醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)免疫標(biāo)記技術(shù)

1、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)免疫標(biāo)記技術(shù)第一頁(yè)，共17頁(yè)。免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù) 概念概念：用：用熒光素、酶、同位素?zé)晒馑?、酶、同位素等等?biāo)記標(biāo)記抗體抗體或或抗原抗原用以用以測(cè)定測(cè)定相應(yīng)抗原相應(yīng)抗原或或抗體抗體的技術(shù)稱為的技術(shù)稱為免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)。 特點(diǎn)特點(diǎn)：敏感、特異、快速，敏感、特異、快速， 定性、定量、定位定性、定量、定位。第二頁(yè)，共17頁(yè)。免疫印跡免疫印跡技術(shù)技術(shù)(western blot)(western blot)斑點(diǎn)金技術(shù)斑點(diǎn)金技術(shù)放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫酶免疫技術(shù)技術(shù)（ELISA）免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)常用免疫標(biāo)記技術(shù)：常用免疫標(biāo)記技術(shù)：第三頁(yè)，共17頁(yè)。直接直接免疫熒光免

2、疫熒光熒光素?zé)晒馑刂苯訕?biāo)記直接標(biāo)記抗體抗體, 檢測(cè)檢測(cè)抗原抗原。AgFluorochromeLabeled AbTissue Section常用的常用的熒光素?zé)晒馑刂饕校褐饕校寒惲蚯杷釤晒馑禺惲蚯杷釤晒馑?FITC)：黃綠色藻紅蛋白藻紅蛋白(PE)：桔紅色羅丹明（羅丹明（RB200)：紅色免疫熒光免疫熒光技術(shù)：技術(shù)：直接直接免疫熒光，免疫熒光，間接間接免疫熒光免疫熒光第四頁(yè)，共17頁(yè)。間接免疫間接免疫熒光熒光,一抗一抗與標(biāo)本中與標(biāo)本中抗原抗原結(jié)合，再用結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記熒光素標(biāo)記的的二抗二抗進(jìn)行檢進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)。AgFluorochromeLabeled Anti-IgTissue Sec

3、tionUnlabeledAb高效、更靈敏高效、更靈敏2. 經(jīng)濟(jì)、通用性強(qiáng)經(jīng)濟(jì)、通用性強(qiáng)一抗一抗：二抗二抗：以兔源一抗為例 兔兔源源一抗一抗 木瓜/胃蛋白酶 抗體抗體Fc段段（為抗原抗原） 人蛋白：1，2，3 兔/鼠： 抗體抗體1，2，3 羊羊（驢）驢）（二抗）（二抗）免疫動(dòng)物免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體產(chǎn)生抗體多抗多抗/單抗單抗兔兔源源/鼠鼠源源抗人抗人抗原抗原種特異性：種特異性：一個(gè)一個(gè)羊源二抗羊源二抗可識(shí)別可識(shí)別所有所有兔源一抗兔源一抗，即，即一一個(gè)個(gè)二抗二抗分子分子可識(shí)別可識(shí)別一種動(dòng)物一種動(dòng)物源的所有一抗。源的所有一抗。 羊抗兔/鼠；驢抗兔/鼠免疫免疫羊羊產(chǎn)生抗體產(chǎn)生抗體恒定區(qū)可變區(qū)第五頁(yè)，共17

4、頁(yè)。 人工制備抗體的類型 多克隆抗體多克隆抗體抗原免疫動(dòng)物后得到的動(dòng)物血清（抗血清抗血清），含有針對(duì)不同不同抗原決定簇抗原決定簇的多種抗體分子多種抗體分子。Ag6抗原決定簇抗原決定簇第六頁(yè)，共17頁(yè)。單克隆抗體單克隆抗體（mAb) Khler 和 Milstein 1975年建立的技術(shù)，通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得的針對(duì)單一抗原決定簇的高特異性抗體高特異性抗體。7第七頁(yè)，共17頁(yè)。8抗原加工提呈，抗原肽抗原加工提呈，抗原肽第八頁(yè)，共17頁(yè)。免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)抗C3二抗二抗補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)前所述第九頁(yè)，共17頁(yè)。定位定位：對(duì)對(duì)某蛋白質(zhì)某蛋白質(zhì)在細(xì)胞的在細(xì)胞的定位定位、定量定量（細(xì)胞（細(xì)胞質(zhì)

