就是關(guān)鍵，梯度PCR儀每個孔的溫度可以在指定范圍內(nèi)按照梯度設置，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適反應條件。一次性PCR擴增可以設置一系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)的稱之為梯度PCR儀。不同的DNA片段其最適合的退火溫度不同，通過設置一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次性PCR擴增就可以篩選出表達量高的最適合退火溫度進行有效的擴增。梯度PCR儀主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣既節(jié)約時間，也

3、節(jié)約成本。在不設置梯度的情況下亦可當做普通的PCR用。梯度PCR儀多應用于分子生物學、醫(yī)學、食品工業(yè)、司法科學、生物技術(shù)、環(huán)境科學、微生物學、臨床診斷、流行病學、遺傳學、基因芯片、基因檢測、基因克隆、基因表達等領(lǐng)域以聚合酶鏈式反應(PicymeraseChainReaction,PCR)為特征的、以檢測DNA/RNA為目的的各種病原體檢測及基因分析。如:啟步BSW-2T,BSW-3T,ABI9700,ABIVeriti,Bio-RadT100型原位PCR儀：PCR就是提取細胞或組織中的DNA進行基因擴增反應，而原位PCR就是保持細胞或組織的完整性.使PCR反應體系滲透到組織與細胞中，在細胞的靶

4、DNA所在的位置上進行基因擴增。不但可以檢測到靶DNA,而且還可以了解靶DNA存在于何種細胞中，更有利于探討靶DNA與細胞之間的關(guān)系。原位PCR儀主要應用于：(1)檢測外源性基因片段，提高檢出率，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等;(2)觀察病原體在體內(nèi)分布規(guī)律；(3)內(nèi)源性基因片段，如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等；(4)檢測導入基因；(5)遺傳病基因檢測如3地中海貧血。實時熒光定量PCRZ:在普通PCR儀設計基礎上增加熒光信號采集系統(tǒng)與計算機分析處理系統(tǒng)，形成了具有熒光定量功能的PCR儀器。其PCR擴增原理與普通PCR擴增原

5、理相同，在PCR擴增時加入的引物就是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物與熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴增。擴增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)，得出量化的實時結(jié)果輸出。熒光定量PCR儀有單通道，雙通道與多通道之分。當只用一種熒光探針標記的時候，選用單通道；有多種熒光標記的時候使用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記與目的基因表達產(chǎn)物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR,實現(xiàn)一次檢測多種目的基因的功能。熒光定量PCR儀主要應用于臨床醫(yī)學檢測、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。熒光定量檢測

6、技術(shù)在臨床診斷方面很多，主要集中在各種病原體引起疾病的臨床診斷，如肝炎類疾病、性病、與優(yōu)生優(yōu)育相關(guān)的疾病以及肺結(jié)核等等。通道:channel指的就是針對每一種熒光的檢測器，比如您在一個管中做多個顏色，針對多個靶基因。每個顏色需要一個檢測器來檢測熒光信號的強弱，每一個針對不同顏色的檢測器，就就是一個通道。在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時，為了確保實驗結(jié)果的精確性與準確性都要在實驗中使用ROX（一種熒光染料,ROX就是作為內(nèi)參的，即參照與校正實驗結(jié)果。在ABI的機器里顯示為紅色的水平線。如果您的擴增線在剛開始的時候就高于ROX證明有基因組DNA污染。）或?qū)Ｓ玫腞eferencedye,這些熒光染

7、料都必須單獨使用一個檢測通道。這樣以來，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個，而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道就是只為自已廠家的專用的熒光染料或試劑開放的，有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。選擇單通道實驗還就是多通道實驗？這就是要根據(jù)實驗需要來選擇的，如果有一個、兩個或就是三個基因要進行比較，并用瞧家基因進行對照，可以考慮選擇多通道實驗。多通道實驗的好處就是可以消除樣本加樣的誤差。但要克服的困難也比較多，一就是條件的優(yōu)化比較麻煩，即多種PCR反應以及探針要在同一個反應條件下進行，并且效率都要比較高，另一個困難就是要求相互之間沒有干擾，因

