第八章病原學(xué)診斷與防治

1、第一節(jié) 細(xì) 菌 學(xué) 診 斷細(xì)菌學(xué)診斷（bacteriological diagnosis）：檢測病原菌及其抗原、產(chǎn)物或核酸血清學(xué)診斷（serological diagnosis）:檢測患者血清中特異抗體 嚴(yán)格無菌操作，避免標(biāo)本被污染 根據(jù)不同疾病以及疾病的不同時期采集不同標(biāo)本根據(jù)不同疾病以及疾病的不同時期采集不同標(biāo)本 盡可能在疾病早期及使用抗菌藥物之前采集標(biāo)本 采集的標(biāo)本必須盡快送檢，多數(shù)菌可冷藏送運 標(biāo)本作好標(biāo)記，詳細(xì)填寫化驗單1、標(biāo)本（specimens）標(biāo)本采集與送檢過程中應(yīng)遵循的原則：一、病原菌檢測顯微鏡放大法：顯微鏡放大法： 普通光學(xué)顯微鏡 (LM) ：分辨率，0.25m 電子顯微鏡

2、：分辨率，1nm掃描電子顯微鏡（SEM）：透射電子顯微鏡（TEM）: 2、細(xì)菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查：對于形態(tài)與染色上具有特征的病原菌形態(tài)、排列和染色性掃描電子顯微鏡（SEM）：細(xì)胞或病毒表面特征 1000 10，000 透射電子顯微鏡（TEM）: 病毒或細(xì)胞的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)10,000 100,000普通光學(xué)顯微鏡 (LM) :草履蟲染色法：染色劑與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的結(jié)合染色法：染色劑與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的結(jié)合常用：堿性染色劑（有色的陽離子） 酸性染色劑（負(fù)染）單染色法鑒別染色法： 革蘭染色法；原理、步驟、意義 抗酸染色法鞭毛染色等特殊染色法3、分離和鑒定：根據(jù)不同疾病采取不同標(biāo)本如血、尿、糞便、 咽拭子以及腦脊液

3、等進(jìn)行細(xì)菌的分離和鑒定，是確診細(xì)菌性 感染最可靠的方法鑒定的主要內(nèi)容：1）培養(yǎng)特征：根據(jù)細(xì)菌所需營養(yǎng)、生長條件、菌落特征初步診斷2）形態(tài)特征：細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列、染色及特殊結(jié)構(gòu)3）生化反應(yīng)：細(xì)菌生化反應(yīng)的特點可作為鑒別細(xì)菌的依據(jù)4）血清學(xué)鑒定：已知抗體 未知細(xì)菌抗原，以確定細(xì)菌的種、型5）動物實驗：測定細(xì)菌的毒力，及分離病原菌6）藥物敏感試驗；溶血性鏈球菌血平板上的溶血溶血性鏈球菌血平板上的溶血IMViC試驗試驗吲哚試驗 + 甲基紅試驗 + VP試驗 +枸櫞酸鹽利用試驗 +大腸桿菌 產(chǎn)氣桿菌標(biāo)本采集標(biāo)本送檢初次涂片染色純培養(yǎng)后再次涂片染色細(xì)菌的分離培養(yǎng)挑選可疑菌落進(jìn)行生化，免疫學(xué)，分子生物

4、學(xué)檢測4、病原菌抗原的檢測常用于細(xì)菌學(xué)診斷的免疫學(xué)技術(shù)1）沉淀反應(yīng)2）協(xié)同凝集試驗3）免疫熒光法4）對流免疫電泳5）酶免疫測定6）免疫印跡技術(shù)5、其他檢測法：PCR技術(shù)檢測細(xì)菌核酸二、血清學(xué)診斷原理：原理：用已知抗原檢測患者血清或其他體液中未知抗體及其量的用已知抗原檢測患者血清或其他體液中未知抗體及其量的變化變化應(yīng)用：應(yīng)用：抗原性較強(qiáng)的致病菌和病程較長的傳染病診斷抗原性較強(qiáng)的致病菌和病程較長的傳染病診斷通常采取雙份血清，如果恢復(fù)期或通常采取雙份血清，如果恢復(fù)期或1周后血清抗體效價周后血清抗體效價比早期升高比早期升高4倍以上時，則可確認(rèn)為現(xiàn)癥感染倍以上時，則可確認(rèn)為現(xiàn)癥感染常用方法：常用方法：直

