肝功能損傷實(shí)驗(yàn)-副本

1、肝功能損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)康膎 通過(guò)小鼠肝損傷模型的建立及肝損傷后血中轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定，熟悉賴氏比色法測(cè)定ALT的基本原理和ALT標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，熟悉肝損傷指標(biāo)變化的機(jī)制，了解賴氏比色法測(cè)定ALT的影響因素及其評(píng)價(jià)。(一一)肝損傷動(dòng)物模型建立肝損傷動(dòng)物模型建立 【原理】n向小鼠腹腔注射CCl4，導(dǎo)致小鼠肝臟損傷，當(dāng)肝細(xì)胞損傷后，細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶會(huì)外溢到血中，致血中相關(guān)酶活力顯著增高。同時(shí)設(shè)一對(duì)照組(小鼠腹腔注射食用油)以作比較。試劑n 1豆油。n 22CCl4溶液 以豆油為溶劑配制(VV)。 操作步驟 1動(dòng)物準(zhǔn)備 取小鼠若干只，體重約1520g只，室溫飼養(yǎng)，水、食物可自由攝取。n 2小鼠肝損傷模型的建立 腹腔注射

2、ccl4溶液02ml只，24h后取血。n 3對(duì)照小鼠模型的建立 腹腔注射豆油02ml只，24h后取血。n 4血樣品采集方法 以鑷子擠壓小鼠眼眶近顳部，小鼠眼球即突出，用鑷子夾住眼球向外摘出眼球，讓血滴入小塑料離心管，收集血量約1ml左右，等血凝結(jié)后，離心取血清。注意事項(xiàng)n1摘除小鼠眼球采血，應(yīng)讓血滴自然滴入離心管，盡量不要將小鼠頭在管口刮取，否則易致溶血。最好僅用一只眼球摘除放盡血，可減少血液損失。n 2離心時(shí)加速及減速不宜過(guò)快，離心速度為 3000r/min，10min 過(guò)快易致溶血。 (二二)肝損傷相關(guān)酶指標(biāo)測(cè)定肝損傷相關(guān)酶指標(biāo)測(cè)定1ALT測(cè)定(賴氏比色法)n【原理】L-丙氨酸+-酮戊二酸

3、 ALT 丙酮酸+L-谷氨酸丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼 堿性條件下 丙酮酸-2，4-二硝基苯腙(紅棕色，=505nm)n a-酮戊二酸也能與2，4-二硝基苯肼生成相應(yīng)的酮戊二酸一2，4-二硝基苯腙，但其在505nm等摩爾吸光度只有丙酮酸-2，4-二硝基苯腙的l3左右，根據(jù)此點(diǎn)可測(cè)出丙酮酸量。與丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成的系列標(biāo)準(zhǔn)液比較，求出樣品中ALT活性 。操作步驟n（1）ALT標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：n a. 按下表向各管加入相應(yīng)試劑nb. 混勻，放置10min，在波長(zhǎng)505nm處，以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度，各管吸光度均減“0”號(hào)管吸光度為該標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度值。n c. 以吸光度值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的酶卡

4、門(mén)活性單位為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)管代表的活性單位與吸光度值作圖，即成標(biāo)準(zhǔn)曲線。操作步驟n（2）標(biāo)本的測(cè)定n 在測(cè)定前取適量的底物溶液及中毒組和對(duì)照組血清，37水浴預(yù)溫5min后使用；具體操作按下表進(jìn)行。n混勻，室溫放置10min，在波長(zhǎng)505nm處以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度。結(jié)果計(jì)算n 測(cè)定管吸光度減去樣本對(duì)照管吸光度的差值為標(biāo)本的吸光度。該值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得ALT的卡門(mén)氏單位n 參考范圍525卡門(mén)單位。注意事項(xiàng)n底物緩沖液中的一酮戊二酸和顯色劑2，4硝基苯肼均為呈色物質(zhì)，吸樣必須很準(zhǔn)確。n每批試劑的空白管吸光度波動(dòng)范圍應(yīng)在0.24-0.32之間，如超出此范圍，應(yīng)檢查試劑及儀器等方面問(wèn)題。n嚴(yán)重脂