8、為干擾會影響到實驗結(jié)果。還有一個困難就是當一個基因的模板數(shù)顯著大于其她基因時，因為共用核甘酸等資源的原因，會讓模板數(shù)少的基因的定量值變小或變?yōu)榱?。因此一般兩通道的實驗比較多些，即一個基因進行多樣本比較，用瞧家基因進行對照。硬件設計：傳統(tǒng)的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大，而且無需特殊的耗材。有些傳統(tǒng)的96孔板的儀器采用鹵鴇燈激發(fā)、CCD檢測，這些光學結(jié)構(gòu)在96孔板的頂部，每個樣品孔距光源與檢測器的光程各不相同一一邊緣效應，對結(jié)果產(chǎn)生影響。為了保證精確、準確的實驗結(jié)果，這類儀器在實驗過程中通常會使用ROX（一種熒光染料）或?qū)Ｓ玫腞eferencedye作為參照校正實驗結(jié)果。鹵鴇燈的使用

9、壽命短、更換成本較高已經(jīng)成為很多用戶頭痛的問題。在實驗過程中鹵鴇燈作為一種熱光源，產(chǎn)生較多熱能對實驗結(jié)果有一定的影響。CCD最大的優(yōu)點就就是可以同時掃描所有樣品中的熒光信號，但就是靈敏度較低，而且同時檢測樣品間的熒光信號存在干擾。像ABI、Bio-rad公司生產(chǎn)的熒光定量PCR就屬于這一種。創(chuàng)新的離心式的儀器通常選用LED激發(fā)、PMT檢測，離心式的設計上避免了邊緣效應。LED光源就是冷光源對實驗沒有影響，因此無需采用其她熒光染料校正儀器，而且使用壽命長無需經(jīng)常更換。PMT每次只能收集單個熒光信號，但就是檢測靈敏度高。但這類儀器運行速度非常快，但也存在樣本量小、耗材昂貴、沒有梯度功能、存在時間積

10、分等缺點。Corbett的Rotor-gene系列與Roche的Lightcycler系列均為這一類儀器。在熒光定量PCR儀的眾多技術(shù)參數(shù)中，升降溫速度也就是廠家喜歡大力宣傳的指標。更快的升降溫，可以縮短反應進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應的時間，提高PCR的特異性。PC也驗室內(nèi)部分區(qū)圖圖1試劑儲存區(qū)圖2 標本制備區(qū)、PC雙驗室布局PCR實驗室原則上為試劑準備區(qū)、樣品制備區(qū)、擴增區(qū)與擴增產(chǎn)物分析區(qū)四個單獨的工作區(qū)域并設有專用走廊，各工作區(qū)域應設緩沖間，工作區(qū)與緩沖間宜安裝連鎖裝置。不同功能的工作區(qū)應就是分隔獨立的，各工作區(qū)有明顯的標志，不能直通，如果緊密相連，需安裝物品傳遞窗。前

11、兩區(qū)為擴增前區(qū)，后兩區(qū)為擴增后區(qū)，擴增前區(qū)與擴增后區(qū)應嚴格分開。實驗材料、試劑、記錄紙、筆、清潔材料等，只能從擴增前區(qū)流向擴增后區(qū)，即從試劑準備區(qū)一樣品制備區(qū)一擴增區(qū)一擴增產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆向流動。實驗室的氣流也應從擴增前區(qū)流向擴增后區(qū)不得逆向流動。各工作區(qū)頂部應安裝紫外燈,紫外燈的波長為254nm，每20itf一支40W的紫外燈。二、PC雙驗室各區(qū)功能及主要設備1、試劑準備區(qū)：主要進行試劑的制備、分裝與主反應混合液的制備。試劑與用于樣品制作的材料應直接運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其它區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的試劑。本區(qū)主要設備有天平、冰箱、離心機、加樣器、振蕩器等。對于

12、氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴格的要求。2、樣品制備區(qū)：主要進行樣品的保存、核酸（RNADNA混取、貯存及其加入至擴增反應管與測定DNA的合成。本區(qū)主要設備有冰箱、生物安全柜、離心機、加樣器、振蕩器、恒溫水浴等。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。3、擴增區(qū)：主要進行DNAT增。此外，已制備的DNA莫板（來自樣品制備區(qū)）的加入與主反應混合液（來自試劑準備區(qū)）制備成反應混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。本區(qū)主要設備有：擴增儀、冰箱、離心機、加樣器等。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。4、擴增產(chǎn)物分析區(qū)：擴增產(chǎn)物的測定。本區(qū)主要設

