酶工程第三章酶的生物合成法生產(chǎn)

1、 第二章第二章 內(nèi)容總結(jié)內(nèi)容總結(jié)11、細(xì)菌 2、放線菌 屬原核單細(xì)胞生物，有球菌、桿菌和螺旋菌三類，屬原核單細(xì)胞生物，有球菌、桿菌和螺旋菌三類，分革蘭氏陽性菌和陰性菌。在發(fā)酵專業(yè)中常用的是桿菌，分革蘭氏陽性菌和陰性菌。在發(fā)酵專業(yè)中常用的是桿菌，它易形成芽孢。它易形成芽孢。 屬原核生物，菌落呈放射狀，廣泛存在于泥土中，屬原核生物，菌落呈放射狀，廣泛存在于泥土中，最大經(jīng)濟(jì)價(jià)值是用來生產(chǎn)抗生素。最大經(jīng)濟(jì)價(jià)值是用來生產(chǎn)抗生素。3、霉菌 屬真核生物，俗稱絲狀真菌。在發(fā)酵工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品屬真核生物，俗稱絲狀真菌。在發(fā)酵工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品和皮革等方面有重要用途，但易引起工業(yè)原料、產(chǎn)品和農(nóng)副和皮革等方面有重要用

2、途，但易引起工業(yè)原料、產(chǎn)品和農(nóng)副產(chǎn)品的發(fā)霉變質(zhì)。產(chǎn)品的發(fā)霉變質(zhì)。4、酵母菌 屬真核單細(xì)胞生物，主要生長在偏酸含糖量較高的屬真核單細(xì)胞生物，主要生長在偏酸含糖量較高的環(huán)境中，酒精、飲料等生產(chǎn)中有重要用途。環(huán)境中，酒精、飲料等生產(chǎn)中有重要用途。2 微生物工業(yè)對菌種的要求微生物工業(yè)對菌種的要求 ： (1)廉價(jià)原料、生長迅速、目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。廉價(jià)原料、生長迅速、目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。 (2)易于控制培養(yǎng)條件，酶活性高；發(fā)酵周期較短。易于控制培養(yǎng)條件，酶活性高；發(fā)酵周期較短。 (3)抗雜菌和嗜菌體的能力強(qiáng)。抗雜菌和嗜菌體的能力強(qiáng)。 (4)菌種純，不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害的生菌種純，不易變異和退化，不產(chǎn)生

3、任何有害的生物活物質(zhì)和毒素，保證安全生產(chǎn)。物活物質(zhì)和毒素，保證安全生產(chǎn)。 3定方案：定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：采樣：有針對性地采集樣品。增殖：增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：分離：利用分離技術(shù)得到純種。發(fā)酵性能測定：發(fā)酵性能測定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。新種分離與篩選的步驟（新種分離與篩選的步驟（P56）4富集方法富集方法1、添加特殊的營養(yǎng)物質(zhì)2、調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿性3、控制培養(yǎng)溫度和熱處

4、理4、添加抑制劑5產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育一、誘變育種一、誘變育種 化學(xué)誘變化學(xué)誘變 物理誘變物理誘變二、基因育種二、基因育種出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理篩選保藏6第三章第三章 酶的生物合成與發(fā)酵生產(chǎn)酶的生物合成與發(fā)酵生產(chǎn) 提取分離法提取分離法 微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶 酶的生產(chǎn)方法酶的生產(chǎn)方法 生物合成法生物合成法 植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶 化學(xué)合成法化學(xué)合成法 動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶 7微生物發(fā)酵產(chǎn)酶微生物發(fā)酵產(chǎn)酶n酶的發(fā)酵生產(chǎn)：經(jīng)過預(yù)先設(shè)計(jì)，通過人工操酶的發(fā)酵生產(chǎn)：經(jīng)過預(yù)先設(shè)計(jì)，通過人工操作，利用微生物的生命活動(dòng)，獲得所需的

5、酶作，利用微生物的生命活動(dòng)，獲得所需的酶的技術(shù)過程。的技術(shù)過程。大多數(shù)酶的生產(chǎn)采用發(fā)酵生產(chǎn)大多數(shù)酶的生產(chǎn)采用發(fā)酵生產(chǎn)原因：微生原因：微生物具有種類多、繁殖快、易培養(yǎng)、代謝能力物具有種類多、繁殖快、易培養(yǎng)、代謝能力強(qiáng)等特點(diǎn)強(qiáng)等特點(diǎn)8酶的發(fā)酵生產(chǎn)的方式：酶的發(fā)酵生產(chǎn)的方式：|固體培養(yǎng)發(fā)酵|液體深層發(fā)酵|固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵|固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵9 第一節(jié)第一節(jié) 酶生物合成及調(diào)節(jié)酶生物合成及調(diào)節(jié)一、酶的生物合成一、酶的生物合成 遺傳信息傳遞的中心法則遺傳信息傳遞的中心法則 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)翻譯翻譯轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制復(fù)制復(fù)制DNARNA 10（一）（一）RNARNA的生物合成的生物合成-轉(zhuǎn)錄

6、轉(zhuǎn)錄(transcription)(transcription) 定義定義 以以DNADNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNARNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNARNA分子分子的過程。的過程。. .11T C G A G T A CA G C T C A T GC G A G U A CG C A URNA聚合酶聚合酶RNAPPi555533GTPUTPCTPATPUTPRNA在在DNA模板上的生物合成模板上的生物合成33335512編碼鏈編碼鏈（coding strand)模板鏈模板鏈（template strand）RNA

7、的轉(zhuǎn)錄過程的轉(zhuǎn)錄過程( (三步三步) )1.1.起始起始2.2.延長延長3.3.終止終止 13RNARNA合成過程合成過程起始起始雙鏈雙鏈DNA局部解開局部解開磷酸二酯磷酸二酯鍵形成鍵形成終止階段終止階段解鏈區(qū)到達(dá)解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)基因終點(diǎn)延長階段延長階段5 3 RNA 啟動(dòng)子（啟動(dòng)子（promotor) 終止子終止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 離開離開1415RNARNA合成過程合成過程前體加工前體加工 定義定義 以以mRNAmRNA為模板，以氨基酸為底物，在核為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種糖體上通過各種tRNAtRNA、酶和輔助因

8、子的作用，、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過程。合成多肽鏈的過程。（二）蛋白質(zhì)的生物合成（二）蛋白質(zhì)的生物合成-翻譯翻譯(translation)(translation) 16 蛋白質(zhì)的合成過程蛋白質(zhì)的合成過程 （大腸桿菌）（大腸桿菌）v 氨基酸的活化氨基酸的活化v 肽鏈合成的起始肽鏈合成的起始v 肽鏈的延伸肽鏈的延伸v 肽鏈合成的終止與釋放肽鏈合成的終止與釋放17氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)式：反應(yīng)式：AA + tRNA + ATPAA + tRNA + ATP氨酰氨酰-tRNA-tRNA合成酶合成酶AA-tRNAAA-tRNA+AMP+PPi +AMP+PPi 對于對于E.

