PCR實(shí)驗(yàn)室(相關(guān)資料)

1、PCR:即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction),利用DNAft體外95c時(shí)解旋(變性),55C時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合(退火)，再調(diào)溫度至72c左右,DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈(延伸)。PCRZ實(shí)際就就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在95C,55C,72c之間很好地進(jìn)行溫度控制。根據(jù)DNAT增的目的與檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)可以將PCRZ分為：普通PCRZ,梯度PCR儀，原位PCRZ,實(shí)時(shí)熒光定量PC做等幾類。普通PCRtZ:一般把一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，稱之為普通PCR儀，也就就是傳統(tǒng)的PCR儀。如果要用

2、它做不同的退火溫度則需要多次運(yùn)行。普通PCR儀主要應(yīng)用于科研、教學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)、檢疫等。如:啟步BSW-2P,BSW-3P,ABI2720型梯度PCR儀：PCR反應(yīng)能否成功，退火溫度就是關(guān)鍵，梯度PCR儀每個(gè)孔的溫度可以在指定范圍內(nèi)按照梯度設(shè)置，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適反應(yīng)條件。一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)的稱之為梯度PCR儀。不同的DNA片段其最適合的退火溫度不同，通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增就可以篩選出表達(dá)量高的最適合退火溫度進(jìn)行有效的擴(kuò)增。梯度PCR儀主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣既節(jié)約時(shí)間，也

3、節(jié)約成本。在不設(shè)置梯度的情況下亦可當(dāng)做普通的PCR用。梯度PCR儀多應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)、司法科學(xué)、生物技術(shù)、環(huán)境科學(xué)、微生物學(xué)、臨床診斷、流行病學(xué)、遺傳學(xué)、基因芯片、基因檢測(cè)、基因克隆、基因表達(dá)等領(lǐng)域以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PicymeraseChainReaction,PCR)為特征的、以檢測(cè)DNA/RNA為目的的各種病原體檢測(cè)及基因分析。如:啟步BSW-2T,BSW-3T,ABI9700,ABIVeriti,Bio-RadT100型原位PCR儀：PCR就是提取細(xì)胞或組織中的DNA進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，而原位PCR就是保持細(xì)胞或組織的完整性.使PCR反應(yīng)體系滲透到組織與細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶

4、DNA所在的位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增。不但可以檢測(cè)到靶DNA,而且還可以了解靶DNA存在于何種細(xì)胞中，更有利于探討靶DNA與細(xì)胞之間的關(guān)系。原位PCR儀主要應(yīng)用于：(1)檢測(cè)外源性基因片段，提高檢出率，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等;(2)觀察病原體在體內(nèi)分布規(guī)律；(3)內(nèi)源性基因片段，如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等；(4)檢測(cè)導(dǎo)入基因；(5)遺傳病基因檢測(cè)如3地中海貧血。實(shí)時(shí)熒光定量PCRZ:在普通PCR儀設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上增加熒光信號(hào)采集系統(tǒng)與計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，形成了具有熒光定量功能的PCR儀器。其PCR擴(kuò)增原理與普通PCR擴(kuò)增原

5、理相同，在PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物就是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物與熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。熒光定量PCR儀有單通道，雙通道與多通道之分。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時(shí)候，選用單通道；有多種熒光標(biāo)記的時(shí)候使用多通道。單通道也可以檢測(cè)多熒光的標(biāo)記與目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因?yàn)橐淮沃荒軝z測(cè)一種目的基因的擴(kuò)增量，需多次擴(kuò)增才能檢測(cè)完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR,實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)多種目的基因的功能。熒光定量PCR儀主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。熒光定量檢測(cè)

6、技術(shù)在臨床診斷方面很多，主要集中在各種病原體引起疾病的臨床診斷，如肝炎類疾病、性病、與優(yōu)生優(yōu)育相關(guān)的疾病以及肺結(jié)核等等。通道:channel指的就是針對(duì)每一種熒光的檢測(cè)器，比如您在一個(gè)管中做多個(gè)顏色，針對(duì)多個(gè)靶基因。每個(gè)顏色需要一個(gè)檢測(cè)器來檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，每一個(gè)針對(duì)不同顏色的檢測(cè)器，就就是一個(gè)通道。在使用有些廠家5通道的熒光定量?jī)x時(shí)，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性與準(zhǔn)確性都要在實(shí)驗(yàn)中使用ROX（一種熒光染料,ROX就是作為內(nèi)參的，即參照與校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在ABI的機(jī)器里顯示為紅色的水平線。如果您的擴(kuò)增線在剛開始的時(shí)候就高于ROX證明有基因組DNA污染。）或?qū)Ｓ玫腞eferencedye,這些熒光染