13、備有酶標儀、洗板機、加樣器與水浴箱等。本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。三、PC雙驗室通風系統(tǒng)及壓力控制各區(qū)域之間應具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止氣溶膠擴散對實驗過程造成污染。PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但就是為避免各個實驗區(qū)域交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式，嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。四、PC雙驗室裝飾實驗室圍護結(jié)構(gòu)應牢固、氣密性好；所有陰陽角宜采用圓弧過渡；墻體內(nèi)壁光潔、不積塵、耐腐蝕、易清洗消毒；地面使用Pvoe材或環(huán)氧機w旨自流坪，材料

14、應滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕的要求。五、pc雙驗室注意事項1、幾個區(qū)域的大小設置情況，試劑準備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)，空間可以相對小一些，樣品制備區(qū)要放置生物安全柜與低溫冰箱，空間應大一些。2、試劑準備區(qū)、樣品制備區(qū)設緊急洗眼器，以保證操作人員的安全。3、PCR實驗室沒有嚴格的凈化要求，可以根據(jù)用戶的使用情況與資金的投入選擇。病理科病理診斷試劑及配套設備全系列的產(chǎn)品，涵蓋了液基細胞學、免疫組織化學與分子基因診斷。產(chǎn)品包括液基細胞學系列產(chǎn)品、熒光原位雜交技術(shù)、熒光定量PC叱術(shù)、一代測序技術(shù)、液相基因芯片技術(shù)等先進技術(shù)相關(guān)的儀器、試劑與耗材。沉降式全自動制片染色系統(tǒng)：根據(jù)人體不同類型細胞

15、其比重不同的特點,尤其就是病變細胞比重大、沉降速度快，與特殊處理后的載玻片相互吸引，從而最大程度地捕捉病變細胞與具有診斷價值的成分，自動濕染色，最終制成背景清晰、診斷線索明確的單層細胞薄片。全自動沉降式制片染色系統(tǒng)每批次可以處理1-24個標本，每天7小時可以處理300張制片，單片獨立滴染，染液一次性使用，避免樣本交叉污染。沉降式全自動液基細胞學制片染色系統(tǒng)廣泛應用于宮頸癌篩查，同時診斷痰細胞、尿液細胞、漿膜腔細胞、針吸細胞與內(nèi)窺鏡細胞。熒光原位雜交（FISH）:FISH就是在細胞水平上檢測染色體數(shù)目與基因數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常的分子生物學技術(shù)，其基本原理就是用熒光標記的核酸探針，經(jīng)過變性退火，與樣本中

16、堿基互補序列特異性結(jié)合成DNA雙鏈，然后通過熒光顯微鏡檢測分析。由于FISH技術(shù)具有直觀、快速、敏感性高與方便靈活的特性，已經(jīng)廣泛應用于腫瘤遺傳學、基因相關(guān)疾病的分型與腫瘤個體化治療等領(lǐng)域。液相芯片技術(shù)就是以100種不同熒光編碼的微球作為探針的載體，生物分子間的反應在懸浮液態(tài)體系中進行的一類新的生物芯片技術(shù)。在這個靈活與開放的平臺中可進行蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的檢測、液相芯片較傳統(tǒng)的固相芯片的優(yōu)勢在于檢測準確、信息質(zhì)量穩(wěn)定、可重復性好。液相芯片以其易于操作、高通量、高靈敏度、高準確度、高精密度以及寬的線性測定范圍的特點，逐漸進入了臨床診斷領(lǐng)域。液相基因芯片：將預先人工合成的寡核甘酸探針共價連

17、接于微球表面構(gòu)成。液相基因芯片除具有一般固相基因芯片的功能如核甘酸測序、單核甘酸多態(tài)性分析、基因作圖等，還具有精確的同時定性、定量分析特征。液相蛋白芯片：臨床檢測包括:1抗原抗體定量定性檢測；2細胞因子檢測。測序技術(shù)第一代-Sanger鏈終止法一代測序技術(shù)就是20世紀70年代中期由FredSanger及其同事首先發(fā)明。其基本原理就是,聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠把長度只差一個核甘酸的單鏈DN冊子區(qū)分開來。一代測序?qū)嶒灥钠鹗疾牧暇褪蔷坏膯捂淒NA分子。第一步就是短寡聚核甘酸在每個分子的相同位置上退火，然后該寡聚核甘酸就充當引物來合成與模板互補的新的DNA鏈。用雙脫氧核昔酸作為鏈終止試劑（雙脫氧核甘酸