9、coliE.coli而言，肽鏈合成時(shí)的第一而言，肽鏈合成時(shí)的第一個(gè)氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（個(gè)氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMetfMet）。）。18AA + ATP + E AA + ATP + E E-AA-AMPE-AA-AMP+PPi +PPi E-AA-AMPE-AA-AMP+ tRNA + tRNA AA-tRNAAA-tRNA+AMP +AMP 在核糖體上合成多肽（三階段）在核糖體上合成多肽（三階段）1 1、起始階段、起始階段2 2、延伸階段、延伸階段3 3、終止階段、終止階段1920二、酶生物合成的調(diào)節(jié)二、酶生物合成的調(diào)節(jié)定義：定義：通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物通過調(diào)節(jié)酶合成的量來

10、控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的。進(jìn)行的。意義：意義：通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。合成的原料和能量。21轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)翻譯水平的調(diào)節(jié)翻譯水平的調(diào)節(jié)翻譯產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)翻譯產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)酶降解調(diào)節(jié)酶降解調(diào)節(jié)組成酶：組成酶：DNADNA酶，酶，RNARNA酶，酶， 糖酵解途徑的酶糖酵解途徑的酶調(diào)節(jié)酶：適應(yīng)酶，調(diào)節(jié)酶：適應(yīng)酶，- -半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（誘誘導(dǎo)酶）導(dǎo)酶）酶的類型酶的類型酶合成的調(diào)節(jié)控制酶合成的調(diào)節(jié)控制22（一）酶合成調(diào)節(jié)的類型

11、（一）酶合成調(diào)節(jié)的類型 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控包括誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控包括誘導(dǎo)(induction)和阻遏和阻遏(repression)兩種方式。兩種方式。 凡能促進(jìn)酶生物合成的現(xiàn)象，稱為誘導(dǎo)，而能阻凡能促進(jìn)酶生物合成的現(xiàn)象，稱為誘導(dǎo)，而能阻礙酶生物合成的現(xiàn)象，稱為阻遏。礙酶生物合成的現(xiàn)象，稱為阻遏。1.誘導(dǎo)誘導(dǎo)(induction)：是酶促分解底物或產(chǎn)物誘使微生是酶促分解底物或產(chǎn)物誘使微生物細(xì)胞合成分解代謝途徑中有關(guān)酶的過程。物細(xì)胞合成分解代謝途徑中有關(guān)酶的過程。 微生物通過誘導(dǎo)作用而產(chǎn)生的酶稱為微生物通過誘導(dǎo)作用而產(chǎn)生的酶稱為誘導(dǎo)酶（誘導(dǎo)酶（為為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時(shí)合成的酶類）。適應(yīng)外來

12、底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時(shí)合成的酶類）。 舉例：舉例：E.coli在含乳糖的培養(yǎng)基中合成在含乳糖的培養(yǎng)基中合成-半乳糖苷半乳糖苷酶和半乳糖苷滲透酶等。酶和半乳糖苷滲透酶等。 23誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物(inducer)：底物或結(jié)構(gòu)類似物，如：底物或結(jié)構(gòu)類似物，如：異丙基異丙基- -D-硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTG，isopropylthiogalactoside）。）。 誘導(dǎo)作用的類型誘導(dǎo)作用的類型： 同時(shí)誘導(dǎo)同時(shí)誘導(dǎo)：誘導(dǎo)物加入后，微生物：誘導(dǎo)物加入后，微生物能同時(shí)誘導(dǎo)出幾種酶的合成，主要存在能同時(shí)誘導(dǎo)出幾種酶的合成，主要存在于短的代謝途徑中。于短的代謝途徑中。 順序誘導(dǎo)順序誘導(dǎo)：先合成能分解底

13、物的酶，：先合成能分解底物的酶，再合成分解各中間代謝物的酶達(dá)到對復(fù)再合成分解各中間代謝物的酶達(dá)到對復(fù)雜代謝途徑的分段調(diào)節(jié)。雜代謝途徑的分段調(diào)節(jié)。24組成酶（固有酶）組成酶（固有酶）：不依賴底物或底物結(jié)：不依賴底物或底物結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶。如：構(gòu)類似物的存在而合成的酶。如：EMP途途徑的一些酶。徑的一些酶。誘導(dǎo)酶：誘導(dǎo)酶：依賴于底物或底物結(jié)構(gòu)類似物的依賴于底物或底物結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶。如：乳糖酶。存在而合成的酶。如：乳糖酶。 （一）酶合成調(diào)節(jié)的類（一）酶合成調(diào)節(jié)的類型型-2252.阻遏（阻遏（repression）代謝過程中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的代謝過程中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的的合的合成的現(xiàn)

14、象，從而更徹底地控制和減少末端產(chǎn)物的合成的現(xiàn)象，從而更徹底地控制和減少末端產(chǎn)物的合成。成。阻遏作用的類型阻遏作用的類型：末端產(chǎn)物阻遏（末端產(chǎn)物阻遏（end-product repression）：由于）：由于終產(chǎn)物的過量積累而導(dǎo)致生物合成途徑中酶合成的終產(chǎn)物的過量積累而導(dǎo)致生物合成途徑中酶合成的阻遏的現(xiàn)象，常常發(fā)生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等這阻遏的現(xiàn)象，常常發(fā)生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等這些重要結(jié)構(gòu)元件生物合成的時(shí)候。些重要結(jié)構(gòu)元件生物合成的時(shí)候。例如過量的精氨酸阻遏了參與合成精氨酸的許多酶例如過量的精氨酸阻遏了參與合成精氨酸的許多酶的合成。的合成。26 分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏（cataboli

15、te repression）：）：當(dāng)微生物在含有兩種能夠分解底物的培養(yǎng)基中當(dāng)微生物在含有兩種能夠分解底物的培養(yǎng)基中生長時(shí)，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢生長時(shí)，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶的合成的現(xiàn)象。的底物的有關(guān)酶的合成的現(xiàn)象。n最早發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌生長在含葡萄糖和乳糖的最早發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌生長在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基時(shí)培養(yǎng)基時(shí),故又稱故又稱葡萄糖效應(yīng)葡萄糖效應(yīng)。分解代謝物阻。分解代謝物阻遏導(dǎo)致出現(xiàn)遏導(dǎo)致出現(xiàn)“二次生長（二次生長（diauxic growth）”.n直接作用者是直接作用者是優(yōu)先利用的碳源的中間代謝物優(yōu)先利用的碳源的中間代謝物實(shí)質(zhì)是：實(shí)質(zhì)是：2719601960