7、料都必須單獨(dú)使用一個(gè)檢測(cè)通道。這樣以來，真正能檢測(cè)多重PCR熒光信號(hào)的有效通道只有4個(gè)，而且使用校正染料可能會(huì)增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測(cè)通道就是只為自已廠家的專用的熒光染料或試劑開放的，有效檢測(cè)通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。選擇單通道實(shí)驗(yàn)還就是多通道實(shí)驗(yàn)？這就是要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來選擇的，如果有一個(gè)、兩個(gè)或就是三個(gè)基因要進(jìn)行比較，并用瞧家基因進(jìn)行對(duì)照，可以考慮選擇多通道實(shí)驗(yàn)。多通道實(shí)驗(yàn)的好處就是可以消除樣本加樣的誤差。但要克服的困難也比較多，一就是條件的優(yōu)化比較麻煩，即多種PCR反應(yīng)以及探針要在同一個(gè)反應(yīng)條件下進(jìn)行，并且效率都要比較高，另一個(gè)困難就是要求相互之間沒有干擾，因

8、為干擾會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。還有一個(gè)困難就是當(dāng)一個(gè)基因的模板數(shù)顯著大于其她基因時(shí)，因?yàn)楣灿煤烁仕岬荣Y源的原因，會(huì)讓模板數(shù)少的基因的定量值變小或變?yōu)榱恪Ｒ虼艘话銉赏ǖ赖膶?shí)驗(yàn)比較多些，即一個(gè)基因進(jìn)行多樣本比較，用瞧家基因進(jìn)行對(duì)照。硬件設(shè)計(jì)：傳統(tǒng)的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大，而且無(wú)需特殊的耗材。有些傳統(tǒng)的96孔板的儀器采用鹵鴇燈激發(fā)、CCD檢測(cè)，這些光學(xué)結(jié)構(gòu)在96孔板的頂部，每個(gè)樣品孔距光源與檢測(cè)器的光程各不相同一一邊緣效應(yīng)，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。為了保證精確、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這類儀器在實(shí)驗(yàn)過程中通常會(huì)使用ROX（一種熒光染料）或?qū)Ｓ玫腞eferencedye作為參照校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果。鹵鴇燈的使用

9、壽命短、更換成本較高已經(jīng)成為很多用戶頭痛的問題。在實(shí)驗(yàn)過程中鹵鴇燈作為一種熱光源，產(chǎn)生較多熱能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。CCD最大的優(yōu)點(diǎn)就就是可以同時(shí)掃描所有樣品中的熒光信號(hào)，但就是靈敏度較低，而且同時(shí)檢測(cè)樣品間的熒光信號(hào)存在干擾。像ABI、Bio-rad公司生產(chǎn)的熒光定量PCR就屬于這一種。創(chuàng)新的離心式的儀器通常選用LED激發(fā)、PMT檢測(cè)，離心式的設(shè)計(jì)上避免了邊緣效應(yīng)。LED光源就是冷光源對(duì)實(shí)驗(yàn)沒有影響，因此無(wú)需采用其她熒光染料校正儀器，而且使用壽命長(zhǎng)無(wú)需經(jīng)常更換。PMT每次只能收集單個(gè)熒光信號(hào)，但就是檢測(cè)靈敏度高。但這類儀器運(yùn)行速度非常快，但也存在樣本量小、耗材昂貴、沒有梯度功能、存在時(shí)間積

10、分等缺點(diǎn)。Corbett的Rotor-gene系列與Roche的Lightcycler系列均為這一類儀器。在熒光定量PCR儀的眾多技術(shù)參數(shù)中，升降溫速度也就是廠家喜歡大力宣傳的指標(biāo)。更快的升降溫，可以縮短反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應(yīng)的時(shí)間，提高PCR的特異性。PC也驗(yàn)室內(nèi)部分區(qū)圖圖1試劑儲(chǔ)存區(qū)圖2 標(biāo)本制備區(qū)、PC雙驗(yàn)室布局PCR實(shí)驗(yàn)室原則上為試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)與擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域并設(shè)有專用走廊，各工作區(qū)域應(yīng)設(shè)緩沖間，工作區(qū)與緩沖間宜安裝連鎖裝置。不同功能的工作區(qū)應(yīng)就是分隔獨(dú)立的，各工作區(qū)有明顯的標(biāo)志，不能直通，如果緊密相連，需安裝物品傳遞窗。前