5、接凝集試驗（診斷傷寒、副傷寒的肥達(dá)試驗）直接凝集試驗（診斷傷寒、副傷寒的肥達(dá)試驗）中和試驗（診斷鏈球菌性風(fēng)濕病的抗中和試驗（診斷鏈球菌性風(fēng)濕病的抗O試驗）試驗）乳膠凝集試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗乳膠凝集試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗ELISA：技術(shù)簡便、特異、快速、靈敏，應(yīng)用廣泛第二節(jié)第二節(jié) 病毒學(xué)診斷病毒學(xué)診斷一、標(biāo)本的采取與送檢一、標(biāo)本的采取與送檢注意：注意： 1、對本身帶有雜菌或易受污染的標(biāo)本，要進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時，應(yīng)使用抗生素（青霉素，鏈霉素等） 2、標(biāo)本應(yīng)低溫保存并盡快送檢 3、血清學(xué)診斷標(biāo)本的采取應(yīng)在發(fā)病初期和病后23周各取1份血清，以便對比雙份血清抗體效價的動態(tài)變化二、病毒的分離與鑒定二、病毒的分離

6、與鑒定 以下情況需進(jìn)行病毒的分離與鑒定以下情況需進(jìn)行病毒的分離與鑒定 分離病毒對診治病人有指導(dǎo)性意義 發(fā)現(xiàn)新的病毒或?qū)σ驯幌麥绲牟《拘约膊?疑“死灰復(fù)燃”時 為鑒別臨床上具有相同癥狀的疾病，以明確 何種病毒感染 檢測所用的病毒活疫苗，及時發(fā)現(xiàn)回復(fù)毒力 的變異株（一）病毒的分離1、動物接種2、雞胚培養(yǎng)：目前主要用于分離流感病毒流感病毒初次分離接種于羊膜腔流感病毒的再培養(yǎng)接種于尿囊腔3、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 病毒分離鑒定中最常用的方法按細(xì)胞的生長方式分類：單層培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)按細(xì)胞的來源、染色體特征和傳代次數(shù)分類：原代細(xì)胞：來源于動物、雞胚或引產(chǎn)人胚組織細(xì)胞二倍體細(xì)胞：細(xì)胞在體外分裂50100代后仍

7、保持2倍染色體數(shù)目的單層細(xì)胞常用于人類病毒的分離或病毒疫苗的生產(chǎn)傳代細(xì)胞系：多由癌細(xì)胞或2倍體細(xì)胞突變而來，能在體外持續(xù)傳代病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指標(biāo)1. 細(xì)胞的變化細(xì)胞的變化 細(xì)胞病變效應(yīng)細(xì)胞病變效應(yīng) （CPE）：）：有些病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖時引起有些病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖時引起 的特有的細(xì)胞病變：細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落的特有的細(xì)胞病變：細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落多核巨細(xì)胞（融合細(xì)胞）形成多核巨細(xì)胞（融合細(xì)胞）形成：有些病毒如麻疹病毒、有些病毒如麻疹病毒、 巨細(xì)胞病毒等作用于細(xì)胞膜，使鄰近的細(xì)胞融合，形成多巨細(xì)胞病毒等作用于細(xì)胞膜，使鄰近的細(xì)胞融合，形成多 核巨細(xì)胞。核巨細(xì)胞。胞質(zhì)或核

8、內(nèi)包涵體（胞質(zhì)或核內(nèi)包涵體（inclusion body）的形成）的形成狂犬病病毒、巨細(xì)胞病毒狂犬病病毒、巨細(xì)胞病毒1、CPE 正常細(xì)胞病變細(xì)胞巨細(xì)胞病毒感染細(xì)胞形成的包涵體 貓頭鷹眼狀2. 紅細(xì)胞吸附（hemadsorption, HAd）流感病毒等感染細(xì)胞后，由于細(xì)胞膜上出現(xiàn)了血凝素（HA），具有吸附脊椎動物（豚鼠、雞、猴等）紅細(xì)胞的能力，這一現(xiàn)象稱為紅細(xì)胞吸附。常用來鑒定具有HA的黏病毒 或副黏病毒的增殖3.干擾現(xiàn)象（interference）：某些病毒感染細(xì)胞時不出現(xiàn)CPE或其他易于 測出的變化（如HAd），但能干擾其后感染的 另一病毒的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE4.細(xì)胞代謝的改

9、變： 病毒感染細(xì)胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的pH改變。培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖 的指標(biāo)（二）病毒的數(shù)量與感染性的測定：1、蝕斑測定法2、ID50 或 TCID5050%組織細(xì)胞感染量：病毒感染細(xì)胞后，引起 50% 發(fā)生死亡或病變的病毒量。病毒感染單層細(xì)胞后，產(chǎn)生的局限性病灶，稱蝕斑。每個蝕斑是由一個感染性病毒體復(fù)制，使細(xì)胞病變形成的，稱蝕斑形成單位（PFU）。通過計算PFU數(shù)量來得出感染性病毒體的數(shù)量（三）新分離病毒的鑒定：1. 病毒核酸類型的測定2. 理化性狀的檢測3. 形態(tài)學(xué)觀察4. 血清學(xué)鑒定5. 基因測序和生物對比三、病毒感染的血清學(xué)診斷三、病毒感染的血清學(xué)診斷原理：原理：用已知