16、年年JacobJacob和和MonodMonod提出的操縱子學(xué)說提出的操縱子學(xué)說調(diào)節(jié)基因：產(chǎn)生阻遏蛋白調(diào)節(jié)基因：產(chǎn)生阻遏蛋白啟動(dòng)基因啟動(dòng)基因操縱基因：與阻遏蛋白結(jié)合操縱基因：與阻遏蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)基因：蛋白多肽鏈產(chǎn)物結(jié)構(gòu)基因：蛋白多肽鏈產(chǎn)物操縱子操縱子1.RNA1.RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)2.cAMP2.cAMP及其受體蛋白復(fù)合物（及其受體蛋白復(fù)合物（cAMP-cAMP-CRPCRP）結(jié)合位點(diǎn)）結(jié)合位點(diǎn)（二）操縱子學(xué)說（二）操縱子學(xué)說28基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因 啟動(dòng)基因啟動(dòng)基因 操縱基因操縱基因 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 DNA 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 （-） RN

17、A聚合酶聚合酶 （+） 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯 mRNA 翻譯翻譯 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)劑 控制區(qū)控制區(qū) 信息區(qū)信息區(qū)操縱子操縱子29 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因(regulator gene)(regulator gene)： 可產(chǎn)生一種組成型調(diào)節(jié)蛋白可產(chǎn)生一種組成型調(diào)節(jié)蛋白(regulatory (regulatory protein) protein) （一種變構(gòu)蛋白），通過與效應(yīng)（一種變構(gòu)蛋白），通過與效應(yīng)物物(effector) (effector) （包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物）（包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物）的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操

18、縱基因的結(jié)合力。操縱基因的結(jié)合力。 調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。30RPOSD N AC RP-cA M P復(fù) 合 物C RP+cA M P cAMP-CRP復(fù)合物的作用示意圖復(fù)合物的作用示意圖 啟動(dòng)基因（啟動(dòng)基因（promotor genepromotor gene）（啟動(dòng)子）：）（啟動(dòng)子）： 有兩個(gè)位點(diǎn)：有兩個(gè)位點(diǎn)： （1 1）RNARNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)（2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的結(jié)合位點(diǎn)。的結(jié)合位點(diǎn)。CAPCAP：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（catabolite gene catabolite gen

19、e activator proteinactivator protein），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMP (cAMP receptor proteinreceptor protein，CRPCRP）。）。 只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，RNARNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，酶的合成才聚合酶才能結(jié)合到其在啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，酶的合成才能開始。能開始。 31操縱基因（操縱基因（Operater geneOperater gene）: : 位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一

20、段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時(shí)機(jī)與速度。蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時(shí)機(jī)與速度。結(jié)構(gòu)基因（結(jié)構(gòu)基因（Structural geneStructural gene）: : 決定某一多肽的決定某一多肽的DNADNA模板，與酶有各自模板，與酶有各自的對應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為的對應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNAmRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。再翻譯為蛋白質(zhì)。32原核生物中操縱子的類型原核生物中操縱子的類型1.1.誘導(dǎo)型操縱子：乳糖操縱子誘導(dǎo)型操縱子：乳糖操縱子2.2.阻遏型操縱子：色氨酸操縱子阻遏型操縱子：色氨酸操縱子33（三

21、）酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制（三）酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制2.2.分解代謝物阻遏作用分解代謝物阻遏作用1.1.酶生物合成的誘導(dǎo)作用酶生物合成的誘導(dǎo)作用3.3.酶生物合成的反饋?zhàn)瓒糇饔妹干锖铣傻姆答佔(zhàn)瓒糇饔?4 酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象：酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象： 已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； -半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)）大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無上述三種酶合成；胞內(nèi)無上述三種酶合成； （2）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞）大腸桿菌生長在乳糖培養(yǎng)基上時(shí)，

22、細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成；內(nèi)有上述三種酶合成； （3）表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：）表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：需要時(shí)需要時(shí)才合成才合成。35調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因基因操縱操縱基因基因乳糖酶結(jié)構(gòu)基因乳糖酶結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 關(guān)關(guān) 閉閉啟啟動(dòng)動(dòng)子子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因基因操縱操縱基因基因乳糖酶結(jié)構(gòu)基因乳糖酶結(jié)構(gòu)基因啟啟動(dòng)動(dòng)子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（無活性）（無活性） 基基 因因 表表達(dá)達(dá)mRNAA、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)B、乳糖酶的誘導(dǎo)、乳糖酶的誘導(dǎo) 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻

23、遏蛋白（有活性）（有活性）誘導(dǎo)誘導(dǎo)36 2. 2.末端產(chǎn)物阻遏末端產(chǎn)物阻遏 由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏。 酶合成阻遏的現(xiàn)象：酶合成阻遏的現(xiàn)象： 實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)： （1）大腸桿菌生長在無機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí)，）大腸桿菌生長在無機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí)， 檢測到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；檢測到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，）表明色氨酸的存在

24、阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長的經(jīng)濟(jì)原則體現(xiàn)了菌體生長的經(jīng)濟(jì)原則:不需要就不合成不需要就不合成。37 色氨酸操縱子色氨酸操縱子酶的阻遏酶的阻遏調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達(dá)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因操縱基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基基因不能表達(dá)因不能表達(dá)38引起反饋?zhàn)瓒舻囊鸱答佔(zhàn)瓒舻奈镔|(zhì)，稱為共阻物質(zhì)，稱為共阻遏物或輔阻遏物。遏物或輔

25、阻遏物。舉例：無機(jī)磷酸阻舉例：無機(jī)磷酸阻遏堿性磷酸酶遏堿性磷酸酶無阻遏物時(shí)：添加阻遏物時(shí)： R P O S1 S2 DNA翻譯mRNA R P O S1 S2 DNA共阻遏物共阻遏物磷酸單酯磷酸單酯 磷酸磷酸+ +醇醇堿性磷酸酶堿性磷酸酶39酶酶的的誘誘導(dǎo)導(dǎo)和和阻阻遏遏操操縱縱子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因操縱基因啟動(dòng)基因啟動(dòng)基因調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因阻遏蛋白阻擋操縱基因結(jié)構(gòu)基因