11、兩區(qū)為擴(kuò)增前區(qū)，后兩區(qū)為擴(kuò)增后區(qū)，擴(kuò)增前區(qū)與擴(kuò)增后區(qū)應(yīng)嚴(yán)格分開。實(shí)驗(yàn)材料、試劑、記錄紙、筆、清潔材料等，只能從擴(kuò)增前區(qū)流向擴(kuò)增后區(qū)，即從試劑準(zhǔn)備區(qū)一樣品制備區(qū)一擴(kuò)增區(qū)一擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆向流動(dòng)。實(shí)驗(yàn)室的氣流也應(yīng)從擴(kuò)增前區(qū)流向擴(kuò)增后區(qū)不得逆向流動(dòng)。各工作區(qū)頂部應(yīng)安裝紫外燈,紫外燈的波長(zhǎng)為254nm，每20itf一支40W的紫外燈。二、PC雙驗(yàn)室各區(qū)功能及主要設(shè)備1、試劑準(zhǔn)備區(qū)：主要進(jìn)行試劑的制備、分裝與主反應(yīng)混合液的制備。試劑與用于樣品制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其它區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的試劑。本區(qū)主要設(shè)備有天平、冰箱、離心機(jī)、加樣器、振蕩器等。對(duì)于

12、氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴(yán)格的要求。2、樣品制備區(qū)：主要進(jìn)行樣品的保存、核酸（RNADNA混取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管與測(cè)定DNA的合成。本區(qū)主要設(shè)備有冰箱、生物安全柜、離心機(jī)、加樣器、振蕩器、恒溫水浴等。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。3、擴(kuò)增區(qū)：主要進(jìn)行DNAT增。此外，已制備的DNA莫板（來自樣品制備區(qū)）的加入與主反應(yīng)混合液（來自試劑準(zhǔn)備區(qū)）制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)主要設(shè)備有：擴(kuò)增儀、冰箱、離心機(jī)、加樣器等。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。4、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定。本區(qū)主要設(shè)

13、備有酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、加樣器與水浴箱等。本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。三、PC雙驗(yàn)室通風(fēng)系統(tǒng)及壓力控制各區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實(shí)驗(yàn)工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護(hù)屏障，避免實(shí)驗(yàn)之間的相互干擾，防止氣溶膠擴(kuò)散對(duì)實(shí)驗(yàn)過程造成污染。PCR實(shí)驗(yàn)室并沒有嚴(yán)格的凈化要求，但就是為避免各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式，嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。四、PC雙驗(yàn)室裝飾實(shí)驗(yàn)室圍護(hù)結(jié)構(gòu)應(yīng)牢固、氣密性好；所有陰陽(yáng)角宜采用圓弧過渡；墻體內(nèi)壁光潔、不積塵、耐腐蝕、易清洗消毒；地面使用Pvoe材或環(huán)氧機(jī)w旨自流坪，材料

14、應(yīng)滿足無(wú)縫隙、無(wú)滲漏、光潔、耐腐蝕的要求。五、pc雙驗(yàn)室注意事項(xiàng)1、幾個(gè)區(qū)域的大小設(shè)置情況，試劑準(zhǔn)備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，空間可以相對(duì)小一些，樣品制備區(qū)要放置生物安全柜與低溫冰箱，空間應(yīng)大一些。2、試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品制備區(qū)設(shè)緊急洗眼器，以保證操作人員的安全。3、PCR實(shí)驗(yàn)室沒有嚴(yán)格的凈化要求，可以根據(jù)用戶的使用情況與資金的投入選擇。病理科病理診斷試劑及配套設(shè)備全系列的產(chǎn)品，涵蓋了液基細(xì)胞學(xué)、免疫組織化學(xué)與分子基因診斷。產(chǎn)品包括液基細(xì)胞學(xué)系列產(chǎn)品、熒光原位雜交技術(shù)、熒光定量PC叱術(shù)、一代測(cè)序技術(shù)、液相基因芯片技術(shù)等先進(jìn)技術(shù)相關(guān)的儀器、試劑與耗材。沉降式全自動(dòng)制片染色系統(tǒng)：根據(jù)人體不同類型細(xì)胞

