神經(jīng)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的活體示蹤研究

1、神經(jīng)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的活體示蹤研究                   作者：張立峰，茅祖斌，蔣贊利     【摘要】  目的：探索利用MR技術(shù)活體追蹤干細(xì)胞的可行性及神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)移植對(duì)大鼠脊髓損傷(SCI)后功能恢復(fù)的影響。方法：66只SD大鼠隨機(jī)分為假損傷組（A組）、SCI對(duì)照組（B組）和細(xì)胞移植治療組（C組）3組，應(yīng)用已包被多聚左旋賴(lài)氨酸(P

2、LL)的SPIO標(biāo)記NSCs,對(duì)標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，分別在細(xì)胞移植后第1、2、3、4、5周對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行BBB評(píng)分，細(xì)胞移植后1、3、5周行MRI檢查。結(jié)果：(1)普魯士藍(lán)染色證實(shí)該方法標(biāo)記NSCs的有效率為100%。（2）細(xì)胞移植后15周,B、C組動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能均有不同程度恢復(fù)，但B組恢復(fù)較慢，BBB評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。（3）1.5 T MRI 檢查 見(jiàn)移植處在T2WI序列呈低信號(hào)改變,第3周時(shí)低信號(hào)向損傷區(qū)擴(kuò)大，第5周時(shí)可在損傷區(qū)見(jiàn)到低信號(hào)改變。結(jié)論：MR技術(shù)可以活體追蹤干細(xì)胞，NSCs移植治療SCI有利于大鼠后肢功能的恢復(fù)。 【關(guān)鍵詞】  脊髓損傷； 神經(jīng)干

3、細(xì)胞移植； 磁共振成像； 大鼠    脊髓損傷(spinal cord injury,SCI) 后自身的修復(fù)能力非常有限,死亡的神經(jīng)元不能由自身產(chǎn)生的神經(jīng)元或鄰近的神經(jīng)元來(lái)代替。近年來(lái)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)的研究改變了這一觀點(diǎn)。NSCs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有增殖和分化能力的一類(lèi)細(xì)胞,是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期特定的細(xì)胞群體,它具備干細(xì)胞共有的特點(diǎn)，即能長(zhǎng)久地保持增殖和分化能力1。隨著分子影像學(xué)的發(fā)展,干細(xì)胞移植后的體內(nèi)活體追蹤是近期研究的一個(gè)突破點(diǎn)2。本研究利用超順磁性氧化鐵(super paramagnetic iron oxide,S

4、PIO) 標(biāo)記NSCs,對(duì)SCI大鼠進(jìn)行細(xì)胞移植后的活體追蹤,探索利用MR技術(shù)活體追蹤干細(xì)胞的可行性以及NSCs移植對(duì)SCI大鼠后肢功能恢復(fù)的影響。    1  材料與方法    1.1  胎鼠來(lái)源NSCs的制備、培養(yǎng)與鑒定3    取胚齡14 d SD大鼠胚胎的大腦腦室下區(qū)組織并吹打成單個(gè)細(xì)胞,以1×105ml1種瓶,用DMEM/F12(11)無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)含bFGF 20 ng·ml1、EGF 20 ng·ml1、B27 20 ng·ml1培

5、養(yǎng)。每67 d換液、傳代1次。    對(duì)第2代細(xì)胞作免疫組化鑒定：取無(wú)血清培養(yǎng)基貼壁分化培養(yǎng)24 h的蓋玻片1張,4%多聚甲醛固定30 min。0.25% Triton- 100破膜12 min,然后用5%脫脂奶粉封閉特異性抗原,室溫孵育30 min,吸干殘液滴加1500小鼠抗大鼠nestin IgG1(一抗),4 孵育過(guò)夜。第2天滴加FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG1二抗,室溫孵育1 h,然后50%緩沖甘油封氣,熒光顯微鏡下觀察并攝像。    1.2  NSCs的標(biāo)記和染色    細(xì)胞傳至第3代,

