脊髓損傷基因治療的研究進展-- 神經(jīng)生物學

1、脊髓損傷基因治療的研究進展- 神經(jīng)生物學    1990年美國首次成功地進行腺苷脫胺酸（ adenosine deam inase， aDA）缺乏的基因治療（ gene therapy）以來，基因治療已成為當前生物醫(yī)學中進展最快的領域之一1?；蛑委熢诩顾钃p傷（ spinal cordIn-jury， sCI）后軸突再生中亦可望成為有效的手段之一25。利用外源基因在靶細胞（包括神經(jīng)元）中的表達，以改變神經(jīng)元某些內(nèi)在特性，從而進一步探索 sCI后神經(jīng)元的存活能力，再生特性和功能恢復的分子機理，最終為 sCI的治療探討新途徑是目前治療 sCI的研究方向。它有

2、助于把 sCI治療提到一個新的水平。值得我們進一步研究。一、 sCI基因治療有關分子生物學基礎基因轉(zhuǎn)移（ gene transrer）是實現(xiàn)基因治療的關鍵技術6。因此，基因治療的首要步驟是轉(zhuǎn)導基因的分子構(gòu)建。一般轉(zhuǎn)導基因由目的基因 cDNA，啟動子增強子和載體三部分組成。目的基因重組時除本身特有的（ cD-NA）序列外，通常還需進行必要的修飾，如轉(zhuǎn)錄起始修飾，翻譯起始，內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號等的修飾。用于重組的啟動子增強子，一般有三種：強組成型（ strongconstita-tive），管家型（ housekeeping），及組織持異型啟動子（ tissuesepcific），其中最常用為第

3、一型7。理想的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移載體要求：轉(zhuǎn)移具有細胞靶向性，導入基因的表達可調(diào)控，而且轉(zhuǎn)移的方法簡便易行。用于 sCI的基因轉(zhuǎn)移載體主要是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（ retroviralvector），即乳腺病毒、莫羅尼小鼠白血病病毒和勞斯肉瘤病毒等。構(gòu)建轉(zhuǎn)錄病毒載體的基本原理是：病毒的長末端重復序列（ longterrminalrepeat， lTR）可以對插入的外源基因進行有效轉(zhuǎn)錄，這樣先在體外構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒 dNA載體，即酶切去除基因組中的反式作用區(qū)域（ gag， polenv基因區(qū)域），產(chǎn)生缺陷型的反轉(zhuǎn)錄病毒，這種病毒只具有控制感染和整合的序列（即順式作用區(qū)域）。缺陷型病毒載體必須依賴包裝細胞

4、提供的蛋白質(zhì)才能完成包裝，產(chǎn)生帶有外源基因的偽病毒。它能感染受體細胞，載體 dNA將依靠其 lTR整合入受體細胞染色體基因組，這樣外源基因被帶入宿主細胞并得以表達2、3、6、7。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染率高，最常用于體外間接基因治療，其缺點是要求靶細胞必須有增殖和分裂特性8。此外， cao（1995）9等研究用陽離子脂質(zhì)體直接注入 cNS作基因轉(zhuǎn)移獲得成功。但因陽離子脂質(zhì)體對 cNS有毒性，故目前致力于發(fā)展非病毒技術，一種陽離子多聚體一聚乙烯亞胺（ polyetnyl enimine）業(yè)已用于基因轉(zhuǎn)移10。另有 selle6（1993）等報道的復制缺陷腺病毒也是一種適用于神經(jīng)系統(tǒng)的理想載體。在 sC

5、I治療中，由于受體細胞要植入脊髓內(nèi)，因此所用受體細胞應當符合一定的標準4、6：容易獲取和繁殖；移植后能長期存活且能繼續(xù)分裂和具有活力。無免疫源性及形成腫瘤的危險。目前已用于 sCI試驗有雪旺氏細胞（ schwann cell， sC）和成纖維細胞2、3、11。此外，肌母細胞也是具有應用前景的較好受體細胞，研究表明肌母細胞轉(zhuǎn)移至 cNS至少可活6個月，且無腫瘤源性12?；蛑委煹膶嵤?，有賴于將目的基因準確、高效地轉(zhuǎn)入靶細胞，并使之安全，高效和可控地表達?；蛑委熤谢蜣D(zhuǎn)移的策略主要有兩種，即活體外法（ exvivo approach）和在體法（ invivo approach）?；铙w外法就是在體

