DB53∕T 1067-2021 純種綠孔雀鑒定技術(shù)規(guī)程

1、53ICS 65.020.30 CCS B41云南省地方標準DB53/T 10672021純種綠孔雀鑒定技術(shù)規(guī)程Technical specification for identification of pure Pavo muticus2021 - 09 - 30 發(fā)布2021 - 10 - 14 實施云南省市場監(jiān)督管理局發(fā) 布學(xué)兔兔 標準下載DB53/T 10672021目次前言III1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 術(shù)語和定義14 形態(tài)鑒定14.1 鑒定材料14.2 鑒定內(nèi)容24.3 形態(tài)特征24.4 綠孔雀與藍孔雀性狀差別24.5 疑似綠孔雀個體形態(tài)鑒定25 分子鑒定25.1 鑒定材料

2、35.2 鑒定原理35.3 樣品采集35.4 DNA 制備35.5 基因組重測序45.6 參考基因組選擇45.7 純種鑒定4附錄 A（資料性）藍孔雀和綠孔雀性狀對比圖5附錄 B（資料性）DNA 樣品的提取與檢測6附錄 C（資料性）試劑及儀器設(shè)備8附錄 D（資料性）鑒定結(jié)果樣表9IDB53/T 10672021前言本文件按照GB/T 1.1-2020標準化工作導(dǎo)則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。 本文件由云南省林業(yè)與草原局、云南省市場監(jiān)督管理局共同提出。本文件由云南省林業(yè)標準化技術(shù)委員會（YNTC02）歸

3、口。本文件主要起草單位：中國科學(xué)院昆明動物研究所、云南省標準化研究院。本文件主要起草人：董鋒、黃艷梅、單鵬飛、李建春、王潔、李杰、吳飛、伍和啟、高建云、巖道、常江、楊曉君。IIIDB53/T 10672021純種綠孔雀鑒定技術(shù)規(guī)程1 范圍本文件規(guī)定了純種綠孔雀（Pavo muticus）鑒定技術(shù)的形態(tài)鑒定、分子鑒定。本文件適用于綠孔雀的純種鑒定。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 30989-2014 高通量基因測序技

4、術(shù)規(guī)程GB/T 35892 實驗動物 福利倫理審查指南3 術(shù)語和定義GB/T 30989界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1物種鑒定 species identification通過形態(tài)特征、分子鑒定，確定檢測樣本是否為純種個體的過程。3.2基因組 genome一種生物體具有的所有遺傳信息的總和。 來源：GB/T 30989-2014，3.23.3參考基因組序列 reference genome sequence通過對某個物種的基因組進行從頭測序，利用生物信息學(xué)分析方法進行拼接、組裝，而獲得的基因組序列信息。3.4基因組重測序 genome resequencing針對有參考基因組序列

5、的物種的不同個體進行基因組測序，以獲取個體或群體間的差異性信息。3.5小片段基因組文庫 small-insert genomic library片段大小在1 kb以下的普通DNA文庫（200 bp、350 bp、500 bp等），可用于基因組重測序。4 形態(tài)鑒定4.1 鑒定材料1DB53/T 10672021供鑒定的個體應(yīng)為綠孔雀亞成體或成體。4.2 鑒定內(nèi)容鑒定內(nèi)容見表 1。表 1綠孔雀形態(tài)學(xué)鑒定內(nèi)容性狀鑒定項目整體性狀體型、體色冠羽性狀冠羽顏色、形狀、羽軸結(jié)構(gòu)面部性狀眼先顏色、裸皮顏色、形狀頸胸、背部性狀羽色、形狀4.3 形態(tài)特征4.3.1 整體性狀4.3.1.1 個體較大，雄性體重 38

6、50 g5000 g，雌性體重 1060 g1160 g，體羽主要呈金翠綠色。4.3.1.2 雄鳥頭頂具一簇直立的冠羽，下背具閃耀紫輝的銅錢狀花斑；尾屏發(fā)達，長可達 1 m，羽端有一閃耀藍色和翠綠色相嵌的眼狀斑；尾羽黑褐色，形短而隱于尾屏下；初級覆羽和初級飛羽棕黃色。4.3.1.3 雌鳥無尾屏，初級飛羽外翈有黑色橫斑，背羽多呈黑褐色而密布棕褐色斑紋，羽色也較淡鈍， 不如雄鳥艷麗。4.3.2 冠羽性狀4.3.2.1 冠羽顏色：羽緣具翠綠色寬緣，中央呈輝藍色。4.3.2.2 冠羽形狀：簇狀。4.3.2.3 羽枝結(jié)構(gòu)：羽軸兩側(cè)由羽基至頂端均著生羽小枝。4.3.3 頰部性狀4.3.3.1 眼周裸皮呈淺