10、病毒抗原來檢測病人血清中有無 相應(yīng)的抗體 中和試驗（中和試驗（NT testNT test） 補(bǔ)體結(jié)合試驗（補(bǔ)體結(jié)合試驗（CF testCF test） 血凝抑制試驗（血凝抑制試驗（HI testHI test） 凝膠免疫擴(kuò)散試驗?zāi)z免疫擴(kuò)散試驗中和試驗：病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗 患者血清中抗體的消長情況中和抗體：作用于病毒表面抗原的抗體中和試驗是用于人群免疫情況的調(diào)查，臨床診斷中不常用補(bǔ)體結(jié)合試驗：用已知病毒可溶性補(bǔ)體抗原來檢測病人血清中相應(yīng)的補(bǔ)體抗體。補(bǔ)體抗原：病毒的內(nèi)部抗原補(bǔ)體抗體的出現(xiàn)可作為近期感染的指標(biāo)血凝抑制試驗（HI, test）:具有HA的

11、病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細(xì)胞，程血凝現(xiàn)象。這種現(xiàn)象能被相應(yīng)抗體抑制，稱HI試驗四、病毒感染的快速診斷四、病毒感染的快速診斷（一）形態(tài)學(xué)檢查1、電鏡和免疫電鏡2、普通光學(xué)顯微鏡檢查 包涵體（二）病毒蛋白抗原檢查: EIA（三）特異性IgM抗體的檢測（四）檢測病毒核酸:1、核酸雜交技術(shù)2、核酸擴(kuò)增技術(shù)3、基因芯片技術(shù)主要是從含有病毒標(biāo)本及感染機(jī)體的血清中檢測病毒顆粒、蛋白抗原、 IgM抗體和核酸第四節(jié)第四節(jié) 特異性預(yù)防與治療特異性預(yù)防與治療三、細(xì)菌感染的治療第三節(jié)第三節(jié) 真菌學(xué)診斷真菌學(xué)診斷 細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素：多粘菌素按生物來源分類 真菌產(chǎn)生的抗生素：青霉素 放線菌產(chǎn)生的抗生素：鏈霉素 - -

12、內(nèi)酰胺類 大環(huán)內(nèi)酯類 氨基糖苷類按化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分類 四環(huán)類 氯霉素類 人工合成類 其他抗生素類 （一）抗菌藥物的種類（二）抗菌藥物的主要作用機(jī)制影響細(xì)胞壁的合成（青霉素）影響細(xì)胞膜的功能（多黏菌素）影響蛋白質(zhì)的合成（鏈霉素30S亞基, 氯霉素 50S亞基）影響核酸代謝（喹諾酮）影響細(xì)胞壁的合成 1、 細(xì)菌細(xì)胞膜上有6種青霉素結(jié)合蛋白（PBP），在肽聚 糖的合成中起重要作用 2、 青霉素（與 D 丙氨酸 結(jié)構(gòu)相似）能競爭性地結(jié)合其中 的轉(zhuǎn)肽酶，阻滯此酶的功能青霉素類的抗生素抑制肽聚糖的合成，對生長旺盛的細(xì)菌效果明顯四、病毒感染的治療四、病毒感染的治療五、真菌的治療五、真菌的治療顯微鏡放大法：顯

13、微鏡放大法： 普通光學(xué)顯微鏡 (LM) ：分辨率，0.25m 電子顯微鏡：分辨率，1nm掃描電子顯微鏡（SEM）：透射電子顯微鏡（TEM）: 2、細(xì)菌形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查：對于形態(tài)與染色上具有特征的病原菌形態(tài)、排列和染色性（一）病毒的分離1、動物接種2、雞胚培養(yǎng)：目前主要用于分離流感病毒流感病毒初次分離接種于羊膜腔流感病毒的再培養(yǎng)接種于尿囊腔3、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 病毒分離鑒定中最常用的方法按細(xì)胞的生長方式分類：單層培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)按細(xì)胞的來源、染色體特征和傳代次數(shù)分類：原代細(xì)胞：來源于動物、雞胚或引產(chǎn)人胚組織細(xì)胞二倍體細(xì)胞：細(xì)胞在體外分裂50100代后仍保持2倍染色體數(shù)目的單層細(xì)胞常用于人類病毒的分離或病毒疫苗的生產(chǎn)傳代細(xì)胞系：多由癌細(xì)胞或2倍體細(xì)胞突變而來，能在體外持續(xù)傳代3.干擾現(xiàn)象（interference）：某些病毒感染細(xì)胞時不出現(xiàn)CPE或其他易于 測出的變化（如HAd），但能干擾其后感染的 另一病毒的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE4.細(xì)胞代謝的改變： 病毒感染細(xì)胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的pH改變。培養(yǎng)環(huán)境的生化改變也可作為判斷病毒增殖 的指標(biāo)四、病毒感染的快速診斷四、病毒感染的快速診斷（一）形態(tài)學(xué)檢查1、電鏡和免疫電鏡2、普通光學(xué)顯微鏡檢查 包涵體（二）病毒蛋白