6、取適量已包被多聚左旋賴(lài)氨酸(poly-L-lysine,PLL)的SPIO加入10 ml DMEM/F12培養(yǎng)基中,37 振蕩60 min,使SPIO終濃度為25 g·ml1,將消化的細(xì)胞沉淀加入含SPIO的培養(yǎng)基中孵育12 h完成標(biāo)記。    NSCs標(biāo)記后普魯士藍(lán)染色:標(biāo)記后的NSCs換成含10血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置6孔板中培養(yǎng)7 d，去掉培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍，4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗滌3遍,含2亞鐵氰化鉀的6鹽酸溶液常溫孵育30 min,顯微鏡下觀察。    1.3  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與

7、SCI模型的制作    66只成年雄性SD大鼠,體重250300 g,隨機(jī)分為假損傷組(A組，6只)、SCI對(duì)照組(B組，30只)及細(xì)胞移植治療組(C組，30只)3組。B、C兩組參照改良的Allen重物打擊法4制作大鼠脊髓背側(cè)損傷模型：實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食8 h，用戊巴比妥鈉(30 g·L1)按40 mg·kg1腹腔注射麻醉,背部脫毛后俯臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上,常規(guī)消毒,腰背部正中切口,逐層分開(kāi)顯露T8T10椎板,行T9全椎板切除,顯露硬脊膜,鉗夾固定T8及T10棘突,用10.0    g的不銹鋼棒(直徑為2.5 mm)

8、沿帶有刻度的玻璃導(dǎo)管從25 mm高處垂直下落,打擊在由塑料材料制成的底部呈凹面、直徑為3 mm的撞桿上,后者將打擊力傳遞給脊髓,造成大鼠脊髓不完全損傷,致傷后迅速移開(kāi)打擊物,逐層縫合。模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn):打擊后損傷處脊髓出血、水腫，大鼠出現(xiàn)擺尾反射,雙下肢及軀體回縮樣撲動(dòng),麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。A組僅行T9全椎板切除術(shù)作對(duì)照。術(shù)后即刻腹腔注射5%葡萄糖鹽水2 ml,以補(bǔ)充血容量。予青霉素鈉鹽5萬(wàn)U背外側(cè)肌群肌肉注射預(yù)防感染,每天1次,持續(xù)3 d。注意保溫,分籠飼養(yǎng),自由取食,每天8：00及20：00行膀胱按摩協(xié)助排尿,直至建立反射性排尿。    1.4&#

9、160; 細(xì)胞移植    將第3代懸浮培養(yǎng)的NSCs懸液用臺(tái)式離心機(jī)離心5 min(1 000 r·min1),將細(xì)胞團(tuán)以少量培養(yǎng)液吹勻,細(xì)胞計(jì)數(shù)為105l1。C組動(dòng)物SCI后9 d于損傷節(jié)段下0.5 cm處用5 l微量注射器以與脊髓水平面呈30°角刺入脊髓組織中,注入2 l NSCs懸液,逐層縫合切口。    1.5  運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分    BBB評(píng)分5為總分21分的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分,考察大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)、軀干的位置和穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性、爪的置放、足趾間隙及尾的位置,表示SCI后

10、大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的過(guò)程。BBB評(píng)分簡(jiǎn)單直觀,易于掌握,與脊髓功能恢復(fù)有極好的一致性。分別在動(dòng)物移植前第7天和移植后1、2、3、4、5周進(jìn)行盲法BBB評(píng)分,由兩名熟悉BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的非實(shí)驗(yàn)人員觀察。將動(dòng)物置于直徑1 m的平面光滑場(chǎng)地自由活動(dòng)5 min,記錄動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)情況。    1.6  MR檢查    于術(shù)后第1、3、5周分別行MR檢查，掃描序列為T(mén)2WI。麻醉方法同前。    1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    所有數(shù)據(jù)以x-±s表示,采用SPS

11、S 12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,組間比較采用t 檢驗(yàn),P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)    果    2.1  NSCs的培養(yǎng)和鑒定情況    圖1  培養(yǎng)7d時(shí)NSCs于無(wú)血清培養(yǎng)基中    形成的神經(jīng)球  ×200    2.2  普魯士藍(lán)染色結(jié)果    顯示100的NSCs胞質(zhì)內(nèi)有細(xì)小的藍(lán)色氧化鐵顆粒（圖3，見(jiàn)封二）。    2.3  運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分