5、質(zhì)中表達(dá)）中表達(dá)）熒光染料第十頁(yè)，共17頁(yè)。共定位共定位：對(duì)對(duì)某某二個(gè)二個(gè)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的在細(xì)胞內(nèi)的定位定位、定量定量第十一頁(yè)，共17頁(yè)。免疫熒光可免疫熒光可“定位定位” 、“定性定性” ，借助，借助圖像軟件圖像軟件可進(jìn)行可進(jìn)行模模擬擬“定量定量”分析分析；第十二頁(yè)，共17頁(yè)。酶標(biāo)記技術(shù)免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)：“定位定位” “定性定性”、“模擬定量模擬定量”；免疫印跡（免疫印跡（Western blotting）：“定性定性”、“模擬定量模擬定量”；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） ：“定量定量”辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶堿性磷酸酶鄰苯二胺(OPD)四甲基聯(lián)苯胺(TMB

6、)+ H2O2有色物質(zhì)第十三頁(yè)，共17頁(yè)。直接法direct ELISA檢測(cè)抗原抗原： 酶酶直接標(biāo)記直接標(biāo)記一抗一抗辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶(HRP)TMB/OPD + H2O2有色物質(zhì)抗原抗原一抗一抗鄰苯二胺(OPD)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA)第十四頁(yè)，共17頁(yè)。雙雙抗體夾心法抗體夾心法Sandwich ELISA檢測(cè)抗原： 有兩個(gè)一抗。固相載體：固相載體：聚苯乙烯聚苯乙烯微量反應(yīng)板微量反應(yīng)板辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶(HRP)第十五頁(yè)，共17頁(yè)。間接法indirect ELISA病人血清病

7、人血清固相載體：固相載體：聚苯乙烯聚苯乙烯微量反應(yīng)板微量反應(yīng)板（工業(yè)化生產(chǎn)）已知抗原：乙肝表面表面抗原(HBsAg)，二抗二抗： 抗人IgM 或 IgG Fc段抗體如：檢測(cè)乙肝表面抗體乙肝表面抗體(HBsAb)加病人血清病人血清辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶(HRP)包被包被洗滌洗滌洗滌洗滌(可省可省)洗滌洗滌(不可省不可省)有色物質(zhì)有色物質(zhì)二抗過(guò)量二抗過(guò)量時(shí)，加入時(shí)，加入病人血清病人血清后，要不后，要不要洗滌？要洗滌？鄰苯二胺(OPD)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)TMB/OPD + H2O2預(yù)包被板預(yù)包被板第十六頁(yè)，共17頁(yè)。空白空白 陰性陰性 陽(yáng)性陽(yáng)性 待測(cè)待測(cè)1 待測(cè)待測(cè)2間接ELISA法檢測(cè)血

8、清抗-HBsAb 1.加加血清血清及及對(duì)照對(duì)照(一抗一抗)第第1孔，孔，空白空白對(duì)照，加對(duì)照，加洗滌液洗滌液1滴滴第第2孔，孔，陰性陰性對(duì)照，加對(duì)照，加陰性對(duì)照血清陰性對(duì)照血清1滴滴 第第3孔，孔，陽(yáng)性陽(yáng)性對(duì)照，加對(duì)照，加陽(yáng)性對(duì)照血清陽(yáng)性對(duì)照血清1滴滴 第第4孔，孔，待檢待檢血清血清1，加，加待檢血清待檢血清1滴滴 第第5孔，孔，待檢待檢血清血清2，加，加待檢血清待檢血清1滴滴 (不洗，因?yàn)槎惯^(guò)量不洗，因?yàn)槎惯^(guò)量)2.加加酶結(jié)合物酶結(jié)合物 (酶結(jié)合酶結(jié)合二抗二抗)加入加入酶結(jié)合物酶結(jié)合物1滴滴（空白孔不加），混勻，（空白孔不加），混勻，37 C ，20-30min3. 洗板洗板:棄去孔內(nèi)液體，注滿棄去孔內(nèi)液體，注滿洗滌液洗滌液，靜置，靜置5sec甩干，重復(fù)甩干，重復(fù)3次次。4.