26、不表達(dá)結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用到阻擋操縱基因的作用,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合, 結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)阻遏蛋白阻遏蛋白(無活性無活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏蛋從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因白能夠阻擋操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物40調(diào)控方式 阻遏蛋白 添加物 與操縱基因結(jié)合阻遏效應(yīng)舉例酶的誘導(dǎo)有活性不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯誘導(dǎo)物轉(zhuǎn)錄，繼而翻

27、譯乳糖操縱子酶的阻遏無活性阻遏物不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對比酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對比413.3.分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏n指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時(shí)，利用快的那種分解底物會阻源）存在時(shí)，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。n分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所過甲碳源（或氮源等）在

28、其分解過程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。42分解代謝物阻遏現(xiàn)象：分解代謝物阻遏現(xiàn)象： 實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個(gè)對數(shù)生長期中間隔開一個(gè)生長延滯期的生了兩個(gè)對數(shù)生長期中間隔開一個(gè)生長延滯期的“二二次生長現(xiàn)象次生長現(xiàn)象”(diauxie(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。02468020406080 細(xì)胞 濃 度(OD)時(shí) 間(h) 這一現(xiàn)象

29、又稱葡萄糖效應(yīng)，這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（受體蛋白（CRPCRP）, ,亦稱亦稱降解物降解物基因活化蛋白（基因活化蛋白（CAPCAP）。）。43分解代謝物阻遏分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表達(dá)達(dá)CAP基因基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因TCAPOCAP結(jié)結(jié)合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP -CAPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代謝產(chǎn)物謝產(chǎn)物腺苷酸腺苷酸環(huán)化酶環(huán)化酶磷酸二酯磷酸

30、二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物與葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系的關(guān)系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白，環(huán)腺苷酸受體：降解物基因活化蛋白，環(huán)腺苷酸受體蛋白（蛋白（catabolic gene activation protein）降低降低cAMP濃度濃度使使CAP呈失活狀態(tài)呈失活狀態(tài)44（二）遺傳控制（一勞永逸）（二）遺傳控制（一勞永逸） 1.1.改良菌種改良菌種 (1) 使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型選育組成型突變株選育組成型突變株可用來減少酶合成對誘導(dǎo)物的依賴性的突變作用稱為調(diào)節(jié)性突可用來減少酶合成對誘導(dǎo)物的依賴性的突變作用稱為調(diào)節(jié)性突變。變。突變的部位位

31、于突變的部位位于調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因而非結(jié)構(gòu)基因上，使它不能形成阻遏而非結(jié)構(gòu)基因上，使它不能形成阻遏物或失去了結(jié)合阻遏物的能力，因而突變株在沒有誘導(dǎo)物存在物或失去了結(jié)合阻遏物的能力，因而突變株在沒有誘導(dǎo)物存在條件下，酶產(chǎn)量也能達(dá)到誘導(dǎo)水平。條件下，酶產(chǎn)量也能達(dá)到誘導(dǎo)水平。不需用誘導(dǎo)物能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶的突變，稱為組成型突變。不需用誘導(dǎo)物能產(chǎn)生誘導(dǎo)酶的突變，稱為組成型突變。篩選此類突變株可采用以下方法：細(xì)胞經(jīng)誘變后，在基質(zhì)誘篩選此類突變株可采用以下方法：細(xì)胞經(jīng)誘變后，在基質(zhì)誘導(dǎo)物限制條件下進(jìn)行恒化培養(yǎng)，從而篩選出不需誘導(dǎo)物的突變導(dǎo)物限制條件下進(jìn)行恒化培養(yǎng)，從而篩選出不需誘導(dǎo)物的突變株；把經(jīng)誘變后的細(xì)胞接種

32、于只含有非誘導(dǎo)物基質(zhì)的瓊脂培株；把經(jīng)誘變后的細(xì)胞接種于只含有非誘導(dǎo)物基質(zhì)的瓊脂培養(yǎng)基上，只有組成型的突變株能在此條件下生長，因而定向篩養(yǎng)基上，只有組成型的突變株能在此條件下生長，因而定向篩選出組成型突變株。選出組成型突變株。45(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜褪棺瓒粜妥優(yōu)槿プ瓒粜蚽獲得的突變株在通常引起阻遏的條件下酶產(chǎn)量也獲得的突變株在通常引起阻遏的條件下酶產(chǎn)量也達(dá)到無阻遏水平。達(dá)到無阻遏水平。n通過誘變使通過誘變使調(diào)節(jié)基因處發(fā)生突變調(diào)節(jié)基因處發(fā)生突變，從而產(chǎn)生一種，從而產(chǎn)生一種不能與輔阻遏物結(jié)合的阻遏物蛋白，或者在不能與輔阻遏物結(jié)合的阻遏物蛋白，或者在操縱操縱基因上突變基因上突變，使不能結(jié)合阻遏物

33、可獲得調(diào)節(jié)性突，使不能結(jié)合阻遏物可獲得調(diào)節(jié)性突變株。變株。n這類組成型突變株可用以下方法篩選：這類組成型突變株可用以下方法篩選： 篩選耐終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物的突變株。例如分離篩選耐終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物的突變株。例如分離出的耐乙硫氨酸突變株，其胱硫醚合成酶產(chǎn)量增出的耐乙硫氨酸突變株，其胱硫醚合成酶產(chǎn)量增加加120倍；倍； 有許多酶的合成受氨的阻遏，篩選耐甲基胺的有許多酶的合成受氨的阻遏，篩選耐甲基胺的突變株可去除氨對酶的阻遏作用。突變株可去除氨對酶的阻遏作用。 462. 基因工程育種基因工程育種 n通過基因工程手段改變細(xì)胞的調(diào)節(jié)基因，從通過基因工程手段改變細(xì)胞的調(diào)節(jié)基因，從而使菌種由誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型，阻

34、遏型變?yōu)槎咕N由誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型，阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?，提高菌種的酶生產(chǎn)能力；去阻遏型，提高菌種的酶生產(chǎn)能力；n另一方面可通過增加結(jié)構(gòu)基因的拷貝數(shù)增加另一方面可通過增加結(jié)構(gòu)基因的拷貝數(shù)增加細(xì)胞專一性酶的生產(chǎn)；細(xì)胞專一性酶的生產(chǎn)；n將有關(guān)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)移給受體培養(yǎng)物，以提高將有關(guān)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)移給受體培養(yǎng)物，以提高細(xì)胞酶的產(chǎn)量。細(xì)胞酶的產(chǎn)量。 47第二節(jié)第二節(jié) 酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究發(fā)酵過程中細(xì)胞生長速率、產(chǎn)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究發(fā)酵過程中細(xì)胞生長速率、產(chǎn)物生長速率、基質(zhì)消耗速率以及環(huán)境因素對這些物生長速率、基質(zhì)消耗速率以及環(huán)境因素對這些速率的影響規(guī)律的學(xué)科。速率的影響規(guī)律的學(xué)科。發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