15、其比重不同的特點(diǎn),尤其就是病變細(xì)胞比重大、沉降速度快，與特殊處理后的載玻片相互吸引，從而最大程度地捕捉病變細(xì)胞與具有診斷價(jià)值的成分，自動(dòng)濕染色，最終制成背景清晰、診斷線索明確的單層細(xì)胞薄片。全自動(dòng)沉降式制片染色系統(tǒng)每批次可以處理1-24個(gè)標(biāo)本，每天7小時(shí)可以處理300張制片，單片獨(dú)立滴染，染液一次性使用，避免樣本交叉污染。沉降式全自動(dòng)液基細(xì)胞學(xué)制片染色系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于宮頸癌篩查，同時(shí)診斷痰細(xì)胞、尿液細(xì)胞、漿膜腔細(xì)胞、針吸細(xì)胞與內(nèi)窺鏡細(xì)胞。熒光原位雜交（FISH）:FISH就是在細(xì)胞水平上檢測(cè)染色體數(shù)目與基因數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常的分子生物學(xué)技術(shù)，其基本原理就是用熒光標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)過變性退火，與樣本中

16、堿基互補(bǔ)序列特異性結(jié)合成DNA雙鏈，然后通過熒光顯微鏡檢測(cè)分析。由于FISH技術(shù)具有直觀、快速、敏感性高與方便靈活的特性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤遺傳學(xué)、基因相關(guān)疾病的分型與腫瘤個(gè)體化治療等領(lǐng)域。液相芯片技術(shù)就是以100種不同熒光編碼的微球作為探針的載體，生物分子間的反應(yīng)在懸浮液態(tài)體系中進(jìn)行的一類新的生物芯片技術(shù)。在這個(gè)靈活與開放的平臺(tái)中可進(jìn)行蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的檢測(cè)、液相芯片較傳統(tǒng)的固相芯片的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)準(zhǔn)確、信息質(zhì)量穩(wěn)定、可重復(fù)性好。液相芯片以其易于操作、高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高精密度以及寬的線性測(cè)定范圍的特點(diǎn)，逐漸進(jìn)入了臨床診斷領(lǐng)域。液相基因芯片：將預(yù)先人工合成的寡核甘酸探針共價(jià)連

17、接于微球表面構(gòu)成。液相基因芯片除具有一般固相基因芯片的功能如核甘酸測(cè)序、單核甘酸多態(tài)性分析、基因作圖等，還具有精確的同時(shí)定性、定量分析特征。液相蛋白芯片：臨床檢測(cè)包括:1抗原抗體定量定性檢測(cè)；2細(xì)胞因子檢測(cè)。測(cè)序技術(shù)第一代-Sanger鏈終止法一代測(cè)序技術(shù)就是20世紀(jì)70年代中期由FredSanger及其同事首先發(fā)明。其基本原理就是,聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠把長(zhǎng)度只差一個(gè)核甘酸的單鏈DN冊(cè)子區(qū)分開來。一代測(cè)序?qū)嶒?yàn)的起始材料就是均一的單鏈DNA分子。第一步就是短寡聚核甘酸在每個(gè)分子的相同位置上退火，然后該寡聚核甘酸就充當(dāng)引物來合成與模板互補(bǔ)的新的DNA鏈。用雙脫氧核昔酸作為鏈終止試劑（雙脫氧核甘酸

18、在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3-OH®團(tuán)，所以可被用作鏈終止試劑）通過聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子后再進(jìn)行分離的方法。測(cè)序引物與單鏈DNA莫板分子結(jié)合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反應(yīng)分四組進(jìn)行，每一組分別用四種ddNTP«脫氧核甘酸)中的一種來進(jìn)行終止，再用PAG吩析四組樣品。從得到的PAGE交上可以讀出我們需要的序列。第二代-大規(guī)模平行測(cè)序大規(guī)模平行測(cè)序平臺(tái)(massivelyparallelDNAsequencingplatform)的出現(xiàn)不僅令DNA測(cè)序費(fèi)用降到了以前的百分之一，還讓基因組測(cè)序這項(xiàng)以前專屬于大型測(cè)序中心的“特權(quán)”能夠被眾