6、外先對適當細胞進行遺傳修飾，使其表達和分泌特定的重組蛋白，然后將修飾細胞移植入活體神經(jīng)組織，通過神經(jīng)遞質(zhì)替代或神經(jīng)營養(yǎng)因子（ neurotrophic factor， nTF）和其它治療因子的引入恢復正常的神經(jīng)功能。這種方法尤其適于因缺乏 nTF或神經(jīng)遞質(zhì)前體分子等可擴散物質(zhì)所致的 cNS疾病。如帕金森氏?。?parkinson s diesease， pD）及 cNS損傷。在體法是利用適當?shù)闹亟M病毒或化學基因轉(zhuǎn)移載體將目的基因及有治療作用的重組蛋白直接轉(zhuǎn)移，效率較低，故較少采用。此外，活體外法可采用自體的工程細胞移植，在體外可對高表達細胞克隆進行篩選，有效的控制移植細胞的數(shù)量和質(zhì)量，應用立體

7、定位和成像技術可以將工程細胞十分準確地移植到 cNS特定的區(qū)域內(nèi)，以保證在局部產(chǎn)生高濃度的治療因子。二、基因治療 sCI的現(xiàn)狀和展望基因治療 sCI尚處于實驗探索階段。目前，主要是采用 nTF基因修飾雪旺氏細胞（ sC）或成纖維細胞后再將其植入鼠的脊髓損傷區(qū)，觀察其軸突再生的情況2、3、11。 tuszyski（1994）11將 nGF基因?qū)肱囵B(yǎng)的 sC內(nèi)，再將 sC移植到損傷的脊髓，發(fā)現(xiàn) sC在體內(nèi)能穩(wěn)定地表達 nGF并促進軸突的再生。同年 tuszynski等2利用來源于莫洛氏鼠白血病的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將人的 nGF基因?qū)胧蟪衫w維細胞中，再將成纖維細胞移植到半橫貫損傷的鼠脊髓中（ t7

8、平面）。1年后成纖維細胞仍能表達 nGF，電鏡及免疫組化（ cGRP）檢查，發(fā)現(xiàn)有大量的脊髓軸突再生（感覺纖維）。1996年， tuszynski等3采用同樣方法，又將 nGF基因?qū)氤衫w維細胞中，并將其移植到半橫斷損傷的鼠脊髓中（ t7平面），14月后，通過 rT pCR技術鑒定成纖維細胞仍表達 nGF。電鏡、免疫組化（ gFAP、 cHAT、 tH、5 hT， cGRP）檢查發(fā)現(xiàn)有大量的（感覺和運動）軸突再生。作者在國際上首次構(gòu)造 po5 flanking介導的21.5KD髓鞘堿性蛋白微基因（暫命名為 pSVPoMcat）的基礎上，通過陽離子脂質(zhì)體導入 sC中，然后再將基因修飾的 sC移植

9、入成鼠半橫斷損傷脊髓，觀察其對 sCI的再生修復作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) pSVPoMcat微基因修飾 sC對 sCI后細胞凋亡有抑制作用13。當然利用基因轉(zhuǎn)移技術治療 sCI，目前還存在一些尚待解決的問題，第一是免疫排斥反應6，即宿主移植細胞的免疫排斥。因為盡管 cNS的免疫應答能力微弱，但對抗原較強的或種屬相關較遠的受體細胞，仍具有免疫排斥反應，因此，在細胞移植時應給予免疫抑制劑，最好使用自體工程細胞移植。亦可采用免疫隔離（ immuno isolation）法即使用微囊包膜（ mincroencapsulat）的工程細胞14。第二是移植細胞的長時間存活問題。因為在細胞移植部位，宿主內(nèi)源性細胞系統(tǒng)對

10、局部組織損傷的病理生理反應過程可能使部分移植細胞死亡。如果移植入外來組織細胞的體積較大，還可能對宿主組織及細胞產(chǎn)生機械性擠壓，從而影響其結(jié)構(gòu)與功能的完整性，因此，在移植方式上應該使用微移植（ microtransplantation， mit）技術。 nikknak（1994）15曾采用外徑僅5070 m微管的點移植量為0.2 l，而細胞密度很大（每微升達125.0個），達到以盡可能小的量，移植盡可能多的細胞則對宿主造成的創(chuàng)傷亦小。第三是遺傳修飾細胞移植后轉(zhuǎn)移基因的表達可能會隨著時間的延長而逐漸下降，以致失去治療作用。故而利用內(nèi)源性或外源性調(diào)節(jié)因子主動調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移基因的表達極為重要15。綜上所述，在 sCI的再生修復治療中，盡管基因轉(zhuǎn)移所取得的結(jié)果均來自實驗報告，但卻具有十分誘人的臨床應用前景。隨著分子生物學的發(fā)展，我們可以把有絲分裂促進劑的基因插入在成熟神經(jīng)元的基因組、成熟神經(jīng)元便有可能一改不能分裂的狀態(tài)而變?yōu)槟軌蜃孕蟹敝巢⒃偕扪a損傷所造成的缺