35、主要包括發(fā)酵動(dòng)力學(xué)主要包括細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)、產(chǎn)物生成產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)（產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)）動(dòng)力學(xué)（產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)）和基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)和基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)。48一、酶生物合成的模式一、酶生物合成的模式二、細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)二、細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)三、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)三、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)本節(jié)主要內(nèi)容本節(jié)主要內(nèi)容: :酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究意義酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究意義: :了解酶生物合成模式了解酶生物合成模式發(fā)酵工藝條件優(yōu)化控制發(fā)酵工藝條件優(yōu)化控制提高酶產(chǎn)量提高酶產(chǎn)量49 微生物生長曲線微生物生長曲線1.1.延遲期（調(diào)整期）延遲期（調(diào)整期） 2.2.對數(shù)生長期對數(shù)生長期 3.3.穩(wěn)定期（平衡期）穩(wěn)定期（平衡期） 4.4.衰亡期衰亡期12

36、34一、酶生物合成的模式一、酶生物合成的模式50 1.1.遲緩期遲緩期（1 1）主要特征：代謝活躍，大量合成細(xì)胞分裂所需）主要特征：代謝活躍，大量合成細(xì)胞分裂所需的酶類、的酶類、ATPATP等；體積增大；分裂遲緩。等；體積增大；分裂遲緩。（2 2）原因：在新的環(huán)境，缺乏分解或催化相關(guān)底物）原因：在新的環(huán)境，缺乏分解或催化相關(guān)底物的酶。的酶。（3 3）縮短和消除遲緩期的方法有：增加接種量、采）縮短和消除遲緩期的方法有：增加接種量、采用最適種齡、選用繁殖速度快的菌種以及盡量保用最適種齡、選用繁殖速度快的菌種以及盡量保持接種前后所處的培養(yǎng)基介質(zhì)和條件一致。持接種前后所處的培養(yǎng)基介質(zhì)和條件一致。 2.

37、2.對數(shù)期對數(shù)期（1 1）特點(diǎn)：分裂速度最快、倍增時(shí)間最短、代謝活）特點(diǎn)：分裂速度最快、倍增時(shí)間最短、代謝活動(dòng)旺盛、對環(huán)境變化敏感。動(dòng)旺盛、對環(huán)境變化敏感。（2 2）作用：作為代謝、生理等研究的好材料和發(fā)酵）作用：作為代謝、生理等研究的好材料和發(fā)酵生產(chǎn)中用作種子的最佳菌齡。生產(chǎn)中用作種子的最佳菌齡。51 3.3.穩(wěn)定期穩(wěn)定期（1 1）特點(diǎn)：新生的細(xì)胞和死亡的細(xì)胞數(shù)目相等、）特點(diǎn)：新生的細(xì)胞和死亡的細(xì)胞數(shù)目相等、總菌數(shù)達(dá)到最大值、代謝活力鈍化。總菌數(shù)達(dá)到最大值、代謝活力鈍化。（2 2）原因：營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗以及代謝廢物的）原因：營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸消耗以及代謝廢物的積累抑制了生長。積累抑制了生長。（

38、3 3）功能：產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（抗生素、生物堿）功能：產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物（抗生素、生物堿、色素等）、芽孢；對穩(wěn)定期的研究發(fā)展了連、色素等）、芽孢；對穩(wěn)定期的研究發(fā)展了連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。 4.4.衰亡期衰亡期 特點(diǎn)：活的細(xì)胞數(shù)目以對數(shù)速率急劇下降、細(xì)胞特點(diǎn)：活的細(xì)胞數(shù)目以對數(shù)速率急劇下降、細(xì)胞裂解或自溶裂解或自溶。52酶生物合成的模式酶生物合成的模式 根據(jù)根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長之間酶的合成與細(xì)胞生長之間的關(guān)系，可將酶的關(guān)系，可將酶的生物合成分為的生物合成分為3 3種模式，即：種模式，即： 同步合成型同步合成型 生長偶聯(lián)型生長偶聯(lián)型 中期合成型中期合成型 部分生長偶聯(lián)型部分生長偶聯(lián)型延續(xù)合成

39、型延續(xù)合成型 非生長偶聯(lián)型非生長偶聯(lián)型 滯后合成型滯后合成型53（1 1）同步合成型：）同步合成型： 酶的合成與細(xì)胞的生長同步進(jìn)行酶的合成與細(xì)胞的生長同步進(jìn)行（2 2）中期合成型）中期合成型 酶的合成在細(xì)胞生長一段時(shí)間后酶的合成在細(xì)胞生長一段時(shí)間后才開始，進(jìn)入平衡期后，酶的合才開始，進(jìn)入平衡期后，酶的合成隨之停止。成隨之停止。 （3 3）延續(xù)合成型：）延續(xù)合成型： 酶的合成伴隨著細(xì)胞的生長而開酶的合成伴隨著細(xì)胞的生長而開始，始， 生長進(jìn)入平衡期后，酶又生長進(jìn)入平衡期后，酶又延續(xù)合成一段時(shí)間。延續(xù)合成一段時(shí)間。 (4) (4) 滯后合成型滯后合成型 當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，才開始并當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入平衡期后

40、，才開始并大量積累酶。大量積累酶。go54（1 1）酶的生物合成可以誘）酶的生物合成可以誘導(dǎo)，不受分解代謝物阻遏導(dǎo)，不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏；和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏；（2 2）當(dāng)除去誘導(dǎo)物或細(xì)胞）當(dāng)除去誘導(dǎo)物或細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成進(jìn)入平衡期后，酶的合成立即停止；立即停止；（3 3）酶所對應(yīng)的）酶所對應(yīng)的mRNAmRNA很不很不穩(wěn)定。穩(wěn)定。同步合成型的特點(diǎn)同步合成型的特點(diǎn)（生長偶聯(lián)型）（生長偶聯(lián)型）a 酶細(xì) 胞細(xì)胞 或酶濃 度時(shí)間55中期合成型的特點(diǎn)中期合成型的特點(diǎn)（生長偶聯(lián)型）（生長偶聯(lián)型）（1 1）酶的合成）酶的合成受到產(chǎn)物的反饋受到產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒艋蚍纸獯x阻遏或分解代謝物阻遏；物阻遏