19、多研究人員分享。新一代DNAM序技術(shù)有助于人們以更低廉的價(jià)格，更全面、更深入地分析基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)之間交互作用組的各項(xiàng)數(shù)據(jù)。市面上出現(xiàn)了很多新一代測(cè)序儀產(chǎn)品，例如美國(guó)RocheAppliedScience公司的454基因組測(cè)序儀、美國(guó)Illumina公司與英國(guó)Solexatechnology公司合作開發(fā)的Illumina測(cè)序儀、美國(guó)AppliedBiosystems公司的SOLiD測(cè)序儀。Illumina/SolexaGenomeAnalyzer測(cè)序的基本原理就是邊合成邊測(cè)序。在Sanger等測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP,當(dāng)DNAm合酶合成互補(bǔ)鏈

20、時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過特定的計(jì)算機(jī)軟件處理從而獲得待測(cè)DNA勺序列信息。以Illumina測(cè)序儀說明二代測(cè)序的一般流程,(1)文庫(kù)制備，將DN刖霧化或超聲波隨機(jī)片段化成幾百堿基或更短的小片段。用聚合酶與外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個(gè)核甘酸黏性末端。然后將Illumina測(cè)序接頭與片段連接。(2)簇的創(chuàng)建，將模板分子加入芯片用于產(chǎn)生克隆簇與測(cè)序循環(huán)。芯片有8個(gè)縱向泳道的硅基片。每個(gè)泳道內(nèi)芯片表面有無(wú)數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA片段變性成單鏈后與測(cè)序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用。

21、通過不斷循環(huán)獲得上百萬(wàn)條成簇分布的雙鏈待測(cè)片段。(3)測(cè)序，分三步：DNA聚合酶結(jié)合熒光可逆終止子，熒光標(biāo)記簇成像，在下一個(gè)循環(huán)開始前將結(jié)合的核甘酸剪切并分解。(4)數(shù)據(jù)分析。-第三代-高通量、單分子測(cè)序被稱為第三代的測(cè)序的He-licos單分子測(cè)序儀，PacificBioscience的SMR敢術(shù)與OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)正向著高通量、低成本、長(zhǎng)讀取長(zhǎng)度的方向發(fā)展。不同于第二代測(cè)序依賴于DNA莫板與固體表面相結(jié)合然后邊合成邊測(cè)序，第三代分子測(cè)序，不需要進(jìn)行PCFT增。(1)HelicoBioScience單分子測(cè)序技術(shù)。該測(cè)序就是

22、基于邊合成邊測(cè)序的思想，將待測(cè)序列隨機(jī)打斷成小分子片段并用末端轉(zhuǎn)移酶在3'末端加上poly(A),以及在poly(A)的末端進(jìn)行熒光標(biāo)記與阻斷，把這些小片段與帶有poly(T)的平板雜交成像來獲得已經(jīng)雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測(cè)序的位點(diǎn)加入聚合酶與被Cy3熒光標(biāo)記脫氧核甘酸進(jìn)行DNA合成，每次只加入一種脫氧核甘酸，然后將未參與合成的dNTP與DNAM合酶洗脫，直接對(duì)Cy3成像，觀測(cè)模板位點(diǎn)上就是否有熒光信號(hào)，然后化學(xué)裂解核甘酸上的燃料并釋放加入下一種脫氧核甘酸與聚合酶的混合物，進(jìn)行下一輪反應(yīng)。（2）PacificBioscienceSMRTT技術(shù)。該測(cè)序也就是基于邊合成邊測(cè)序的原理，這項(xiàng)技于使用了Zero-ModeWaveguide（ZMW）（零級(jí)波導(dǎo)）。測(cè)序的過程：被熒光標(biāo)記磷酸集團(tuán)的核甘酸在聚合酶活性位點(diǎn)上與模板鏈結(jié)合（每種脫氧核甘酸被不用顏色的染料標(biāo)記）,被激發(fā)出熒光，在熒光脈沖結(jié)束后,被標(biāo)記的磷酸集團(tuán)被切割并釋放，聚合酶轉(zhuǎn)移到下一個(gè)位置，下一個(gè)脫氧核甘酸連接到位點(diǎn)上開始釋放熒光脈沖，進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)。（3）OxfordNanoporeTechnologies的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)。大多數(shù)納米孔測(cè)序技術(shù)的基本原理就是當(dāng)DNA分子或者它的組成堿基從一個(gè)孔洞經(jīng)過時(shí)而檢測(cè)到被影響的電流或光信號(hào)。OxfordNanopore測(cè)序技術(shù)就是