干生化試劑原理及應(yīng)用-楊惠聰

1、 所謂“干化學(xué)”是與傳統(tǒng)的“濕化學(xué)”（即溶液化學(xué)）相對比較而言的。它是以被檢測樣品中的液體作為反應(yīng)媒介，待測物直接與固化于載體上的干粉試劑反應(yīng)的一種方式。它與傳統(tǒng)濕化學(xué)的最大區(qū)別就在于參與化學(xué)反應(yīng)的媒介不同。隨著生物化學(xué)中酶的分離、提純、存儲等技術(shù)的發(fā)展，傳感器、光度計(jì)和電極技術(shù)的進(jìn)步，以及計(jì)算機(jī)應(yīng)用的普及，干化學(xué)技術(shù)在近20年里得到了長足的進(jìn)步。 操作簡單 單個標(biāo)本檢測速度快適用于急診 試劑穩(wěn)定、有效期長 結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定 無需供水系統(tǒng) Tablet 藥片劑 Strip試紙條 Multi-Film多層薄膜 用于生化分析的試劑載體最簡單的是二層結(jié)構(gòu)，在支持層塑料基片上有一試劑層纖維素片，在纖維素

2、片中預(yù)固化了全部試劑。常見的是尿生化分析試劑條尿生化分析試劑條： 尿液中的待測成分與預(yù)固相在纖維素片上的試劑直接反應(yīng)，通過反射光度計(jì)測定其顏色的改變，從而計(jì)算待測成份的濃度。這種方法只能對待測成分進(jìn)行定性或半定量測定，這樣就限制了它在其它須準(zhǔn)確定量的標(biāo)本的應(yīng)用。 在試劑層上加一多孔膠膜過濾層，其作用是將樣品中的雜質(zhì)過濾掉，并起保護(hù)試劑層作用。常見的是微量法測定葡萄糖的試劑條。 三層試劑載體的測定光路是通過透明的塑料基片，而不經(jīng)過最上面的過濾層，這樣消除了樣品中干擾成分的影響，保證了待測成分測定的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。 CM/RTSlideMeasure chemistry concentration

3、 by color development通過顏色的變化來測定化學(xué)物濃度通過顏色的變化來測定化學(xué)物濃度Colorimetric / Rate Slide比色比色 / 速率法干片速率法干片 比色/速率法干片主要用于常規(guī)生化項(xiàng)目的測定，干片模式圖顯示了一個臨床化學(xué)比色/速率法干片模式簡圖。在這個試劑片中，多種反應(yīng)試劑被固化在一張透明聚酯膜上，上面覆以多孔的擴(kuò)散層，然后被夾在一個塑料結(jié)構(gòu)中。如圖所示，共有4個功能層：擴(kuò)散層（分布層）、試劑層、指示劑層和支持層。每個試劑片的層數(shù)視所采用的分析方法而定，干片的大小大致與一枚郵票相同，顯色劑層呈現(xiàn)的顏色深淺與待測物濃度成正比。Components of O

4、ne Slide干片之基本組成干片之基本組成Spreading Layer分布擴(kuò)散層分布擴(kuò)散層 它由TiO2,BaSO4和醋酸纖維素構(gòu)成的100-300微米的多空聚合物，聚合物的孔徑在1.530微米之間。分布層的孔徑和厚度將取決于特定分析的需要。分布層的中空體積占40%90%，這種毛細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能使樣品溶液快速、均勻地分布到下層。當(dāng)一滴樣品約10微升加在試劑片上后，毛細(xì)作用將樣品迅速吸入多空擴(kuò)散層，但樣品在一瞬間被下面的凝膠層所排斥，因?yàn)槟z層在接受血清組份之前，必須先生成水合物。Uniformly distributes the sample均勻分布標(biāo)本Filters out large mo

5、lecules過濾大分子May contain reagents to break up molecules: by physical or by chemical可包含打斷大分子的試劑：物理性和化學(xué)性A background for reflective purpose提供反射測定的背景 擴(kuò)散層不僅可阻留細(xì)胞，結(jié)晶和其他小顆粒，它也可 以根據(jù)需要讓大分子，如蛋白質(zhì)等滯留。當(dāng)待檢樣品通過擴(kuò)散層后，可以消除溶液中影響檢測反應(yīng)干擾物質(zhì)。擴(kuò)散層中的TiO2和 BaSO4.一方面可用來掩蓋待檢樣品中的有色物質(zhì)，使反射光度計(jì)的測定結(jié)果不受影響，同時(shí)這些反光化合物也給干片底層的顯色層提供反射背景。在一些特