5、血、黃疸及溶血血清可增加測(cè)定的吸光度；糖尿病酮癥酸中毒病人血中因含有大量酮體，能和2，4一二硝基苯肼作用呈色，也會(huì)引起測(cè)定管吸光度增加。因此，檢測(cè)此類(lèi)標(biāo)本時(shí)，應(yīng)作血清標(biāo)本對(duì)照管。注意事項(xiàng)n賴氏法考慮到底物濃度不足，酶作用產(chǎn)生的丙酮酸的量不能與酶活性成正比，故沒(méi)有制定自身的單位定義，而是以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)套用速率法的卡門(mén)單位。賴氏法標(biāo)準(zhǔn)曲線所定的單位是用比色法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和卡門(mén)分光光度法實(shí)驗(yàn)結(jié)果作對(duì)比后求得的，以卡門(mén)單位報(bào)告結(jié)果，卡門(mén)法是早期的酶耦聯(lián)速率測(cè)定法，卡門(mén)單位是分光光度單位。定義為血清1ml，反應(yīng)液總體積3ml，反應(yīng)溫度25，波長(zhǎng)340nm，比色杯光徑1.0cm，每分鐘吸光度下降0.001A為一

6、個(gè)卡門(mén)單位（相當(dāng)于0.48IU），賴氏比色法測(cè)定由于受底物一酮戊二酸濃度的不足以及反應(yīng)產(chǎn)物丙酮酸的反饋抑制等因素影響，標(biāo)準(zhǔn)曲線不能延長(zhǎng)至200卡門(mén)單位。當(dāng)血清標(biāo)本酶活力超過(guò)150卡門(mén)單位時(shí)，應(yīng)將血清用生理鹽水稀釋后重測(cè)。其結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。注意事項(xiàng)n加入2，4-二硝基苯肼溶液后，應(yīng)充分混勻，使反應(yīng)完全，加入NaOH溶液的方法和速度要一致，如液體混合不完全或NaOH溶液的加入速度不同均會(huì)導(dǎo)致吸光度讀數(shù)的差異，呈色的深淺與NaOH的濃度也有關(guān)系，NaOH濃度越大呈色越深，NaOH溶液小于0.25mol/L時(shí)，吸光度下降變陡，因此NaOH濃度要準(zhǔn)確。方法學(xué)評(píng)價(jià)方法學(xué)評(píng)價(jià)重復(fù)性差 其原因有三：由于-酮

7、戊二酸也能與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成相應(yīng)的-酮戊二酸苯腙因而限制其用量，如一般采用2.0mmolL的濃度，反應(yīng)速度只有最大反應(yīng)速度的65，使產(chǎn)物生成量與酶的活性之間不能呈現(xiàn)良好的線形關(guān)系2，4一二硝基苯肼在堿性條件下也能顯色，為了降低試劑空白的吸光度而不得不使用低濃度的2，4-二硝基苯肼(1.0mmolL)。此種水平的2，4-二硝基苯肼僅能與反應(yīng)體系中的兩種酮酸的一半反應(yīng)。酶促反應(yīng)中2，4-二硝基苯肼與這兩種酮酸的結(jié)合顯色度不易控制，低濃度的2，4-二硝基苯肼使標(biāo)準(zhǔn)曲線彎曲呈非線形也影響測(cè)定結(jié)果。方法學(xué)評(píng)價(jià)方法學(xué)評(píng)價(jià)產(chǎn)物旁路效應(yīng)，即ALT催化生成的產(chǎn)物丙酮酸，被乳酸脫氫酶催化而消耗，從而影響測(cè)定結(jié)果。這種現(xiàn)象稱為產(chǎn)物旁路效應(yīng)。n(2)準(zhǔn)確性差 由于線性范圍只有97卡門(mén)單位(臨床上繪制到150卡門(mén)單位)，但臨床病人標(biāo)本在200卡門(mén)單位以上較多見(jiàn)。盡管采用標(biāo)本稀釋后再測(cè)定，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，但偏差較大。影響實(shí)驗(yàn)條件的因素多，而且不易控制，系統(tǒng)誤差大方法學(xué)評(píng)價(jià)方法學(xué)評(píng)價(jià)n(3)試劑穩(wěn)定性差 底物緩沖液不易保存(易長(zhǎng)菌)，易失效。故保存期短，影響試劑的批間結(jié)果的一致性。n(4)賴氏法是比色法中比較合理的方法?？梢岳斫鉃?/p>