41、；（2 2）所對應(yīng)的）所對應(yīng)的mRNAmRNA不穩(wěn)定。不穩(wěn)定。56（1 1）酶的合成可以誘導(dǎo)，不受分解代謝物或產(chǎn)物的阻遏；）酶的合成可以誘導(dǎo)，不受分解代謝物或產(chǎn)物的阻遏；（2 2）酶所對應(yīng)的）酶所對應(yīng)的mRNAmRNA相當(dāng)穩(wěn)定，在生長平衡期后仍可繼續(xù)相當(dāng)穩(wěn)定，在生長平衡期后仍可繼續(xù)較長時(shí)間用于酶的合成。較長時(shí)間用于酶的合成。延續(xù)合成型的特點(diǎn)（部分生長偶聯(lián)型）延續(xù)合成型的特點(diǎn)（部分生長偶聯(lián)型）b酶細(xì)胞 細(xì)胞 或酶濃 度時(shí) 間040801200204060 細(xì) 胞濃度 酶濃度酶濃度 (單位/ml)時(shí) 間 (h)0.012.525.037.550.0細(xì) 胞濃度 (g/L) 黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲

42、線黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線57（1 1）在對數(shù)生長期）在對數(shù)生長期不合成酶（可能是不合成酶（可能是受到分解代謝物阻受到分解代謝物阻遏的影響）；遏的影響）；（2 2）所對應(yīng)的）所對應(yīng)的mRNAmRNA穩(wěn)定性高。穩(wěn)定性高。滯后合成型的特點(diǎn)滯后合成型的特點(diǎn)（非生長偶聯(lián)型）非生長偶聯(lián)型）c酶細(xì)胞細(xì)胞 或酶濃 度時(shí) 間58（1 1）mRNAmRNA的穩(wěn)定性；的穩(wěn)定性；（2 2）培養(yǎng)基中阻遏物存在與否。）培養(yǎng)基中阻遏物存在與否。影響酶生物合成的模式的主要因素是：影響酶生物合成的模式的主要因素是：（1 1）mRNAmRNA穩(wěn)定性穩(wěn)定性高高的，可在細(xì)胞停止生長后繼續(xù)合成其所對應(yīng)的的，可在細(xì)胞停止生長后繼續(xù)

43、合成其所對應(yīng)的酶；酶；（2 2）mRNAmRNA穩(wěn)定性穩(wěn)定性差差的，酶的合成隨著細(xì)胞停止生長而終止；的，酶的合成隨著細(xì)胞停止生長而終止；（3 3）受某些物質(zhì)阻遏的，需在細(xì)胞生長一段時(shí)間或在平衡期后）受某些物質(zhì)阻遏的，需在細(xì)胞生長一段時(shí)間或在平衡期后（解除阻遏），開始合成酶。（解除阻遏），開始合成酶。（4 4）不受某些物質(zhì)阻遏的，酶的合成隨著細(xì)胞生長而同步增長。）不受某些物質(zhì)阻遏的，酶的合成隨著細(xì)胞生長而同步增長。規(guī)律：規(guī)律：59 酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：延續(xù)合成型：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明顯發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞開始生長就有

44、酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長進(jìn)差別。細(xì)胞開始生長就有酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時(shí)間。入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時(shí)間。改造非理想模式：改造非理想模式：同步合成型：同步合成型：提高對應(yīng)的提高對應(yīng)的mRNAmRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵 溫度溫度 。滯后合成型：滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使 酶的合成提早開始。酶的合成提早開始。中期合成型：中期合成型：要在提高要在提高mRNAmRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方 面努力面努力。60二、細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)二、細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)主要研究細(xì)胞生長速度及

45、其受外界環(huán)境影響的規(guī)律。主要研究細(xì)胞生長速度及其受外界環(huán)境影響的規(guī)律。19501950年年, ,法國的法國的MonodMonod首先提出表述微生物生長的動(dòng)力首先提出表述微生物生長的動(dòng)力學(xué)方程學(xué)方程, ,細(xì)胞生長速率與細(xì)胞濃度成正比細(xì)胞生長速率與細(xì)胞濃度成正比. .Rx =dX/dt= Xu: 比生長速率比生長速率只存在一種限制性基質(zhì)時(shí)只存在一種限制性基質(zhì)時(shí): :MonodMonod方程是基本的細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)方程方程是基本的細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)方程; ;從不同情況出發(fā)對其進(jìn)行修飾從不同情況出發(fā)對其進(jìn)行修飾. .61MonodMonod方程與米氏方程相似方程與米氏方程相似, ,參數(shù)參數(shù)u um m與與K

46、sKs也也可由雙倒數(shù)作圖法求出可由雙倒數(shù)作圖法求出. .雙倒數(shù)作圖法雙倒數(shù)作圖法6263 當(dāng)產(chǎn)物的生成需要額外消耗底物時(shí)，底物的消耗用于生長、維持和代謝產(chǎn)物的生成即*1SGpdSXdPm XdtYY dt三三、基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)、基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)四、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)四、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)（非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)）（非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)）: :從整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)著眼從整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)著眼, ,研究群體細(xì)胞的產(chǎn)酶速率研究群體細(xì)胞的產(chǎn)酶速率 ；微觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)微觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)（結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)）（結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)）: :從細(xì)胞內(nèi)部著眼從細(xì)胞內(nèi)部著眼, ,研究細(xì)胞中酶合成速率。研究細(xì)胞中酶合成速率。1、分類、分類研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率及各因

47、素對其的影響研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率及各因素對其的影響. .64X細(xì)胞濃度；細(xì)胞濃度；細(xì)胞比生長速率；細(xì)胞比生長速率； 生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)；生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)； 非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率。非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率。2、宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程通式、宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程通式dE/dt=(+)x（1 1）同步合成型：生長偶聯(lián)型）同步合成型：生長偶聯(lián)型 =0=0，dE/dt=dE/dt=X X（2 2）中期合成型：特殊生長偶聯(lián)型）中期合成型：特殊生長偶聯(lián)型 =0=0，dE/dt=dE/dt= X X 有阻遏存在時(shí)，有阻遏存在時(shí)， =0 =0，無酶產(chǎn)生，無酶產(chǎn)生 dE/dt=dE/dt= 0 0 阻遏解除后才開始合成