18、在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3-OH®團，所以可被用作鏈終止試劑）通過聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子后再進行分離的方法。測序引物與單鏈DNA莫板分子結(jié)合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反應分四組進行，每一組分別用四種ddNTP«脫氧核甘酸)中的一種來進行終止，再用PAG吩析四組樣品。從得到的PAGE交上可以讀出我們需要的序列。第二代-大規(guī)模平行測序大規(guī)模平行測序平臺(massivelyparallelDNAsequencingplatform)的出現(xiàn)不僅令DNA測序費用降到了以前的百分之一，還讓基因組測序這項以前專屬于大型測序中心的“特權(quán)”能夠被眾

19、多研究人員分享。新一代DNAM序技術(shù)有助于人們以更低廉的價格，更全面、更深入地分析基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)之間交互作用組的各項數(shù)據(jù)。市面上出現(xiàn)了很多新一代測序儀產(chǎn)品，例如美國RocheAppliedScience公司的454基因組測序儀、美國Illumina公司與英國Solexatechnology公司合作開發(fā)的Illumina測序儀、美國AppliedBiosystems公司的SOLiD測序儀。Illumina/SolexaGenomeAnalyzer測序的基本原理就是邊合成邊測序。在Sanger等測序方法的基礎上，通過技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標記四種不同的dNTP,當DNAm合酶合成互補鏈

20、時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號并經(jīng)過特定的計算機軟件處理從而獲得待測DNA勺序列信息。以Illumina測序儀說明二代測序的一般流程,(1)文庫制備，將DN刖霧化或超聲波隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段。用聚合酶與外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個核甘酸黏性末端。然后將Illumina測序接頭與片段連接。(2)簇的創(chuàng)建，將模板分子加入芯片用于產(chǎn)生克隆簇與測序循環(huán)。芯片有8個縱向泳道的硅基片。每個泳道內(nèi)芯片表面有無數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預擴增使用。

21、通過不斷循環(huán)獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。(3)測序，分三步：DNA聚合酶結(jié)合熒光可逆終止子，熒光標記簇成像，在下一個循環(huán)開始前將結(jié)合的核甘酸剪切并分解。(4)數(shù)據(jù)分析。-第三代-高通量、單分子測序被稱為第三代的測序的He-licos單分子測序儀，PacificBioscience的SMR敢術(shù)與OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子測序技術(shù)正向著高通量、低成本、長讀取長度的方向發(fā)展。不同于第二代測序依賴于DNA莫板與固體表面相結(jié)合然后邊合成邊測序，第三代分子測序，不需要進行PCFT增。(1)HelicoBioScience單分子測序技術(shù)。該測序就是

22、基于邊合成邊測序的思想，將待測序列隨機打斷成小分子片段并用末端轉(zhuǎn)移酶在3'末端加上poly(A),以及在poly(A)的末端進行熒光標記與阻斷，把這些小片段與帶有poly(T)的平板雜交成像來獲得已經(jīng)雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測序的位點加入聚合酶與被Cy3熒光標記脫氧核甘酸進行DNA合成，每次只加入一種脫氧核甘酸，然后將未參與合成的dNTP與DNAM合酶洗脫，直接對Cy3成像，觀測模板位點上就是否有熒光信號，然后化學裂解核甘酸上的燃料并釋放加入下一種脫氧核甘酸與聚合酶的混合物，進行下一輪反應。（2）PacificBioscienceSMRTT技術(shù)。該測序也就是基于邊合成邊測序的原理，這項技于使用了Zero-ModeWaveguide（ZMW）（零級波導）。測序的過程：被熒光標記磷酸集團的核甘酸在聚合酶活性位點上與模板鏈結(jié)合（每種脫氧核甘酸被不用顏色的染料標記）,被激發(fā)出熒光，在熒光脈沖結(jié)束后,被標記的磷酸集團被切割并釋放，聚合酶轉(zhuǎn)移到下一個位置，下一個脫氧核甘酸連接到位點上開始釋放熒光脈沖，進行下一個循環(huán)。（3）OxfordNanoporeTechnologies的納米孔單分子測序技術(shù)。大多數(shù)納米孔測序技術(shù)的基本原理就是當DNA分子或者它的組成堿基從一個孔洞經(jīng)過時而檢測到被影響的電流或光信號。OxfordNanopore測序技術(shù)就是