7、鈷藍色，頰部裸皮呈淺鈷黃色。4.3.3.2 眼先雄性藍黑色，雌性棕褐色。4.3.4 頸胸背性狀頸胸部及上背部呈金銅色的銅錢狀花斑，羽基暗紫藍色，常展露于外，羽緣閃翠綠色。4.4 綠孔雀與藍孔雀性狀差別綠孔雀與藍孔雀整體形態(tài)對比參見附錄A圖A.1。綠孔雀與藍孔雀之冠羽、頰部以及頸胸背性狀對比 見附錄A圖A.2。4.5 疑似綠孔雀個體形態(tài)鑒定將待檢個體與純種綠孔雀按4.3、4.4條要求進行逐一觀察、比對及記錄，全部性狀符合純種綠孔雀 形態(tài)學(xué)特征，判定為疑似綠孔雀。5 分子鑒定2DB53/T 106720215.1 鑒定材料經(jīng)形態(tài)鑒定為疑似綠孔雀或無法進行形態(tài)鑒定的個體的血液、羽毛樣品等。5.2 鑒

8、定原理綠孔雀與藍孔雀（Pavocristatus）存在顯著的基因組水平遺傳分化，可通過計算和統(tǒng)計待檢樣品 基因組中兩物種的遺傳組成貢獻率判斷其種質(zhì)資源狀況。5.3 樣品采集5.3.1 樣品采集中的動物福利應(yīng)符合 GB/T 35892 的要求。5.3.2 血液采集使用一次性真空采血管（添加 EDTA-K2）采血 50 L100 L。血樣短期保存于-20 冰箱，長期保存于-80 冰箱。5.3.3 血液不可獲取時，可用無菌塑膠手套收集自然脫落飛羽、尾羽或尾上覆羽等。剪取如圖 1 所示的羽根部分，短期保存于-20 冰箱，長期保存于-80 冰箱。圖 1用于 DNA 提取的羽毛部分示意圖5.4 DNA 制

9、備可采用傳統(tǒng)DNA提取方法（參見附錄B中B.1）或商業(yè)試劑盒提取DNA，常用試劑和儀器參見附錄C， 用于建庫的DNA宜符合如下要求：a) 使用 1%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)（DNA 完整性膠檢測見附錄 B 中 B.2）檢測 DNA 完整性， 凝膠電泳條帶清晰且應(yīng)在 2 kb 以上（如圖 2 示例）；b) 使用紫外分光光度計檢測 DNA 純度和濃度（檢測方法參見附錄 B 中 B.3），在 260 nm 和 280 nm 的紫外線吸收值比值（OD260/280）在 1.82.0 之間，濃度不低于 50 ng/uL，總質(zhì)量不低于 3 g。3DB53/T 10672021圖 2瓊脂糖凝膠電泳 DN

10、A 條帶示意圖注：其中M代表DNA分子量標準Marker，16代表待檢DNA樣品。圖中DNA主帶清晰且在2 Kb以上。5.5 基因組重測序開展DNA樣品的小片段基因組文庫構(gòu)建（即建庫）和測序，技術(shù)要求應(yīng)符合GB/T 30989的要求。選擇兩端序列對讀（即雙端測序）模式。上述建庫和測序可送至商業(yè)公司開展。為保證分析質(zhì)量，每待檢個體總測序原始數(shù)據(jù)量不低于5 Gbp，去除接頭序列以備后需分析。5.6 參考基因組選擇在NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇已發(fā)布最新版本的純種藍孔雀基因組（如GenBank訪問號：GCA_005519975.1）和純種綠孔雀基因組（如GenBank訪問號：GCA_016647715.1）

11、作為參考基因組。5.7 純種鑒定可采用開源軟件sppIDer，分別計算和統(tǒng)計待檢個體基因組測序數(shù)據(jù)中比對到純種綠孔雀和藍孔雀參考基因組成分的比例。當藍孔雀的基因組貢獻率低于1%時，軟件判定待檢個體為純種綠孔雀個體。當藍孔雀的基因組貢獻率高于1%時，軟件判定待檢個體為非綠孔雀純種個體，鑒定結(jié)果模板參見附錄D。4DB53/T 10672021附錄A（資料性）藍孔雀和綠孔雀性狀對比圖圖 A.1綠孔雀與藍孔雀整體形態(tài)對比注：引自 Daniel Giraud Elliot,1872. A monograph of the Phasianidae, or, Family of the pheasants.

12、圖 A.2綠孔雀與藍孔雀的冠羽、面部以及頸胸背部性狀對比注：引自 Daniel Giraud Elliot,1872. A monograph of the Phasianidae, or, Family of the pheasants.5DB53/T 10672021附錄B（資料性）DNA 樣品的提取與檢測B.1 使用傳統(tǒng)方法提取血液或羽毛DNAB.1.1 取5 µL10 µL血液或13個來自同一個體的羽根于1.5 mL離心管中。如是羽根，使用滅過菌的眼科剪剪碎。B.1.2 加入500 µL于4 預(yù)冷的細胞裂解液（配方為：100 mM Tris-HCl，5 m