48、酶阻遏解除后才開始合成酶. .細(xì)胞產(chǎn)酶模式不同，產(chǎn)酶速率與細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)關(guān)系也不同。細(xì)胞產(chǎn)酶模式不同，產(chǎn)酶速率與細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)關(guān)系也不同。討論討論: :65（3 3）滯后合成型：非生長偶聯(lián)型，）滯后合成型：非生長偶聯(lián)型， =0 , =0 , dE/dt=XdE/dt=X（4 4）延續(xù)合成型：部分生長偶聯(lián)型，）延續(xù)合成型：部分生長偶聯(lián)型， 00， 00 dE/dt=dE/dt= X+XX+X有關(guān)模型參數(shù)一般通過線性化處理及嘗試有關(guān)模型參數(shù)一般通過線性化處理及嘗試誤差法求出誤差法求出. .dE/dt=(+)x66RA、Ri：有、無活性的阻遏蛋白；有、無活性的阻遏蛋白；Si、Sr：誘導(dǎo)物和阻遏物；誘

49、導(dǎo)物和阻遏物；cc：環(huán)腺苷酸接受蛋白環(huán)腺苷酸接受蛋白CRP與環(huán)腺苷酸與環(huán)腺苷酸CAMP的復(fù)合物；的復(fù)合物；RSi：RA與與Si的結(jié)合物，不與操縱基因結(jié)合；的結(jié)合物，不與操縱基因結(jié)合；RSr：Ri與與Sr的結(jié)合物，可與操縱基因結(jié)合，而使的結(jié)合物，可與操縱基因結(jié)合，而使 mRNA無法合成無法合成 。N：RNA的分解產(chǎn)物。的分解產(chǎn)物。附附:3、微觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)、微觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)（1）細(xì)胞內(nèi)酶生物合成的一般模型）細(xì)胞內(nèi)酶生物合成的一般模型（cf.P54)67第三節(jié)第三節(jié) 酶發(fā)酵生產(chǎn)的工藝控制酶發(fā)酵生產(chǎn)的工藝控制保藏細(xì)胞保藏細(xì)胞細(xì)胞活化細(xì)胞活化細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵發(fā)酵分離純化分離純化酶酶原生質(zhì)體原生

50、質(zhì)體培養(yǎng)基培養(yǎng)基固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞工藝條件工藝條件控制控制68PH溫度溫度溶氧溶氧碳源碳源氮源氮源無機(jī)鹽無機(jī)鹽生長因素生長因素試管菌種培養(yǎng)茄瓶菌種培養(yǎng)搖瓶菌種培養(yǎng)孢子（菌體）懸液制備種子罐菌種培養(yǎng)發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵液預(yù)處理酶的分離純化精制酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程 69一、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)一、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞活化：保藏細(xì)胞在使用之前必須接種于新鮮的斜細(xì)胞活化：保藏細(xì)胞在使用之前必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以恢復(fù)細(xì)胞的面培養(yǎng)基上，在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以恢復(fù)細(xì)胞的生命活力，這就叫細(xì)胞的活化。生命活力，這就叫細(xì)胞的活化。 種子培養(yǎng)基：用于細(xì)胞擴(kuò)大

51、培養(yǎng)的培養(yǎng)基。氮源豐富碳源少溫度、pH、溶解氧接種量：1-10% 70二、培養(yǎng)基的配制二、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基：是指人工配制的用于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)基：是指人工配制的用于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。的各種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。 水碳源氮源無機(jī)鹽生長因素71碳是構(gòu)成細(xì)胞的主要元素之一，也是所有酶的重要組成元素。碳是構(gòu)成細(xì)胞的主要元素之一，也是所有酶的重要組成元素。 碳源可作能源，為生命活動(dòng)提供能量碳源可作能源，為生命活動(dòng)提供能量不同微生物對碳源的利用有所不同，在酶發(fā)酵生產(chǎn)中還要注意某些不同微生物對碳源的利用有所不同，在酶發(fā)酵生產(chǎn)中還要注意某些碳源對酶生物合成具有代謝調(diào)節(jié)作用（誘導(dǎo)和阻遏）碳源

52、對酶生物合成具有代謝調(diào)節(jié)作用（誘導(dǎo)和阻遏）常用碳源：糖類、醇類、脂類、有機(jī)酸、烴類、蛋白質(zhì)及其降解物常用碳源：糖類、醇類、脂類、有機(jī)酸、烴類、蛋白質(zhì)及其降解物水是微生物最基本的組成分（水是微生物最基本的組成分（）水是微生物體內(nèi)和體外的溶劑（吸收營養(yǎng)成分和代謝廢物）水是微生物體內(nèi)和體外的溶劑（吸收營養(yǎng)成分和代謝廢物）水是細(xì)胞質(zhì)組分，直接參與各種代謝活動(dòng)水是細(xì)胞質(zhì)組分，直接參與各種代謝活動(dòng)調(diào)節(jié)細(xì)胞溫度和保持環(huán)境溫度的穩(wěn)定（比熱高，傳熱快）調(diào)節(jié)細(xì)胞溫度和保持環(huán)境溫度的穩(wěn)定（比熱高，傳熱快）|水水|碳源碳源選擇合適碳源，以適應(yīng)目的酶的合成調(diào)節(jié)機(jī)制選擇合適碳源，以適應(yīng)目的酶的合成調(diào)節(jié)機(jī)制72構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)

53、和代謝產(chǎn)物中氮素（不能用作能源構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物中氮素（不能用作能源 ）氮源氮源有機(jī)氮源有機(jī)氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏蛋白胨、酵母膏、牛肉膏無機(jī)氮源無機(jī)氮源銨鹽、硝酸鹽銨鹽、硝酸鹽 參與酶的組成、構(gòu)成酶活性基、激活酶活性參與酶的組成、構(gòu)成酶活性基、激活酶活性維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓控制細(xì)胞的氧化還原電位控制細(xì)胞的氧化還原電位有時(shí)可作某些微生物生長的能源物質(zhì)有時(shí)可作某些微生物生長的能源物質(zhì) 常用：硫酸鹽、常用：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物磷酸鹽、氯化物以及含有鉀、鈉、以及含有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等元鈣、鎂、鐵等元素的化合物。素的化合物。 |氮源氮源|無機(jī)鹽

54、無機(jī)鹽需要注意合適的碳氮比需要注意合適的碳氮比73|生長因子生長因子生長因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物質(zhì)進(jìn)生長因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物質(zhì)進(jìn)行合成，而必須另外加入少量的生長需求的有機(jī)物質(zhì)。行合成，而必須另外加入少量的生長需求的有機(jī)物質(zhì)。 分類：分類：化學(xué)結(jié)構(gòu)分成維生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍化學(xué)結(jié)構(gòu)分成維生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和類脂成分生物和類脂成分 等四類等四類功能：以輔酶與輔基的形式參與代謝中的酶促反應(yīng)功能：以輔酶與輔基的形式參與代謝中的酶促反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作為各種生長因?qū)嶒?yàn)室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作為各種