6、定試劑片中，擴(kuò)散層中還含有選擇性阻留某種成份或啟動某種反應(yīng)的物質(zhì)，以提高分析的特異性。 試劑層：在化學(xué)試劑層中，根據(jù)實(shí)際測定的需要，可由數(shù)層至數(shù)十個功能試劑層組成。反應(yīng)區(qū)的功能是將待測物通過物理、化學(xué)或生物酶學(xué)等反應(yīng)轉(zhuǎn)化為可與顯色劑結(jié)合的化合物。試劑層中按照反應(yīng)的順序涂布了不同的化學(xué)試劑，使反應(yīng)按照預(yù)先的設(shè)定依次進(jìn)行。針對不同檢測項(xiàng)目的個性化設(shè)計(jì)為化學(xué)反應(yīng)提供了最理想的物理和化學(xué)反應(yīng)環(huán)境這就是為什么干化學(xué)技術(shù)能夠確保更準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。尿酸干片是使用清除劑層的一個示例。清除劑層含有抗壞血酸氧化酶，用于將抗壞血酸（維生素 C）（一種內(nèi)源性干擾物）轉(zhuǎn)化，對試劑層中所發(fā)生反應(yīng)不產(chǎn)生干擾。 指示劑層：反

7、應(yīng)底物進(jìn)入指示劑層，在這里發(fā)生顯色反應(yīng)。此層包含染料或相似的指示劑，使反應(yīng)產(chǎn)物到達(dá)指示劑層后生成了有色化合物，其顏色變化與分析物濃度成比例，被反射光檢測。 支持層：此層是透明塑料制成，起到支持其它層的作用，且允許光線百分之百透射，以便對有色復(fù)合物進(jìn)行測量。 DetectorDetectorBUN Reaction ResultLow Conc. 低濃度High Conc.高濃度Salt BridgeS2S1S3S4aIarVMembraneM+ ClAgCl AgMembraneM+ ClAgClAgaIarSample = S1reference = S3S2S4Paper in plast

8、ic = salt bridgeVOne Dry ISE SlideISE Cell 離子（鈉，鉀，氯）檢測是干化學(xué)檢測項(xiàng)目中的傳統(tǒng)優(yōu)勢項(xiàng)目，采用離子法干片。其設(shè)計(jì)采用直接電勢法，樣本無需稀釋。離子干片是由紙橋?qū)蓚€離子選擇性電極相連，通過電壓表來測量患者樣本和已知參比液之間的電勢差，從而計(jì)算出鈉，鉀，氯的離子濃度。 讀數(shù)時(shí)采用了多點(diǎn)速率法來檢測分析物濃度。分析物與酶標(biāo)抗原競爭有限數(shù)量的抗體結(jié)合位點(diǎn)。加入含底物的免疫洗液，一方面洗去未結(jié)合物質(zhì)，另一方面抗原抗體復(fù)合物與無色底物反應(yīng)顯色以670nm波長加入免疫洗液并孵育2.5min后讀數(shù)；通過速率的變化采計(jì)算分析物濃度，發(fā)射光密度與分析物濃度成反

9、比。 讀數(shù)時(shí)采用定點(diǎn)速率法。待測物與固相抗體、酶標(biāo)抗體形成夾心“三明治”。加入含底物的免疫洗液后洗去讀數(shù)視窗區(qū)域未結(jié)合物質(zhì)，抗原抗體結(jié)合物與底物反應(yīng)顯色，孵育2.5分鐘時(shí)讀數(shù)670nm發(fā)射光密度與待測物濃度成正比。 Spreading Layer 分布層Receptor Layer 受體層Gelatin Layer 膠乳層Estar support layer 聚酯支持層EnzymeAntibodyEnzyme-labeledAntigenGelatin ReagentPatient Sample病人標(biāo)本Enzyme Labeled Hapten酶標(biāo)半抗原Immobilized AbGelat

10、in Reagent 膠乳試劑Patient Sample病人標(biāo)本Enzyme Labled HaptenImmobilized AbPatient SampleGelatin ReagentEnzyme Labled Hapten+ Antigen in SampleImmobilized AbGelatin ReagentGelatin ReagentCompetitive Binding 競爭性結(jié)合Binding Ag & Free Ag 結(jié)合抗原 與 游離抗原Gelatin ReagentSubstrate Addition 底物加入Gelatin ReagentDetermine Analyte Conc.分析物測定Low C