13、M EDTA，500 mM NaCl， 1% SDS，pH8.0），混勻懸濁液。B.1.3 向裂解產(chǎn)物中加入20 µL蛋白酶K溶液（10 mg/mL），混勻后，放入恒溫混勻儀于1 000 rpm混勻頻率和55 消化3 h以上，但不要超過10 h。B.1.4 將消化液溫度降至室溫，加入200 µL醋酸鉀溶液上下顛倒搖晃20s左右，使其充分混合。B.1.5 放入普通高速離心機中13 000 rpm離心5min，使蛋白/SDS復(fù)合物沉淀。B.1.6 將上清轉(zhuǎn)移到另一干凈1.5 mL離心管中，加入600 µL異丙醇，充分混合，用13 000 rpm離心5min收集DNA沉

14、淀。B.1.7 倒去上清，加入500 µL 70乙醇溶液，顛倒管子數(shù)次，用13 000 rpm離心3min。B.1.8 倒去上清，在實驗臺上敞口放置3min10min促使殘余乙醇揮發(fā)。B.1.9 將DNA沉淀溶解于50 µL100 µL雙蒸水中，吸取5 µL用于瓊脂糖凝膠檢測和核酸定量檢測，其余轉(zhuǎn)入-20 保存。B.2 DNA完整性膠檢測B.2.1 用雙蒸水洗凈制膠模板和梳子，調(diào)節(jié)水平，放在制膠平板上，向電泳槽中倒入1XTAE電泳緩沖液， 其量以沒過電泳槽0.2 cm為宜。B.2.2 稱取1 g瓊脂糖與100 mL 1xTAE緩沖液，加入到配膠用的三角燒

15、瓶內(nèi)，旋轉(zhuǎn)搖晃均勻。B.2.3 微波爐內(nèi)加熱2.5min，取出后加入一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液。B.2.4 倒入膠槽，加入梳子，室溫下放置30min至凝膠完全凝結(jié)，小心向上拔出梳子，將凝膠預(yù)浸在電 泳槽內(nèi)，靜置2min至加樣孔內(nèi)無氣泡。B.2.5 使用移液器取1 µL DNA樣品，與1 µL 6×loading buffer混勻后，加入凝膠的加樣孔內(nèi)。B.2.6 接通電泳儀電源，保證加樣孔的一端朝向負極，150 V恒壓運行20min40min，loading buffe r中溴酚藍代表的片段大小為300 bp，電泳中保證該指示劑不要泳動出凝膠。B.2

16、.7 電泳完畢，關(guān)閉電源，在凝膠成像儀紫外模式下觀察電泳帶及其位置，并與DNA分子量標準Mar ker比較以判斷DNA樣品的完整性。B.3 DNA純度和濃度測量B.3.1 本文件采用的紫外分光光度計為NanoDrop2000，若用其它品牌和型號的儀器，分析步驟請參考具體說明書。B.3.2 啟動NanoDrop2000配套軟件，設(shè)置檢測樣品為“核酸”，進入檢測界面。B.3.3 命名樣品ID，設(shè)置樣品類型為DNA，使用雙蒸水作為空白液進行基線校準。B.3.4 使用濾紙擦凈空白液，依次檢測DNA樣品。6DB53/T 10672021B.3.5 測量結(jié)束后，將測量參數(shù)輸出到表格，使用雙蒸水和濾紙清潔3

17、5次，并關(guān)閉軟件。7DB53/T 10672021附錄C（資料性） 試劑及儀器設(shè)備C.1 主要試劑C.1.1 50×TAE緩沖液(Tris-醋酸鹽-EDTA)：一種核酸電泳緩沖液，主要用于DNA的瓊脂糖凝膠電泳。主要成分為Tris-乙酸鹽（濃度40mM）和EDTA（濃度1mM）。可直接用雙蒸水稀釋50倍至工作濃度（1×）使用。C.1.2 核酸熒光染料：用于凝膠成像顯示條帶。C.1.3 6xLoading Buffer：瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液，可以顯示兩條帶，前面的藍色條帶是溴酚藍， 代表的片段大小是300 bp，后面的綠色條帶是二甲苯青，代表的片段大小在4 000 bp左

18、右。C.1.4 蛋白酶K溶液：用于核酸與蛋白質(zhì)的分離，濃度為10 mg/mL。C.1.5 3M醋酸鉀溶液：取60 mL的 5 mol/L醋酸鉀，加11.5 mL冰醋酸，加雙蒸水稀釋至 100 mL， PH4.8。C.1.6 異丙醇：分析純級。C.1.7 70%乙醇溶液。C.1.8 雙蒸水：ddH2O。C.1.9 瓊脂糖。C.1.10 細胞裂解緩沖液：100 mM Tris-HCl，5 mM EDTA 500mM NaCl，1% SDS, pH8.0。C.1.11 蛋白酶K。C.1.12 SDS：十二烷基硫酸鈉。C.1.13 DNA分子量標準Marker：100 bp2000 bp。C.2 儀器設(shè)備C.2.1 單道可調(diào)式移液器（如，最大量程分別為3 µL，20 µ