55、生長因子的需要，麥芽汁、米曲汁等天然培養(yǎng)基中本身含有各種子的需要，麥芽汁、米曲汁等天然培養(yǎng)基中本身含有各種生長因子生長因子 74各種生物對營養(yǎng)的需求各種生物對營養(yǎng)的需求75n1 1、選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)、選擇適宜的營養(yǎng)物質(zhì)n2 2、營養(yǎng)物的濃度及配比合適、營養(yǎng)物的濃度及配比合適n3 3、物理、化學(xué)條件適宜、物理、化學(xué)條件適宜n4 4、經(jīng)濟(jì)節(jié)約、經(jīng)濟(jì)節(jié)約n5 5、精心設(shè)計(jì)、試驗(yàn)比較、精心設(shè)計(jì)、試驗(yàn)比較培養(yǎng)不同的微生物必須采用不同的培養(yǎng)條件；培養(yǎng)不同的微生物必須采用不同的培養(yǎng)條件；培養(yǎng)目的不同，原料的選擇和配比不同；培養(yǎng)目的不同，原料的選擇和配比不同；不同階段，培養(yǎng)條件也有所差異。不同階段，培養(yǎng)條件

56、也有所差異。培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)原則培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)原則76實(shí)驗(yàn)室的常用培養(yǎng)基：實(shí)驗(yàn)室的常用培養(yǎng)基：細(xì)菌：細(xì)菌： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡稱普通肉湯培養(yǎng)基）；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡稱普通肉湯培養(yǎng)基）；放線菌：高氏放線菌：高氏1 1號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基；酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基；霉菌：霉菌： 查氏合成培養(yǎng)基；查氏合成培養(yǎng)基；77三、三、pHpH調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)n不同的細(xì)胞，其生長繁殖的最適不同的細(xì)胞，其生長繁殖的最適pHpH值有所不同。一值有所不同。一般細(xì)菌和放線菌的生長最適般細(xì)菌和放線菌的生長最適pHpH值在中性或堿性范圍值在中性或堿性范圍（pH6.5pH6.58.08.0）；霉

57、菌和酵母的最適生長）；霉菌和酵母的最適生長pHpH值為偏值為偏酸性酸性(pH4(pH46)6)；植物細(xì)胞生長的最適；植物細(xì)胞生長的最適pHpH值為值為5 56 6。78n細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pHpH值與生長最適值與生長最適pHpH值往往有所不同。值往往有所不同。細(xì)胞生產(chǎn)某種酶的最適細(xì)胞生產(chǎn)某種酶的最適pHpH值通常接近于該酶催化反應(yīng)的值通常接近于該酶催化反應(yīng)的最適最適pHpH值。值。n有些細(xì)胞可以同時(shí)產(chǎn)生若干種酶，在生產(chǎn)過程中，通過有些細(xì)胞可以同時(shí)產(chǎn)生若干種酶，在生產(chǎn)過程中，通過控制培養(yǎng)基的控制培養(yǎng)基的pHpH值，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比值，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比

58、例。例。例如，采用米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)基的例如，采用米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)基的pHpH值為堿性時(shí)，主要生產(chǎn)堿性蛋白酶；培養(yǎng)基的值為堿性時(shí)，主要生產(chǎn)堿性蛋白酶；培養(yǎng)基的pHpH值為值為中性時(shí)，中性時(shí)， 主要生產(chǎn)中性蛋白酶；而在酸性的條件下，則主要生產(chǎn)中性蛋白酶；而在酸性的條件下，則以生產(chǎn)酸性蛋白酶為主。以生產(chǎn)酸性蛋白酶為主。79培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的pHpH值與培養(yǎng)基的組成成分以及發(fā)酵工藝條件密切相關(guān)。值與培養(yǎng)基的組成成分以及發(fā)酵工藝條件密切相關(guān)。n含糖量高的培養(yǎng)基，由于糖代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，會使含糖量高的培養(yǎng)基，由于糖代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，會使pHpH值向酸性值向酸性方向移動(dòng)；方向移動(dòng)；u含

59、蛋白質(zhì)、氨基酸較多的培養(yǎng)基，經(jīng)過代謝產(chǎn)生較多的胺類物含蛋白質(zhì)、氨基酸較多的培養(yǎng)基，經(jīng)過代謝產(chǎn)生較多的胺類物質(zhì)，使質(zhì)，使pHpH值向堿性方向移動(dòng)；值向堿性方向移動(dòng)；u以硫酸銨為氮源時(shí)，隨著銨離子被利用，培養(yǎng)基中積累的硫酸以硫酸銨為氮源時(shí)，隨著銨離子被利用，培養(yǎng)基中積累的硫酸根會使根會使pHpH值降低；值降低；u以尿素為氮源的，隨著尿素被水解生成氨，而使培養(yǎng)基的以尿素為氮源的，隨著尿素被水解生成氨，而使培養(yǎng)基的pHpH值值上升，然后又隨著氨被細(xì)胞同化而使上升，然后又隨著氨被細(xì)胞同化而使pHpH值下降；值下降；u磷酸鹽的存在，對培養(yǎng)基的磷酸鹽的存在，對培養(yǎng)基的pHpH值變化有一定的緩沖作用。值變化有

60、一定的緩沖作用。u在氧氣供應(yīng)不足時(shí)，由于代謝積累有機(jī)酸，可使培養(yǎng)基的在氧氣供應(yīng)不足時(shí)，由于代謝積累有機(jī)酸，可使培養(yǎng)基的pHpH值值向酸性方向移動(dòng)。向酸性方向移動(dòng)。80發(fā)酵過程中，發(fā)酵過程中，pHpH值控制和調(diào)節(jié)方法值控制和調(diào)節(jié)方法: :u調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH值的方法可以通過改變培養(yǎng)基的組分或其值的方法可以通過改變培養(yǎng)基的組分或其比例；比例；u也可以使用緩沖液來穩(wěn)定也可以使用緩沖液來穩(wěn)定pHpH值；值；u或者在必要時(shí)通過流加適宜的酸、堿溶液的方法，或者在必要時(shí)通過流加適宜的酸、堿溶液的方法，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pHpH值，以滿足細(xì)胞生長和產(chǎn)酶的要值，以滿足細(xì)胞生長和產(chǎn)酶的要求。求。81四、溫度的